張 晶，張怡一，徐斐然，石嘉懌，鞠興榮，王立峰*（南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇高校糧油質量安全控制及深加工重點實驗室，江蘇 南京 210023）

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菜籽多肽體外和細胞內抗氧化性評價及氨基酸分析

張 晶，張怡一，徐斐然，石嘉懌，鞠興榮，王立峰*
（南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇高校糧油質量安全控制及深加工重點實驗室，江蘇 南京 210023）

摘 要：本研究以Alcalase 2.4L酶解“雙低”油菜籽寧雜19號得到的菜籽蛋白酶解物（rapeseed protein hydrolysate，RPH）為原料。通過超濾和凝膠色譜分離其活性肽組分，對酶解液及各分離組分進行抗氧化活性研究，并對抗氧化能力最高的組分進行氨基酸分析。結果表明：通過超濾將RPH分離成4 組不同分子質量范圍的多肽組分，其中RPH-P4（分子質量＜3 kD）具有最高的抗氧化活性；RPH-P4經Sephadex G-15凝膠柱分離后得到3 個洗脫峰，收集并測定其活性，研究發(fā)現(xiàn)RPH-P4-S3抗氧化能力遠高于其他2 個組分（P＜0.05），氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）、細胞抗氧化活性（cellular antioxidant activity，CAA）、細胞內CAA實驗的EC50值分別為（1 951.90±20.35） μmol TE/g、（143.38±4.11） μmol QE/g、（45.63±3.67） μg/mL；對RPH-P4-S3進行了氨基酸分析，發(fā)現(xiàn)其抗氧化性氨基酸含量達到72.90%，必需氨基酸含量為53.52%。研究認為，菜籽蛋白Alcalase 2.4L酶解物分離組分RPH-P4-S3具有較高的抗氧化活性及營養(yǎng)價值，可以作為功能性成分用于抗氧化相關的功能食品和保健品的開發(fā)。

關鍵詞：菜籽多肽；抗氧化能力指數；細胞抗氧化能力；氨基酸分析

引文格式：

張晶， 張怡一， 徐斐然， 等.菜籽多肽體外和細胞內抗氧化性評價及氨基酸分析［J］.食品科學， 2016， 37（13）: 36-41.

ZHANG Jing， ZHANG Yiyi， XU Feiran， et al.Antioxidant activities in vitro and in cells and amino acid composition of rapeseed peptides［J］.Food Science， 2016， 37（13）: 36-41.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613007. http://www.spkx.net.cn

生物體在有氧呼吸過程中會產生多種自由基，主要有超氧自由基（O·）、羥自由基（·OH）、過氧化氫（H2O2）和單氧離子（O）等［1］。Harman的自由基理論表明，細胞中過量的自由基累積會破壞蛋白質結構，使DNA變異，同時促使細胞膜脂質氧化，最終導致組織器官的老化［2］。研究發(fā)現(xiàn)，自由基造成的氧化損傷與冠心病、衰老、腫瘤等許多疾病有關［3-5］，而體內過多的自由基則可以通過補充外源性的具有抗氧化活性的物質來清除，從而減少自由基對人體的氧化損傷，延緩人體的衰老［6］；此外，自由基造成的氧化反應會降低食品品質，影響食品的風味和組織性狀，破壞食品營養(yǎng)和食品體系的穩(wěn)定性?？寡趸瘎┑姆N類很多，然而人工合成的抗氧化劑如二丁基羥基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）、丁基羥基茴香醚（butyl hydroxy anisd，BHA）、沒食子酸丙酯（propyl gallate，PG）等具有許多潛在的危害，可能會對人體產生不良的影響，因此在食品中添加此類抗氧化劑需要嚴格的監(jiān)管。與此相反的是，天然抗氧化劑來源于食物，成分安全，更容易被消費者接受［7］。大量研究表明，許多動物或植物蛋白水解物（多肽）具有清除自由基和抑制脂質過氧化的能力，如Bougatef等［8］從沙丁魚下腳料酶解物中分離得到的抗氧化肽，經測定具有較高的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率。He Rong等［9］研究顯示Alcalase 2.4L蛋白酶和K蛋白酶酶解菜籽蛋白得到的產物具有良好的抗氧化效果。由此可知，由蛋白酶解制備得到的抗氧化肽可以作為一種新型的功能性食品添加劑、食品及化妝品中的防腐劑等，具有良好的開發(fā)應用前景。

油菜是世界第二大油料作物，僅次于大豆，而我國的油菜種植面積及產量均居世界第一位，是世界上最大的油菜生產國［10］。油菜籽去油后得到的菜籽粕中含有35%～50%的蛋白［11］。菜籽蛋白幾乎不存在限制性氨基酸，營養(yǎng)價值高，且賴氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸含量較高，是一種全價優(yōu)質的植物蛋白［12-13］。Wolfe等［14］在2007年首次提出了建立細胞模型評價物質的抗氧活性的方法——細胞抗氧化活性（cellular antioxidant activity，CAA），該方法成本低，效率高，能更準確地反映抗氧化劑的吸收代謝等變化情況。本實驗采用超濾、Sephadex G-15對菜籽粗肽（rapeseed protein hydrolysate， RPH）進行分離純化，并研究了不同分離組分的氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）及體內CAA，篩選出抗氧化性較高的組分，并對其進行氨基酸分析，確定組分中氨基酸組成，為后續(xù)菜籽抗氧化肽的機理及結構提供了一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菜籽粉，油菜籽脫殼、脫油并粉碎過篩。

Sephadex G-15凝膠填料 美國GE公司；熒光物質FL（fluorescein sodium salt）、自由基產生劑2，2'-偶氮（2-甲基丙基脒）（2，2'-azobis-2-amidinopropanedihydrochloride，AAPH）、抗氧化標準物質水溶性VE（6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 美國Sigma公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） 美國Gibco公司；四甲基偶氮唑藍（3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT）、Hank's平衡鹽溶液（Hank's balanced salt solution，HBSS）、雙抗（青霉素10 000 μg/mL，鏈霉素10 000 μg/mL）、DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶消化液（0.25%） 北京Solarbio科技有限公司；HepG2人體肝癌細胞 上海細胞庫；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Beckman Coulter J6冷凍離心機 美國Beckman Coulter公司；FreeZone 2.5L臺式冷凍干燥機 美國Labconco公司；Millipore Pellicon XL小型超濾裝置美國Merck Millipore公司；SpectraMax M2e酶標儀美國Molecular Devices公司；HL-2B恒流泵、HD-3紫外檢測儀、BSZ-100自動收集器 上海滬西分析儀器廠；3057-II型便攜式記錄儀 重慶川儀速達機電有限公司；HERACELL 150i二氧化碳培養(yǎng)箱、MSC-Advantage-1.2生物安全柜 美國Thermo Scientifc公司；L-8900型氨基酸分析儀 日本Hittachi公司。

1.3 方法

1.3.1 菜籽粗肽的制備

參照文獻［15］的制備方法并進行了一定的修改。將菜籽粉溶解于去離子水中（料液比1∶20，m/V），并調節(jié)pH值至11.0，室溫攪拌1 h后5 000×g離心20 min。收集上清液，并調pH值為4.5，靜置1 h，5 000×g離心20 min，收集沉淀并用無水乙醇洗滌2～3 次。將沉淀重新溶解于去離子水中，調pH值為7.0，冷凍干燥即得菜籽蛋白。將菜籽蛋白溶解于去離子水中，調節(jié)溶液的pH值為9.0，溫度為50 ℃，然后加入Alcalase 2.4L堿性蛋白酶（2∶100，［E］/［S］）酶解5 h。酶解過程中需維持pH值不變，反應結束后95 ℃水浴滅酶10 min，10 000×g離心30 min，收集上清液，冷凍干燥即為RPH。

1.3.2 抗氧化能力指數ORAC分析

采用經修改的抗氧化能力指數ORAC的方法測定各分離組分的抗氧化能力［16-17］。首先將各分離組分用75 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）進行稀釋，反應在96 孔板中進行，每個孔中含有20 μL 0.02 mg/mL樣品溶液或20 μL一定質量濃度梯度的Trolox標準品，再加入200 μL的Fluorescein（0.96 μmol/L），在37 ℃條件下溫育20 min，然后在每個孔中加入20 μL偶氮類化合物AAPH（119 mmol/L），設定酶標儀的激發(fā)波長為485 nm，釋放波長為520 nm，每5 min測定一次。ORAC值以每克樣品等同于Trolox當量（Trolox equivalent，TE）的微摩爾數表示，單位為μmol TE/g。

1.3.3 HepG2細胞毒性實驗

采用經修改的MTT方法測定細胞毒性［18］。首先取對數生長期細胞計數并配制成105個/mL的細胞懸液。加入100 μL細胞懸液到96 孔板各內孔中，外孔各加入100 μL PBS，放置于CO2細胞培養(yǎng)箱中37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。吸棄舊培養(yǎng)液，在每個細胞培養(yǎng)孔中加入100 μL不同溶度樣品并設置復孔。培養(yǎng)24 h后，每孔中加入質量濃度為5 mg/mL的MTT，培養(yǎng)4 h。吸棄舊培養(yǎng)液，每孔加入150 μL的DMSO，37 ℃恒溫振蕩30 min。置于酶標儀中570 nm波長處測定OD值。對照組以相同體積的細胞培養(yǎng)液代替樣品溶液。細胞存活率計算見下式。

式中：OD0為空白組光密度值；OD1為實驗組光密度值；OD2為對照組光密度值。

1.3.4 細胞內CAA實驗

采用CAA方法測定細胞內抗氧化活性，參照文獻［19］并進行了一定的修改。取對數生長期的HepG2細胞接種于96 孔板中，接種密度104個/孔，細胞懸液加入量為100 μL，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。吸棄舊培養(yǎng)液，用PBS清洗一次，加入100 μL樣品溶液（含25 μmol/L 的2'，7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽（2'，7'-dichlorodihydrofluore scein diacetate，DCFH-DA）），培養(yǎng)1 h。吸棄舊培養(yǎng)液后，每孔加入100 μL AAPH溶液（濃度為600 μmol/L），迅速放置于酶標儀中讀數，激發(fā)波長538 nm，發(fā)射波長485 nm，每5 min測定一次。CAA計算公式如下：

式中：∫SA為樣品的曲線下積分面積；∫CA為對照組的曲線下積分面積。樣品的半數有效濃度（EC50）以lg（?a/?u）對lgρ的中效原理來計算，這里?a表示樣品作用效應（CAA unit），?u表示1－CAA unit，ρ為RPH的質量濃度/（mg/L）。EC50值以3 次平行實驗計算得出，將EC50值轉化為CAA值，以每克樣品中相當于槲皮素的微摩爾當量（quercetin equivalent，QE）來表示，單位為μmol QE/g。

1.3.5 抗氧化肽的氨基酸組成分析

稱取等量的樣品分別加到2 支玻璃水解管中，加入6 mol/L的HCl溶液，在減壓狀態(tài)下使用酒精噴燈迅速封管，在110 ℃條件下水解24 h。反應結束后打開水解管，待水解液冷卻后過濾濃縮并用0.02 mol/L的鹽酸溶液溶解，然后用去離子水定容至50 mL。收集上清液過0.22 μm濾器，然后采用氨基酸分析儀進行分析。

1.3.6 菜籽抗氧化肽的超濾分離

取實驗制得的菜籽蛋白酶解物用雙蒸水配制成1 mg/mL的溶液，并依次通過截留分子質量為10、5、3 kD的超濾膜，超濾過程控制壓力在0.10～0.22 MPa之間，分別收集＜3、3～5、5～10、＞10 kD各個分子質量段的透過液和酶解液，真空濃縮、冷凍干燥，稱量不同分子質量肽段凍干粉的質量，并進一步分析各個分子質量段的菜籽粗品的抗氧化活性，篩選抗氧化活性最強的超濾膜分離組分。

式中：m1為菜籽蛋白酶解物質量/mg；m0為原料蛋白質量/mg。

式中：m1為膜分離組分質量/mg；m0為RPH質量/mg。

1.3.7 凝膠過濾層析

用雙蒸水將1.3.6節(jié)篩選出來的抗氧化活性最強的菜籽肽組分配成10 mg/mL的溶液，經0.22 μm微孔膜過濾后經過由恒流泵、層析柱、紫外檢測器和自動部分收集器所組成的凝膠過濾分離層析系統(tǒng)，層析柱采用Sephadex G-15（1.6 cm×70 cm）。用去離子水（pH 7.0）為流動相洗脫樣品，流速為60 mL/h，檢測波長為280 nm，洗脫液自動部分收集，合并同一分離峰的洗脫液，真空濃縮并冷凍干燥后檢測其抗氧化活性，選擇抗氧化活性最強的組分進行液相色譜分離。

1.4 統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 菜籽抗氧化肽的超濾膜分析

2.1.1 超濾膜分離組分得率

RPH是由Alcalase 2.4L酶解菜籽蛋白5 h的產物，采用超濾分離技術將RPH分離得到4 個不同分子質量的菜籽肽組分。由表1可知，菜籽粗肽的得率達到73.41%，這說明堿性蛋白酶Alcalase 2.4L將大部分菜籽蛋白酶解成可通過離心來回收的菜籽多肽；同時，分子質量＜3 kD （RPH-P4）的菜籽多肽約占總酶解物的46.32%，此結果與Girgih等［20］的研究相似，他們發(fā)現(xiàn)亞麻籽肽經超濾膜分離后，其中＜3 kD的組分得率是其他各組分得率的3 倍。將不同超濾分離的肽段冷凍干燥保存，采用抗氧化能力指數ORAC和細胞抗氧化能力CAA的方法分別測定其體內及體外的抗氧化活性。

表1 RPH及其超濾膜分離組分得率Table 1 Yieldsof rapeseedpeptidefractions obtained fromultrafiltration組分 RPH ＞10 kD 5～10 kD 3～5 kD ＜3 kD得率/% 73.41 17.31 12.37 10.64 46.32

2.1.2 超濾膜組分的體外及體內抗氧化活性分析

如圖1所示，不同超濾分離組分表現(xiàn)出不同的抗氧化活性，且差異性較大，其中＜3 kD（RPH-P4）的ORAC值最高，為（1 547.89±34.57） μmol TE/g，其體外抗氧化性顯著高于其他組分（P＜0.05）。與其他相關研究相比，Alcalase 2.4L蛋白酶酶解菜籽蛋白得到的菜籽蛋白酶解物具有較高的氧自由基吸附能力。例如，郭洋［21］將蛋清蛋白酶解液超濾后測得＜1 kD的組分具有最高的抗氧化活性，其ORAC為（674.76±15.54） μmol TE/g，而秋刀魚蛋白酶解物的ORAC為883.40 TE/g［22］。

細胞毒性實驗結果如圖2所示，RPH及膜分離各組分中400 mg/L的質量濃度組顯著抑制了HepG2細胞的增殖，組分RPH-P1和RPH細胞存活率在85%左右，其他組分細胞存活率為80%左右；當質量濃度為200 mg/L時，RPH-P2具有一定的細胞毒性。25～200 mg/L質量濃度范圍內，除RPH-P2組分外，其他各組細胞存活率均達到90%以上，表明樣品無明顯的細胞毒性。因此，將上述實驗質量濃度作為后續(xù)實驗依據。

本實驗細胞抗氧化能力的測定中不使用PBS清洗，即樣品處理細胞后，不使用PBS清洗細胞孔，直接加入AAPH進行檢測。如圖3所示，菜籽蛋白酶解物及其膜分離組分細胞抗氧化能力CAA值及EC50值差異顯著（P＜0.05），其中＜3 kD（RPH-P4）CAA值最高為（116.94±2.57） μmol QE/g，其EC50為（63.52±5.32） μg/mL。

2.2 菜籽抗氧化肽的凝膠色譜分析

2.2.1 Sephadex G-15凝膠色譜分離

如圖4所示，采用Sephadex G-15凝膠柱層析分離膜分離所得抗氧化活性最高RPH-P4的菜籽肽組分，洗脫流速為60 mL/h，檢測波長為280 nm，按照洗脫時間和紫外檢測的OD280 nm值作圖，可以得到3 個洗脫峰。分別收集所得到的RPH-P4-S1、RPH-P4-S2、RPH-P4-S3這3 個主要的峰。將各段的洗脫液收集、凍干后，配制成0.02 mg/mL的多肽溶液，通過體外和體內細胞體系測定其抗氧化能力，并對活性最高組分進行氨基酸分析。

2.2.2 凝膠色譜分離組分的體外及體內抗氧化活性分析

由圖5可知，通過Sephadex G-15凝膠層析分離收集的各組分中，RPH-P4-S3抗氧化能力指數ORAC值為（1 951.90±20.35） μmol TE/g，顯著高于其他兩個組分（P＜0.05）。王立峰等［23］通過Sephacryl S-100 HR凝膠柱層析分離菜籽蛋白酶解物，得到的組分3 ORAC值最高，達到（1 610.38±112.51） μmol TE/g。這說明本實驗所得RPH-P4-S3具有較高的抗氧化活性。細胞毒性實驗結果如圖6所示，在25～400 mg/L質量濃度范圍內，各組分的細胞存活率均達到90%以上，說明在此劑量范圍內，菜籽蛋白酶解物本身對細胞基本毒性作用。在上述劑量范圍內進行體內細胞抗氧化實驗，結果如圖7所示，RPH-P4-S3組分的CAA值為（143.38±4.11） μmol QE/g，EC50為（45.63±3.67） μg/mL。由此可以看出，菜籽蛋白酶解物具有較高的抗氧化活性。

2.2.3 氨基酸分析

通過ORAC和CAA實驗結果可知，RPH-P4-S3具有最高的抗氧化活性，對其進行氨基酸分析。研究發(fā)現(xiàn)許多氨基酸及其衍生物具有抗氧化能力，例如Je等［24］通過研究牛蛙肉蛋白抗氧化肽發(fā)現(xiàn)酸性氨基酸（Asp和Glu）和堿性氨基酸（His、Arg、Lys）具有螯合金屬離子的能力，含疏水性氨基酸（Tyr、Val、Phe、Ile、Leu和Pro）的肽鏈具有抑制脂質過氧化的能力等［25］。從表2可以看出，RPH-P4-S3中酸性氨基酸、堿性氨基酸、疏水性氨基酸的含量分別占總氨基酸含量的15.70%、22.90%、34.30%。這3 類抗氧化性氨基酸占總氨基酸含量的72.90%，由此可以推斷該組分具有較強的抗氧化活性。此外，RPH-P4-S3中必需氨基酸含量占總氨基酸含量的53.52%，這說明該組分還具有較高的營養(yǎng)價值。

表 2 組分RPH-P4-S3的氨基酸分析Table 2 Aminoacid compositionof fractionRPH-P4-S3氨基酸種類 含量/（g/100 g） 氨基酸種類 含量/（g/100 g）蘇氨酸（Thr） 0.831 谷氨酸（Glu） 4.166纈氨酸（Val） 1.458 甘氨酸（Gly） 6.083蛋氨酸（Met） 1.837 丙氨酸（Ala） 0.896亮氨酸（Leu） 2.238 半胱氨酸（Cys） 0.944異亮氨酸（Ile） 3.926 酪氨酸（Tyr） 1.474苯丙氨酸（Phe） 1.286 脯氨酸（Pro） 1.327賴氨酸（Lys） 0.303 必需氨基酸含量/% 53.52組氨酸（His） 3.751 酸性氨基酸含量/% 15.70精氨酸（Arg） 4.622 堿性氨基酸含量/% 22.90天冬氨酸（Asp） 1.793 疏水性氨基酸含量/% 34.30絲氨酸（Ser） 0.901

3 結 論

本實驗了超濾及葡聚糖凝膠柱分離各組分的抗氧化能力，利用體外抗氧化能力指數（ORAC）和細胞內抗氧化能力（CAA）評價并篩選出抗氧化能力最高的組分。結果表明：通過超濾獲得了較高抗氧化活性肽段RPH-P4（分子質量＜3 kD）。組分RPH-P4利用Sephadex G-15凝膠層析進一步的分離純化，最終得到強活性組分RPH-P4-S3，其ORAC值為（1 951.90±20.35） μmol TE/g，CAA值為（143.38±4.11） μmol QE/g，EC50為（45.63±3.67） μg/mL。由氨基酸分析可知RPH-P4-S3的抗氧化活性與其氨基酸組成有關，同時還具有較高的營養(yǎng)價值。因此，RPH-P4-S3可作為一種天然抗氧化劑應用于食品加工中，同時還可以作為功能性食品添加劑。

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國家農業(yè)成果轉化計劃項目（2014GB2C100318）；江蘇省產學研前瞻性聯(lián)合研究項目（BY2016009-01）；

江蘇省高校自然科學基金項目（14KJB550004）；江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目；

南京財經大學研究生科技創(chuàng)新計劃資助項目

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613007 10.7506/spkx1002-6630-201613007. http://www.spkx.net.cn

中圖分類號：TS201.4

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）13-0036-06

收稿日期：2015-09-12

基金項目：國家重點研發(fā)計劃項目（2016YFD0401401）；國家高技術研究發(fā)展計劃（863計劃）項目（2013AA102207）；

作者簡介：張晶（1990—），女，碩士研究生，研究方向為食品營養(yǎng)。E-mail：zj1032776604@163.com

*通信作者：王立峰（1977—），男，副教授，博士，研究方向為活性蛋白肽及植物多酚的開發(fā)。E-mail：wanglifeng_8@163.com

Antioxidant Activities in Vitro and in Cells and Amino Acid Composition of Rapeseed Peptides

ZHANG Jing， ZHANG Yiyi， XU Feiran， SHI Jiayi， JU Xingrong， WANG Lifeng*
（Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety， Key Laboratory of Grains and Oils Quality Control and Processing， College of Food Science and Engineering， Nanjing University of Finance and Economics， Nanjing 210023， China）

Abstract:The rapeseed protein hydrolysate （RPH） obtained by enzymatic hydrolysis of double-zero rapeseed with Alcalase 2.4L was separated by ultrafiltration and gel filtration chromatography to produce active peptide fractions.The antioxidant activity of RPH and its active peptides was evaluated in vitro.Furthermore， the amino acid composition of the most potent antioxidant fraction was analyzed.The results showed that RPH was separated into 4 fractions in different molecular weight ranges.RPH-P4 （molecular weight < 3 kD） had the strongest antioxidant capacity among these peptide fractions.RPH-P4 was further separated by gel filtration on Sephadex G-15 into 3 peaks.The antioxidant capacity of RPH-P4-S3 was far higher than that of 2 other peaks （P < 0.05）.Its oxygen radical absorbance capacity （ORAC） value was （1 951.90 ± 20.35） μmol TE/g sample， cellular antioxidant activity （CAA） value （143.38 ± 4.11） μmol QE/g sample， and EC50value （45.63 ± 3.67） μg/mL.The content of antioxidant amino acids in RPH-P4-S3 was as high as 72.90%， and the essential amino acid content was 53.52%.This research suggests that RPH-P4-S3， produced by enzymatic hydrolysis of double-zero rapeseed with Alcalase 2.4L， has high antioxidant activity and nutritional value and thus can be applied in the development of antioxidant-related functional foods and healthcare products as a functional ingredient.

Key words:rapeseed peptides； oxygen radical absorbance capacity； cellular antioxidant activity； amino acid analysis