肖水平，王坤波，柯興盛，楊 磊，劉新穩(wěn)，孫亮慶，楊紹群，陳 宜*

(1.江西省棉花研究所/國家棉花產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系鄱陽湖綜合試驗站，江西 九江 332105;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 棉花研究所/棉花生物學(xué)國家重點實驗室，河南 安陽 455000)

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海島棉基于雙色FISH的核型分析

肖水平1，2，王坤波2，柯興盛1，楊 磊1，劉新穩(wěn)1，孫亮慶1，楊紹群1，陳 宜1*

(1.江西省棉花研究所/國家棉花產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系鄱陽湖綜合試驗站，江西 九江 332105;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 棉花研究所/棉花生物學(xué)國家重點實驗室，河南 安陽 455000)

摘要：以45S rDNA作探針對海島棉體細(xì)胞中期染色體進(jìn)行熒光原位雜交(Fluorescence in situ Hybridization，F(xiàn)ISH)，檢測出6個強(qiáng)的熒光信號(4大2小)，結(jié)合DAPI圖像觀察發(fā)現(xiàn)信號分布在各自染色體隨體位置，稱為NOR(Nucleolar Organizer Region)信號。以二倍體A基因組棉種亞洲棉基因組DNA(gDNA)為探針對海島棉進(jìn)行FISH，結(jié)果發(fā)現(xiàn)52條染色體中有無雜交信號的各占一半，熒光信號分布在較長的A亞組染色體上，直接區(qū)分開海島棉A、D亞組染色體，直觀證實了海島棉的異源雙二倍體起源。以45S rDNA和A組棉種亞洲棉gDNA作探針對海島棉進(jìn)行雙色FISH時，結(jié)果發(fā)現(xiàn)海島棉染色體上既檢測到了6個強(qiáng)的NOR信號又檢測出了gDNA雜交信號，且清楚觀察到2個NOR信號分布在A亞組上，另4個在D亞組上。基于該雙色FISH圖像的核型分析表明，海島棉的核型公式為：2n=4x=52=40m(2 SAT)+12sm(4 SAT)，屬于2A類型，且有3對隨體，其中1對定位于A9號染色體，屬于中部著絲點(m)類型；另2對分別定位于D8和D12號染色體上，屬于近中部著絲點(sm)類型；且發(fā)現(xiàn)海島棉A亞組染色體的相對長度的并非全部大于D亞組，兩亞組染色體間在長度上存在交叉，說明基于FISH的核型分析比傳統(tǒng)方法更為準(zhǔn)確。

關(guān)鍵詞：海島棉；45S rDNA；gDNA；FISH；核型分析

目前，棉屬(GossypiumL.)已經(jīng)定名的種(亞種)共51個[1]，其中二倍體棉種(2n=2x=26)46個，包括A～G及K共8個基因組；另外四倍體(2n=4x=52)棉種5個，包括2個栽培棉種，3個野生棉種，其中海島棉是目前世界上大面積種植的主要栽培種之一。研究表明，海島棉染色體由異源雙二倍體組成[2-3]，用(AD)2表示。二倍體A和D基因組則分別是四倍體棉種A和D亞組的供體種[4-5]。

Beasley[6]和Phillips[7]在關(guān)于棉種的細(xì)胞學(xué)研究中，發(fā)現(xiàn)A組棉種的染色體大于D組棉種。Kadir等[8]通過棉種的基因組DNA(genomic DNA，簡稱gDNA)含量比較，也證實了A組棉種gDNA明顯大于D組棉種。這為后來關(guān)于四倍體棉種核型分析中對確定A、D亞組染色體順序編號提供了依據(jù)[9-10]。但王坤波等[11]在對陸地棉的核型分析中，發(fā)現(xiàn)僅僅依據(jù)核型圖像中染色體的長短順序確定四倍體棉種的A、D亞組未免有失偏頗，并提出了原位雜交(in situ hybridization)技術(shù)對四倍體棉A、D亞組的確定可能更為理想。

熒光原位雜交技術(shù)(Fluorescence in situ hybridization，簡稱FISH)于20世紀(jì)80年代中期開始應(yīng)用于植物的研究當(dāng)中，至今已經(jīng)發(fā)展了近30年，在植物染色體識別、細(xì)胞遺傳圖譜構(gòu)建、重復(fù)序列定位、物種起源與進(jìn)化及基因組間親緣關(guān)系等方面應(yīng)用廣泛[12-17]。

FISH技術(shù)在棉花上的應(yīng)用遠(yuǎn)落后于其他作物，主要原因在于棉花在染色體制片過程中，其細(xì)胞質(zhì)濃厚，細(xì)胞壁較堅硬，酶解細(xì)胞比較困難，再加上棉花染色體數(shù)目較多、且形態(tài)小。

本研究以45S rDNA和二倍體A基因組gDNA為探針對靶材料海島棉根尖體細(xì)胞有絲分裂中期染色體進(jìn)行FISH分析，旨在利用FISH技術(shù)對海島棉染色體進(jìn)行核型分析，為海島棉遺傳物理圖譜的構(gòu)建及亞組染色體的鑒定與識別提供更為準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

用作探針的DNA為二倍體A基因組棉種亞洲棉“石系亞1號”，取自于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所海南三亞野生棉種質(zhì)圃；用作探針的45S rDNA是一個來源于擬南芥的克隆JHD2-15A(8.2 kb,BgⅠ+XhoⅠ片段，含擬南芥幾乎全45S rDNA重復(fù)序列)，由北京林業(yè)大學(xué)戴絲蘭教授提供。用作原位雜交的靶材料為四倍體海島棉品種“新海7號”根尖體細(xì)胞染色體。另外為了書寫方便，本文圖中所涉及到的原位雜交組合均按照“靶染色體-探針-封阻DNA”格式書寫。

1.2探針的制備與標(biāo)記

棉花gDNA的提取與純化參照宋國立等[18]的方法，純化后的棉花基因組總DNA經(jīng)高壓滅菌鍋滅菌打斷10 min，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢查片段大小，其大小要求在300～600 bp范圍為宜。探針的標(biāo)記：其中g(shù)DNA探針?biāo)玫臉?biāo)記物為DIG-11-dTUP(顯示紅色熒光)，采用德國Roche公司的DIG-High-Prime標(biāo)記系統(tǒng)對其進(jìn)行標(biāo)記，按其提供的標(biāo)準(zhǔn)流程操作；45S rDNA探針則采用該公司的biotion-Nick-Translation MIX(顯示綠色熒光)標(biāo)記系統(tǒng)對其進(jìn)行標(biāo)記，按其提供的標(biāo)準(zhǔn)流程操作。

1.3靶染色體的制備

染色體制片按王春英等[19]的方法稍加改進(jìn)。取生長旺盛的根尖，用25×10-6的放線菌酮于20 ℃處理2 h，新鮮卡諾固定液于4 ℃下固定2～24 h。用4%的纖維素酶(Sigma)和0.5%的果膠酶(Sigma)在37 ℃下酶解1 h，水洗后，60%乙酸壓片，液氮冷凍揭蓋片，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4原位雜交流程

熒光原位雜交流程參照王春英等[20]的操作方法進(jìn)行。

1.5觀察與圖像處理

在熒光顯微鏡(Ziess Axioskop 2 plus)下觀察各雜交信號，DAPI(4’，6-diamidino-2-phenylindole)、Avidin-Fluorescein和PI(propidium iodide)分別使用濾鏡filter set 49、10和15觀察。同時用ISIS(in situimaging system)軟件拍攝并調(diào)節(jié)圖片對比度和亮度。測量有絲分裂中期染色體的長度和臂比，染色體形態(tài)描述、核型分析參照李懋學(xué)等[21]的方法進(jìn)行。同源染色體的序號確定，則以具有A基因組gDNA探針雜交信號的染色體為A亞組，無雜交信號的染色體為D亞組，兩組均依據(jù)染色體長度從長到短進(jìn)行編號。

2結(jié)果與分析

2.1海島棉45S rDNA-FISH

以45S rDNA作探針，用鮭魚精DNA(簡稱ssDNA)作封阻，對海島棉根尖體細(xì)胞有絲分裂中期染色體進(jìn)行FISH(圖1-A)，觀察到6個強(qiáng)的綠色熒光信號(圖中白色箭頭所示)，4個較大、2個稍小，全部位于染色體短臂端部，與DAPI(是一種與DNA特異結(jié)合的熒光染料，染色體被襯染成藍(lán)色)圖像進(jìn)一步對比，發(fā)現(xiàn)所有信號均分布在各染色體的隨體位置，稱之為NOR信號(Nucleolar Organizer Region，即核仁組織區(qū))[20]，結(jié)果表明海島棉有3對隨體。

2.2海島棉gDNA-FISH

以二倍體A組亞洲棉“石系亞1號”gDNA作探針，用ssDNA作封阻，對海島棉體細(xì)胞中期染色體進(jìn)行FISH(圖1-B)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)海島棉的52條染色體中，可以觀察到強(qiáng)的紅色雜交信號主要分布在較長的26條A亞組染色體上，而顯示藍(lán)色熒光信號(DAPI襯染)的則在較短的26條D亞染色體，直接將海島棉A、D兩亞組染色體區(qū)分開，直觀證實了海島棉的異源雙二倍體起源[22]，為后續(xù)的染色體核型分析奠定了基礎(chǔ)。

2.3海島棉基于雙色FISH的核型分析

為了更準(zhǔn)確地對海島棉進(jìn)行核型分析，筆者同時利用二倍體A組亞洲棉“石系亞1號”gDNA與45S rDNA作探針，ssDNA作封組，對海島棉進(jìn)行雙色FISH(圖1-C)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不僅二倍體A組的gDNA探針雜交信號可以明顯區(qū)分開海島棉A、D亞組染色體，而且45S rDNA探針產(chǎn)生的6個NOR信號則清晰地定位在了3對染色體上，可以看到其中1對在A亞組上(圖中綠色箭頭)，2對在D亞組上(圖中白色箭頭)。

基于該雙色FISH結(jié)果，進(jìn)一步獲得了海島棉的核型圖(圖1-D)和核型基本參數(shù)(表1)，由圖1和表1可知，海島棉的染色體多為對稱類型，在52條染色體中，中部著絲點類型(m)的有40條，其中A亞組占18條，D亞組占22條；近中部著絲點類型(sm)的有12條，其中A亞組占8條，D亞組占4條，無其他著絲點類型、兩著絲點類型占總數(shù)的百分率依次為77%和23%，說明海島棉染色體整體的對稱程度很高，是一個比較原始的棉種。在其全部基因組中，染色體長度比(最長染色體與最短染色體的比值)為1.85，平均染色體相對長度為3.85。另外，在海島棉全部基因組中，其臂比值最大的為2.11(A11號染色體)，最小的為1.08(D9號染色體)，平均臂比值為1.46。將A、D亞組分開分析，A亞組平均臂比值為1.58，D亞組的為1.32，前者大于后者。海島棉的核型公式為：2n=4x=52=40m(2SAT)+12sm(4SAT)，屬于2A類型，海島棉有3對隨體，其中1對位于A亞組的第9號染色體，屬于中部著絲點(m)類型；另2對分別位于D亞組的第8和12號染色體，屬于近中部著絲點(sm)類型，且3對隨體都分布在染色體短臂端部?；陔p色FISH的核型參數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)海島棉D(zhuǎn)亞組核型的對稱程度比A亞組的高，即D亞組中部著絲點染色體數(shù)多于A亞組，說明在進(jìn)化程度上A亞組強(qiáng)于D亞組。

另外從核型參數(shù)表中發(fā)現(xiàn)，海島棉A、D兩亞組染色體在相對長度上存在一定程度的交叉現(xiàn)象，即較短染色體組的D亞組第1號(D1)染色體的相對長度(為3.70)大于A亞組染色體的最后2對(A12、A13號分別為3.69、3.62)，前人的研究也發(fā)現(xiàn)過這種情況[23-24]，這說明基于原位雜交的核型分析方法較傳統(tǒng)的只按長度大小排序的方法更為準(zhǔn)確可靠。

表1　海島棉基于雙色FISH核型參數(shù)

注：隨體的長度不參與染色體全長的計算，m:中部著絲粒染色體,臂比范圍1.01～1.7；sm:近中著絲粒染色體，臂比范圍1.71～3.00；SAT:代表隨體。

3結(jié)論與討論

將本核型分析結(jié)果與聶汝芝等[22]應(yīng)用傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)方法對海島棉的核型分析結(jié)果相比較，其提出的中部著絲點類型(m)的染色體數(shù)為38條，本實驗的m類型染色體數(shù)為40條，相差2條；近中部著絲點類型(sm)的染色體數(shù)為12條，本實驗結(jié)果與其一致，也為12條；隨體數(shù)目前者為4個，本實驗的隨體數(shù)為6個(4大2小)，比其多檢測出2個，但前者還多出2條近端部著絲點類型染色體，本實驗通過45S rDNA-FISH發(fā)現(xiàn)，其應(yīng)為2個較小的隨體所在的染色體，本實驗結(jié)果將其歸為中部著絲點類型；染色體平均相對長度前者為2.08，本實驗的為3.85，兩者相差較大；平均臂比值前者為1.55，本實驗的為1.46，存在一定差異。

另外，本實驗核型分析結(jié)果以海島棉雙色FISH圖像為依據(jù)，由于A基因組gDNA探針的雜交信號，明顯地區(qū)分開了A、D兩亞組染色體，然后再依據(jù)各亞組染色體長短確定各自順序編號，這種方法對于核型分析更為客觀。雖然細(xì)胞學(xué)和生物化學(xué)研究表明，棉屬A染色體組棉種的染色體(DNA)大于D染色體組棉種[8,25]，但并非說明A亞組棉種13對染色體均大于D亞組棉種的所有染色體，本文基于雙色FISH圖像的核型分析結(jié)果證實了海島棉2個亞組染色體的相對長度存在交叉現(xiàn)象，這也正是本文核型分析結(jié)果與聶汝芝等結(jié)果存在差別的原因。所以，核型分析中，雙二倍體起源的四倍體棉種僅僅依據(jù)染色體相對長短鑒別2個亞組的染色體是不夠完善的，反之，基于FISH技術(shù)來鑒別各染色體組成及確定其物理序號則更為理想，這為多倍體物種特別是異源多倍體物種的核型分析研究提供了更為準(zhǔn)確的技術(shù)支持。

A、B分別是以45S rDNA和A組亞洲棉石系亞1號gDNA作探針，鮭魚精DNA作封阻對海島棉的FISH結(jié)果；C為同時以45S rDNA和A組亞洲棉石系亞1號gDNA作探針，鮭魚精DNA作封阻的雙色FISH結(jié)果；D為基于C的核型分析圖，其中1～13號為A亞組染色體，14～26號為D亞組染色體；Bar=10m

圖1海島棉FISH圖

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(責(zé)任編輯：曾小軍)

收稿日期：2015-12-24

基金項目：經(jīng)濟(jì)作物種質(zhì)資源發(fā)掘與創(chuàng)新利用(2013BAD01B03)；轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(2011ZX08005002-009)；江西省科技支撐計劃項目(20141BBF60011)；國家棉花產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目(CARS-18-36)。

作者簡介：肖水平(1984─)，男，江西吉安人，助理研究員，碩士，從事棉花種質(zhì)資源與遺傳育種研究。* 通訊作者：陳宜。

中圖分類號：S562

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-8581(2016)07-0006-05

Karyotype Analysis ofGossypiumbarbadenseBased on Dualcolor-FISH

XIAO Shui-ping1,2, WANG Kun-bo2, KE Xing-sheng1, YANG Lei1,LIU Xin-wen1, SUN Liang-qing1, YANG Shao-qun1, CHEN Yi1*

(1. Cotton Research Institute of Jiangxi Province/ Poyang Lake Station of Cotton Comprehensive Experiment, National Cotton Industrial Technique System, Jiujiang 332105, China; 2. Institute of Cotton Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences/ State Key Laboratory of Cotton Biology, Anyang 455000, China)

Abstract：Through the fluorescence in situ hybridization (FISH) of somatic metaphase chromosomes of Gossypium barbadense with the probe of 45S rDNA, six strong NOR (nucleolar organizer region) fluorescent signals were detected, of which 4 were big and 2 were small, and these signals were distributed at the satellite site of corresponding chromosome by combining with DAPI image observation. The FISH of G. barbadense with the probe of genomic DNA (gDNA) of diploid A-genome asiatic cotton found that: there were hybrid signals in the half of 52 chromosomes; the fluorescent signals were distributed in longer A-subgenomic chromosomes, and directly distinguished the A-subgenomic and D-subgenomic chromosomes of G. barbadense, which directly proved that G. barbadense was originated from two different diploid species. Using the gDNA of A-genome asiatic cotton and 45S rDNA as probes, we conducted dualcolor-FISH of G. barbadense, and detected not only 6 strong NOR signals but also gDNA hybrid signals in the chromosomes of G. barbadense, and clearly found 2 NOR signals in sub-genome A and other 4 NOR signals in sub-genome D. The karyotype analysis of G. barbadense based on dualcolor-FISH images indicated that: the karyotypic formula of this cotton species was 2n=4x=52=40m (2 SAT)+12sm (4 SAT), belonging to 2A type; there were three pairs of satellite chromosomes, of which one was located in the number 9 of A sub-genome (m type), and the others were located in the number 8 and number 12 of D sub-genome (sm type). It was also found that not all A sub-genomic chromosomes of G. barbadense had a bigger relative length than D sub-genomic chromosomes, suggesting that the FISH-based karyotype analysis method was more accurate than traditional methods.

Key words：G. barbadense; 45S rDNA; gDNA; Fluorescence in situ hybridization (FISH); Karyotype analysis