鄧智豪，官亞妹△，伍偉健，陀偉為，黃耀熊

(1.廣東省佛山市中心血站　528000；2.暨南大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系，廣州 510632)

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顯微相襯技術(shù)分析去白細(xì)胞懸浮紅細(xì)胞上清液不同存儲(chǔ)期內(nèi)細(xì)胞碎片及微粒的圖像變化*

鄧智豪1，官亞妹1△，伍偉健1，陀偉為2，黃耀熊2

(1.廣東省佛山市中心血站528000；2.暨南大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系，廣州 510632)

摘要:目的探索庫(kù)存去白細(xì)胞懸浮紅細(xì)胞，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，紅細(xì)胞破損或溶血而產(chǎn)生的細(xì)胞碎片及微粒變化，為輸血安全提供啟示性實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法取不同保存天數(shù)(3、7、14、21 d)的庫(kù)存去白細(xì)胞懸浮紅細(xì)胞進(jìn)行上清液制備，通過(guò)顯微靜態(tài)圖像分析技術(shù)對(duì)上清液中的微粒進(jìn)行觀察和形態(tài)分析。結(jié)果保存3 d和7 d的樣品上清液中可見(jiàn)少量微粒，微粒大小和細(xì)胞相仿；從14 d開(kāi)始微粒的數(shù)量顯著增加，微粒粒徑更小，到21 d微粒鋪滿了整個(gè)視場(chǎng)，呈現(xiàn)碎片化。結(jié)論保存期超過(guò)14 d的庫(kù)存去白細(xì)胞懸浮紅細(xì)胞，其上清液的細(xì)胞碎片及微粒顯著增多，較保存期不到14 d的細(xì)胞均有顯著的差異。這些外源細(xì)胞碎片或微?？赡軙?huì)成為抗原并引起機(jī)體的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致輸血不良反應(yīng)發(fā)生，建議臨床上給患者輸注保存期在14 d以內(nèi)的去白細(xì)胞懸浮紅細(xì)胞。

關(guān)鍵詞:去白細(xì)胞懸浮紅細(xì)胞；不同存儲(chǔ)期；顯微相襯圖像

長(zhǎng)時(shí)間庫(kù)存的血液制品是否存在隱患已吸引了學(xué)界越來(lái)越多的關(guān)注，時(shí)有報(bào)道的因輸注舊血而導(dǎo)致的醫(yī)療事故也引起了人們恐慌。2006年，Tinmouth等[1]報(bào)道，輸注了保存時(shí)間超過(guò)14 d的庫(kù)存紅細(xì)胞的患者出現(xiàn)并發(fā)癥的概率明顯比輸注保存時(shí)間短(少于7 d)的紅細(xì)胞的患者高。Offner等[2]在對(duì)因外傷而需要接受輸血的患者的研究中發(fā)現(xiàn)輸注保存超過(guò)14 d紅細(xì)胞的患者比輸注保存時(shí)間少于14 d的患者更容易發(fā)生感染。Koch等[3]分析了1998～2006年2 872例接受心臟搭橋手術(shù)的患者手術(shù)結(jié)束當(dāng)天、術(shù)后3 d及術(shù)后恢復(fù)1年內(nèi)發(fā)生并發(fā)癥的情況，發(fā)現(xiàn)輸注保存超過(guò)2周的紅細(xì)胞會(huì)明顯增加術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生概率,并提出將保存超過(guò)14 d的血液劃分為舊血。在通常情況下，庫(kù)存紅細(xì)胞在儲(chǔ)存過(guò)程中會(huì)發(fā)生一系列生物化學(xué)與結(jié)構(gòu)上的改變，且隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)變化更加顯著，這些改變通常被統(tǒng)稱為紅細(xì)胞的儲(chǔ)存損傷,臨床數(shù)據(jù)顯示全血及紅細(xì)胞制品儲(chǔ)存時(shí)間越長(zhǎng)輸血效果越差且可增加輸血相關(guān)不良反應(yīng)發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[4-6]。其中，細(xì)胞碎片或微粒是紅細(xì)胞儲(chǔ)存損傷的1種重要產(chǎn)物，會(huì)在紅細(xì)胞破損時(shí)釋放到基質(zhì)液體中,具有免疫調(diào)節(jié)作用，與輸血相關(guān)不良反應(yīng)(炎癥、血栓等)的發(fā)生密切相關(guān)[6-7]。Belizaire等[8]利用小鼠模型證明儲(chǔ)存紅細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞碎片或微粒能活化中性粒細(xì)胞并且引起輸血相關(guān)肺損傷；同樣還有研究證實(shí)儲(chǔ)存紅細(xì)胞制品中的細(xì)胞碎片或微?？赏ㄟ^(guò)與補(bǔ)體和IgG結(jié)合，活化中性粒細(xì)胞來(lái)介導(dǎo)輸血相關(guān)急性肺損傷[9]。因此，這些保存時(shí)間較長(zhǎng)的紅細(xì)胞，引起的副作用有一部分可能是由于庫(kù)存紅細(xì)胞在保存和處理過(guò)程中溶血所產(chǎn)生的細(xì)胞碎片或微粒導(dǎo)致的。為了了解庫(kù)存去白細(xì)胞懸浮紅細(xì)胞的溶血情況及其溶血產(chǎn)物狀態(tài)隨存儲(chǔ)時(shí)間的變化，本文在標(biāo)準(zhǔn)的血站采集、制備、運(yùn)輸和保存條件下，對(duì)不同保存期的庫(kù)存去白細(xì)胞懸浮紅細(xì)胞進(jìn)行溶血情況及其溶血產(chǎn)物方面的系統(tǒng)研究。本文主要采用了相襯顯微成像技術(shù)來(lái)對(duì)庫(kù)存去白細(xì)胞懸浮紅細(xì)胞上清液中的細(xì)胞碎片及微粒進(jìn)行圖像拍攝及分析，觀察紅細(xì)胞老化與溶血、細(xì)胞碎片生成等一系列變化。

1材料與方法

1.1材料本文所用到的去白細(xì)胞懸浮紅細(xì)胞均是由本站根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范完成制備，放置于專用儲(chǔ)血冰箱中2～6 ℃保存；隨機(jī)選取5份庫(kù)存去白細(xì)胞懸浮紅細(xì)胞，在保存到第3、7、14、21天時(shí)，在無(wú)菌環(huán)境下從血袋中各取出2 mL作為樣品，進(jìn)行平行試驗(yàn)；剩余的去白細(xì)胞懸浮紅細(xì)胞則在血袋熱合封口后待下一次實(shí)驗(yàn)使用。

1.2儀器與試劑0.9% NaCl溶液(生理鹽水)；日立CF7D2離心機(jī)；NikonTE300倒置顯微鏡。

1.3方法使用日立CF7D2離心機(jī)在4 ℃下以1 500 r/min速度將樣品離心10 min，制備上清液，并做好標(biāo)記；離心后各取30 μL上清液滴加到載玻片上，并置于NikonTE300倒置顯微鏡下，然后調(diào)節(jié)到相襯圖像模式，使用40倍物鏡觀察，再通過(guò)Panasonic高靈敏度CCD攝取顯微鏡觀察到的圖像。對(duì)保存時(shí)間為3、7、14、21 d的庫(kù)存去白細(xì)胞懸浮紅細(xì)胞上清液進(jìn)行了顯微相襯圖像的拍攝和研究，每份樣品均進(jìn)行25～30個(gè)視場(chǎng)拍攝，然后再使用顯微靜態(tài)圖像分析技術(shù)進(jìn)行圖像處理和分析。

2結(jié)果

5組平行樣品在不同時(shí)期的顯微圖像均無(wú)顯著差異，各選取1張典型顯微相襯圖片來(lái)反映庫(kù)存去白細(xì)胞懸浮紅細(xì)胞上清液在保存過(guò)程中微粒數(shù)量和粒徑大小的變化，如圖1所示。從圖1中4張較有代表性的顯微圖像可觀察到，從細(xì)胞碎片及微粒數(shù)量上比較，保存3 d和7 d樣品上清液中可見(jiàn)少量微粒，從14 d開(kāi)始微粒的數(shù)量顯著增加，到21 d微粒鋪滿了整個(gè)視場(chǎng)。從細(xì)胞碎片及微粒粒徑上比較，保存3 d和7 d的樣品上清液中微粒大小和細(xì)胞相仿，從14 d開(kāi)始觀察到的微粒粒徑更小，到21 d時(shí)逐漸呈現(xiàn)碎片化。細(xì)胞碎片及微粒整體變化趨勢(shì)為：微粒數(shù)量在不斷增多，微粒的粒徑分布也有差異，形狀在改變，到21 d時(shí)逐漸呈現(xiàn)碎片化。

注：A～D分別表示保存3、7、14、21 d的去白細(xì)胞懸浮紅細(xì)胞上清液。

圖1不同保存期庫(kù)存去白細(xì)胞懸浮紅細(xì)胞上清液的顯微相襯圖像

3討論

隨著科學(xué)的發(fā)展，人們對(duì)血液的了解越來(lái)越深,血液保存技術(shù)的進(jìn)步促使了庫(kù)存血的產(chǎn)生。輸庫(kù)存血已成為現(xiàn)今輸血治療中應(yīng)用最廣泛和最重要的一種方式,如何讓新鮮血液獲得最有效的保存,使血細(xì)胞生命力和活力不在保存過(guò)程中損失,使血液在保存過(guò)程中保持新鮮,如何保證庫(kù)存血的輸注安全已成為現(xiàn)今臨床醫(yī)學(xué)治療中最關(guān)注的問(wèn)題之一。庫(kù)存血液從收集、檢測(cè)、分離、保存，再配送到臨床上輸注使用，無(wú)法避免的有一定時(shí)間的周轉(zhuǎn)過(guò)程。需要輸注進(jìn)入人體內(nèi)的紅細(xì)胞制品均存在一個(gè)保存時(shí)間的問(wèn)題,從理論上來(lái)說(shuō),血液從獻(xiàn)血者身上采集到制備成紅細(xì)胞制品,再到入庫(kù)編排保存,再發(fā)放到臨床使用至少需要3 d,那就是說(shuō),在醫(yī)院臨床上使用到的由血站配送的紅細(xì)胞制品至少是3 d以前采集的血液了。隨著時(shí)間的變化，正常狀態(tài)的紅細(xì)胞在內(nèi)外環(huán)境等物理及化學(xué)因素的影響下，會(huì)發(fā)生不同程度的改變。這個(gè)改變是整體的，除了包含紅細(xì)胞本身的儲(chǔ)存損傷之外，還包括了隨著紅細(xì)胞破損而釋放到其懸液基質(zhì)中的微粒，紅細(xì)胞破損后而產(chǎn)生的細(xì)胞碎片以及其他由于細(xì)胞溶血而產(chǎn)生的微粒會(huì)被釋放到庫(kù)存去白細(xì)胞懸浮紅細(xì)胞液體基質(zhì)的改變。但是研究人員往往將注意力集中在紅細(xì)胞本身的變化。任素萍等[10]在用電子顯微鏡研究延期保存的紅細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn),在使用超氧化物歧化酶保存液的條件下,紅細(xì)胞隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，棘形紅細(xì)胞和畸形紅細(xì)胞越來(lái)越多。王愛(ài)梅等[11]在用不同保存時(shí)期的全血制備洗滌紅細(xì)胞的時(shí)候，發(fā)現(xiàn)用保存15 d以上的全血制備的洗滌紅細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生不正常的變化，觀察到了棘形紅細(xì)胞的出現(xiàn)。許利民等[12]研究了紅細(xì)胞在不同溫度環(huán)境下長(zhǎng)期凍存后平均體積的變化后，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期凍存的紅細(xì)胞平均體積均比正常的紅細(xì)胞大。本研究通過(guò)對(duì)不同保存時(shí)間的庫(kù)存去白細(xì)胞懸浮紅細(xì)胞上清液的觀察發(fā)現(xiàn)，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，庫(kù)存去白細(xì)胞懸浮紅細(xì)胞上清液樣品的單位體積內(nèi)的微粒數(shù)量呈不斷上升的趨勢(shì)，微粒數(shù)目隨著保存時(shí)間的增長(zhǎng)而上升，更突出的是，保存期在14 d以內(nèi)，樣品中的微粒數(shù)目的增長(zhǎng)速度較為緩慢，而在保存期達(dá)到了14 d以后，從保存的第3周開(kāi)始，微粒數(shù)目的增長(zhǎng)明顯。從保存14 d的上清液顯微圖像中可以發(fā)現(xiàn)，形態(tài)尺寸也發(fā)生了變化，尺寸更小，形態(tài)更像一些囊泡和細(xì)胞碎片，到了保存后期(21 d)的上清液顯微圖像中的微粒已鋪滿整個(gè)視場(chǎng)，并且形態(tài)已呈現(xiàn)碎片化。結(jié)果表明，保存期超過(guò)14 d的庫(kù)存去白細(xì)胞懸浮紅細(xì)胞，紅細(xì)胞會(huì)由青齡紅細(xì)胞加速向老齡紅細(xì)胞發(fā)展，其上清液的細(xì)胞碎片及微粒顯著增多，較保存期不到14 d的細(xì)胞均有顯著差異。

綜上所述，庫(kù)存去白細(xì)胞懸浮紅細(xì)胞保存質(zhì)量的評(píng)價(jià)不應(yīng)當(dāng)只關(guān)注紅細(xì)胞本身，其上清液的變化同樣有著重要的意義。外源細(xì)胞碎片或微?？赡軙?huì)成為抗原并引起機(jī)體的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致輸血不良反應(yīng)發(fā)生。因此，建議臨床上給患者輸注保存期在14 d以內(nèi)的去白細(xì)胞懸浮紅細(xì)胞，以減少輸血不良反應(yīng)的發(fā)生。

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* 基金項(xiàng)目：廣東省佛山市衛(wèi)計(jì)局科研課題項(xiàng)目(2014162)。

作者簡(jiǎn)介：鄧智豪，男，主管檢驗(yàn)技師，主要從事血液成分制備與檢測(cè)方面的研究。 △通訊作者，E-mail：455300438@qq.com。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.14.015

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-4130(2016)14-1939-03

(收稿日期：2016-01-12修回日期：2016-03-23)

Analysis on aleukocytic suspending red blood cell supernatant fragment and particle image changes at different stored periods by microscopic phase contrast technology*

DENGZhihao1,GUANYamei1△,WUWeijian1,TUOWeiwei2,HUANGYaoxiong2

(1.FoshanMunicipalCentralBloodStation,Foshan,Guangdong528000,China;2.DepartmentofBiomedicalEngineering,JinanUniversity,Guangzhou,Guangdong510632,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the cellular fragments and particle image changes of inventory aleucocytic suspending RBC produced by the storage time extension,RBC damage or hemolysis in order to provide the revelatory experimental basis for the transfusion safety.MethodsThe supernatant was prepared from different stored days (3,7,14,21 d) of stock aleukocytic suspending RBC.The particles in supernatant were observed and morphologically analyzed by using the microscopic static image analytic technology.Results There were a small amounts of visible particles in the sample supernatant preserved for 3,7 d and the particles′ sizes are similar to cells′;the number of particles began to significantly increase from 14 d and the diameter became smaller.The particles filled the entire field until 21 d,showing fragmentary status.ConclusionThe cellular fragments and particles in the supernatants of stock aleukocytic suspending RBC with the storage period exceeding 14 d are significantly increased and have significant difference compared with those stored for less than 14 d.These exogenous fragments and particles may become antigens and induce the body immune response,lead to transfusion adverse reactions.It is recommended that the patients should be transfused with stock aleukocytic suspending RBC within a storage period of 14 d.

Key words:aleukocytic suspending red blood cell;different stored periods;microscopic phase contrast image