高文杰，周蘊薇，何淼

（東北林業(yè)大學園林學院，黑龍江 哈爾濱 150040）

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四倍體神農香菊與露地菊‘紐9717’種間雜交初步研究

高文杰，周蘊薇，何淼*

（東北林業(yè)大學園林學院，黑龍江 哈爾濱 150040）

以四倍體神農香菊（Dendranthema indicum var. aromaticum）和露地菊‘紐9717’（Dendranthema× gandiflorum ‘niu9717’）為試材，對其進行花粉和柱頭的微觀形態(tài)觀察、最適花粉萌發(fā)的培養(yǎng)基篩選，同時測定花粉活力和柱頭可授性及不同授粉方式下的結實情況，并對雜交獲得的F1代植株性狀進行表型分析。結果表明：四倍體神農香菊和露地菊‘紐9717’均為單粒花粉，有3個萌發(fā)溝，柱頭均在丫狀期開始授粉，最適花粉萌發(fā)的培養(yǎng)基均為ME3+150 g/L PEG4000+150 g/L蔗糖+0.1 g/L硼酸+0.1 g/L Ca2+；四倍體神農香菊在開花第4 天花粉活力最高，為64.63%，在13：00花粉活力最高，為54.56%，在開花第9天13：00—14：00時柱頭可授性最強；露地菊‘紐9717’在開花第6天時花粉活力最高，為11.63%，在13：00花粉活力最高，為9.26%，在開花4～5 d 12：00—13：00時柱頭可授性最強；不同授粉方式的結果顯示，四倍體神農香菊與露地菊‘紐 9717’雜交在去雄、套袋、人工異花授粉條件下結實率最高（79.28%）；雜交后獲得的F1代21株植株，在植株形態(tài)、葉片和花蕾方面表現出不同的性狀，其中2株呈匍匐狀生長，8株表現為葉長≤葉寬，7株葉緣鋸齒為圓鈍，10株現蕾早，且大多數花蕾為黑褐色，僅1株的花蕾為綠色。

神農香菊；露地菊‘紐9717’；花粉活力；柱頭可授性

投稿網址：http：//xb.ijournal.cn

神農香菊（Dendranthema indicum var. aromaticum）（2n=18）系菊科菊屬野菊的一個變種［1］，在 1982年由劉啟宏先生在神農架發(fā)現并命名。神農香菊的花、葉及根均具有濃郁的香氣［2］，是菊屬植物中罕見的濃郁香味種，被用來提取精油或浸膏。若將此花香性狀轉到栽培菊花中，培育出濃香型菊花品種，對菊屬植物的品種改良具有重要意義。為克服倍性差異大種間雜交不親和［3-5］的問題，筆者所在課題組前期誘導了四倍體神農香菊，用于后期種間雜交研究。

在育種過程中，只有了解雜交親本的開花習性、生殖器官發(fā)育等情況，才能使雜交試驗取得成功［6-7］，其中，花粉活力高和柱頭可授性強是雜交成功的關鍵［8］。本研究以四倍體神農香菊和露地菊‘紐 9717’（Dendranthema×gandiflorum ‘niu9717’）為試材，對其花部綜合特征、花部微觀結構、花粉活力、柱頭可授性及不同授粉方式下的結實情況等進行研究，旨在為后期神農香菊和露地菊雜交育種研究提供參考依據。

1　材料與方法

1.1材料

人工誘導的四倍體神農香菊和東北林業(yè)大學苗圃的露地菊‘紐9717’。

1.2方法

1.2.1花部綜合特征觀察

在四倍體神農香菊和露地菊‘紐9717’花蕾期，各選擇50個花蕾進行掛牌標記，每天09：00—10：00進行觀察并記錄，直至花序萎蔫為止。分別記錄2種花的花序組成結構，各器官的生長變化特征及持續(xù)時間等。

1.2.2花部微觀結構觀察

在四倍體神農香菊和露地菊‘紐9717’的盛花期，采其花序，分別對2種花的花粉和柱頭進行粘臺、噴金等處理，置于日立S-520掃描電鏡下觀察并拍照。

1.2.3花粉萌發(fā)最適培養(yǎng)液的篩選

以ME3+PEG4000（150 g/L）為基礎培養(yǎng)液，添加不同質量濃度的蔗糖、H3BO4和Ca2+（以S、H和C來表示），采用正交試驗L9（34）篩選最適合的培養(yǎng)液，共9個處理。3次重復，結果取平均值。

表1　正交試驗的因素和水平Table 1 The factors and levels orthogonal experiment design

1.2.4花粉活力的測定

采用離體萌發(fā)法測定花粉活力［9-10］。從開花第1天至管狀花散粉結束，每天13：00分別測定2種花的花粉活力，連續(xù)測10 d；在開花4～6 d時，每天09：00、11：00、12：00、13：00、14：00、15：00、17：00時測定兩者的花粉活力，計錄花粉萌發(fā)情況。

1.2.5柱頭可授性的測定

采用聯苯胺-過氧化氫法測定柱頭可授性［11］。自開花前1 d起，每天13：00—14：00測定四倍體神農香菊和露地菊‘紐9717’的舌狀花柱頭可授性，連續(xù)測15 d；在開花4～6 d時，每天09：00、11：00、12：00、13：00、14：00、15：00、17：00時測定兩者的花粉活力。每次選3朵花，每朵花取5個柱頭測定。

1.2.6四倍體神農香菊與露地菊‘紐9717’的雜交試驗

以四倍體神農香菊（2n=36）為母本，露地菊‘紐9717’（2n=54）為父本，依據Dafni方法［12-13］進行下列處理：①去雄，套袋，不授粉；②去雄，套袋，人工授粉；③去雄，不套袋，自由授粉；④不去雄，套袋，自花授粉；⑤不去雄，不套袋，自由授粉。每處理30朵花，計算結實率。將兩者雜交獲得的種子播種于穴盤中，常規(guī)管理，進行性狀觀察。

2　結果與分析

2.1花粉及柱頭的微觀形態(tài)特征

四倍體神農香菊花粉為單?；ǚ郏螤畛书L橢球形，個別花粉出現異形（圖1-D），有3個萌發(fā)溝（圖1-B），極面觀為近圓形，赤道面觀為近橢圓形（圖1-C），花粉粒大小約為66.92 μm×46.93 μm，花粉外壁具有刺狀紋飾，刺均勻分布且長短不一（圖1-A）。四倍體神農香菊管狀花由花藥和柱頭組成，花藥先成熟并散粉（圖1-I），然后柱頭伸長生長，高度超過花藥（圖1-E），柱頭先呈直立型，后呈開裂狀，授粉后呈羊角狀（圖1-F）。柱頭頂端有指狀乳突（圖1-G），丫狀期開始授粉（圖1-H），授粉后指狀乳突干癟。

圖1　四倍體神農香菊的花粉及柱頭的微觀形態(tài)Fig.1 Microcosmic morphology of pollen and stigma of tetraploid D.aromaticum

圖2　露地菊‘紐9717’花粉及柱頭微觀形態(tài)Fig.2 Microcosmic morphology of pollen and stigma of D. ‘niu9717’

露地菊‘紐9717’花粉也是單粒花粉，形狀長橢球形，極面觀顯現為近圓形，赤道面觀顯現為近橢圓形，花粉粒大小約為58.89 μm×40.28 μm，有3個萌發(fā)溝，花粉外壁具有刺狀紋飾，刺均勻分布但長短不一（圖2-A、2-B、2-C）。露地菊‘紐9717’管狀花的花藥包被在柱頭外面，先是花藥開始散粉（圖2-D和圖2-H），然后柱頭伸長生長。柱頭生長分3個時期（直立期、丫狀期（圖2-E）、羊角狀期），3個時期的柱頭頂端都存在指狀乳突（圖2-F和圖2-I），丫狀期開始授粉，授粉后指狀乳突干癟（圖2-G）。

2.2花粉萌發(fā)最適培養(yǎng)液的確定

正交試驗結果（表2）表明，9號培養(yǎng)液即蔗糖150 g/L、硼酸0.1 g/L和Ca2+0.1 g/L時，四倍體神農香菊和露地菊‘紐9717’的花粉萌發(fā)率分別為81.73%和 4.29%，為2種花粉的最適萌發(fā)培養(yǎng)液。極差分析結果（表3）表明，對四倍體神農香菊花粉萌發(fā)的影響大小順序依次為蔗糖、硼酸、Ca2+，三者對四倍體神農香菊花粉萌發(fā)率的影響均達顯著水平，而3因素中僅蔗糖對露地菊‘紐9717’花粉萌發(fā)有顯著影響。

表2　不同質量濃度的蔗糖、硼酸、Ca2+下四倍體供試材料的花粉萌發(fā)率Table 2 Pollen germination rate in the case of the orthogonal experiment

表3　供試材料花粉萌發(fā)率的方差分析結果Table 3 The result of variance analysis of materials’ pollen germination rate

2.3花粉活力的檢測結果

四倍體神農香菊在開花第1天時不散粉，第2天時開始散粉，在1～4 d時，花粉的活力逐漸升高，并在開花第4天時達到最高，為64.63%，此后隨著開花天數的遞增花粉的活力也逐漸降低，到開花第10天時花藥散粉，此時的花粉萌發(fā)率僅為9.01%；露地菊‘紐9717’的花粉活力也隨開花天數的遞增呈先上升后下降的趨勢，并在開花第6天時花粉萌發(fā)率最高，為11.63%（圖3）。

圖3　花粉活力隨時間的變化Fig.3 Pollen viability different sampling times

四倍體神農香菊在09：00—13：00，花粉萌發(fā)率不斷升高，并在13：00時達到最高（54.56%），14：00后花粉萌發(fā)率開始下降，在17：00時花粉萌發(fā)率僅為14.62%；露地菊‘紐9717’在11：00—13：00和14：00—15：00時與四倍體神農香菊的花粉萌發(fā)率變化規(guī)律一致，先逐漸升高，在13：00時達到最高，為9.26%，后逐漸下降（圖3），因此，13：00是花粉活力較旺盛的時間，做雜交試驗時應在此時間收集花粉。

2.4柱頭可授性檢測結果

四倍體神農香菊在開花前1 d時，舌狀花柱頭不具有可授性，開花當天部分具有可授性，并在開花第9天時柱頭的可授性最強，開花14 d時部分柱頭開始萎蔫并失去可授性，15 d時柱頭全部萎蔫失去可授性。露地菊‘紐9717’在開花前1 d舌狀花柱頭也沒有可授性，開花當天和第2天部分柱頭具有可授性，在開花第4天和第5天時柱頭可授性最強，隨后可授性逐漸下降，到開花第 14天時部分柱頭開始萎蔫并失去可授性，隨后柱頭萎蔫不具可授性（表4）。

表4　供試材料在不同開花時期的柱頭可授性Table 4 Sigma receptivity of ray florets different number of days of flower

四倍體神農香菊舌狀花柱頭在09：00—17：00都具有可授性，并在13：00、14：00時柱頭分泌大量黏液，此時柱頭的可授性最強；露地菊‘紐9717’在9：00時只有部分舌狀花柱頭具有可授性，11：00—17：00柱頭一直具有可授性，并在12：00、13：00時柱頭可授性最強（表5）。

表5　供試材料在不同開花時間點的柱頭可授性Table 5 Sigma receptivity of ray florets different sampling times a day

2.5四倍體神農香菊與露地菊‘紐9717’的雜交試驗結果

雜交試驗結果：四倍體神農香菊在舌狀花去雄，套袋，不授粉條件下的結實率為0，說明四倍體神農香菊不存在無融合生殖；在去雄，不套袋，自由授粉條件下的結實率為40.77%；不去雄，套袋，自花授粉時的結實率為37.84%；不去雄，不套袋，自由授粉處理時的結實率為49.62%；去雄，套袋，人工異花授粉（露地菊‘紐9717’）處理時結實率顯著提高，為79.28%。由此可判定四倍體神農香菊的繁育體系為異交（部分自交不孕），需要傳粉者。

2.6四倍體神農香菊與露地菊‘紐9717’雜交F1

代的表型分析

將兩者雜交后獲得的種子播種于穴盤中，進行常規(guī)管理，共獲得21株雜交后代，其中2株呈匍匐狀生長，這與母本性狀相似，19株隨父本呈直立生長；葉型根據長寬比分為2類，長度不大于寬度的有8株，長度大于寬度的有13株。葉緣鋸齒可分圓鈍和尖銳2類，其中圓鈍的有7株，尖銳的有14株。10株現蕾早，且大多數花蕾為黑褐色，僅1株的花蕾為綠色。

3　結論與討論

本研究結果表明，四倍體神農香菊和露地菊‘紐9717’花粉的最適萌發(fā)培養(yǎng)基均為ME3+150 g/L PEG4000+150 g/L蔗糖+0.1 g/L硼酸+0.1 g/L Ca2+；四倍體神農香菊與露地菊‘紐9717’雜交在去雄，套袋，人工異花授粉條件下的結實率最高，為79.28%；四倍體神農香菊的花粉活力在頭狀花序開花第4天時達到最高（64.63%），露地菊‘紐9717’在開花第6天時達到最高（11.63%），兩者存在一定的差異，這可能與野生神農香菊的抗性及對環(huán)境的適應能力較強有關［14-15］，兩者均在13：00時花粉活力最高，這可能是由于四倍體神農香菊和露地菊‘紐9717’在黑龍江的花期較晚（10月下旬），正午最高溫度不高于20 ℃，是菊花的最適生長溫度。柱頭可授期是花朵成熟過程中的一個重要時期，它在很大程度上影響自花傳粉率、雜交結實率等［16］。本研究經聯苯胺—過氧化氫檢測發(fā)現，四倍體神農香菊和露地菊‘紐9717’的舌狀花柱頭可授性均隨開花天數的推移先增強后減弱，其中露地菊‘紐9717’在頭狀花序開花第4天和第5天12：00—13：00時舌狀花柱頭的可授性最強，四倍體神農香菊在開花第9天13：00—14：00時舌狀花柱頭的可授性最強，判斷兩者雌蕊均發(fā)育正常，可作為雜交試驗的母本。

雜交育種不但要考慮雜交親和性、父本的花粉活力，而且還要考慮母本的柱頭可授性。選擇父本花粉活力最高、母本柱頭可授性最強時進行授粉，雜交試驗的成功率才能更高。

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責任編輯：尹小紅

英文編輯：梁 和

Primary research on distant hybridization between tetraploid Dendranthema indicum var. aromaticum and Dendranthema × gandiflorum ‘niu9717’

GaoWenjie， Zhou Yunwei， He Miao*
（College of Landscape and Architecture， Northeast Forestry University， Harbin 150040， China）

In this experiment， tetraploid Dendranthemaindicum var. aromaticum and Dendranthema×gandiflorum ‘niu9717’ were used as material to study pollen and stigma morphology， pollen viability and stigma receptivity， the optimal pollen germination medium， and analyse seed setting rate in different hybrid method and morphological characteristics of F1plants. The results showed that both tetraploid Dendranthemaindicum var. aromaticum and Dendranthema×gandiflorum‘niu9717’ had single pollen grain with three germination ditch and stigma pollinating in the bifurcation stage. The best medium for pollen germination was ME3+ 150 g/L PEG 4000 + 150 g/L Sucrose + 0.1 g/L H3BO4+ 0.1 g/L Ca2+. Tetraploid Dendranthema indicum var. aromaticum had the highest pollen viability on the fourth day of blossom （64.63%） and at 13：00 pm in a day （54.56%） and the strongest stigma receptivity on the 9th day of blossom and at 13：00 to 14：00 in a day， while Dendranthema × gandiflorum ‘niu9717’ had the highest pollen viability on the 6th day of blossom （11.63%） and at 13：00 pm （9.26%） in a day and the strongest stigma receptivity on the 4th to 5th day of blossom and at 12：00 to 13：00 in one day. Comparing with different pollination ways of tetraploid Dendranthema indicum var. aro maticum and Dendranthema×gandiflorum‘niu9717’， the way of emasculation， bagging and handcross-pollination had the highest seed setting rate （ 79.28%） and obtained 21 F1hybrids with different characteristics in plant morphology， leaf and flower bud， which 2 plants with creeping growth， 8 plants with leaves of length≤width， 7 plants’with leaves of blunt sawtooth margin， 10 plants with earlier flower budding， and most of the buds were dark brown， only 1 was green.

Dendranthema indicum var. aromaticum； Dendranthema×gandiflorum ‘niu9717’； pollen viability； stigma receptivity

高文杰（1970—），女，黑龍江雙鴨山人，博士研究生，主要從事園林植物資源研究，wenjie_gao724@163.com；*通信作者，何淼，博士，副教授，主要從事園林植物種質資源研究，hemiao@nefu.edu.cn

S682.1+1；S503.51

A

1007-1032（2016）04-0374-06

2015-12-28 修回日期：2016-06-10

中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金項目（2572015EY03）