郁有祝，王艷飛，郭玉華

(安陽工學院 化學與環(huán)境工程學院，河南 安陽 455000)

0 引言

香豆素類化合物具有明顯的生物學活性，例如抗菌[1]、抗HIV[2]、抗腫瘤[3]、抗氧化[4]等.血清白蛋白是生物體內(nèi)重要的載體蛋白，可以和許多內(nèi)源性、外源性分子結(jié)合[5]，許多藥物小分子被吸收后往往是通過血清白蛋白儲存、運轉(zhuǎn)，從而發(fā)揮作用的.金屬離子廣泛存在于生物體中并參與生命活動，其中包括人體必需的微量元素如鐵、銅、鋅等，這些金屬離子既可與香豆素類化合物結(jié)合，也可與人血清白蛋白結(jié)合，從而對兩者的相互作用產(chǎn)生影響.因此，研究金屬離子對藥物分子與血清白蛋白相互作用的影響，能夠更確切地了解體內(nèi)藥物分子與蛋白的作用.

香豆素-3-羧酸與牛血清白蛋白的相互作用已有報道[6]，但尚未見Cu2+、Fe3+、 Zn2+對兩者相互作用影響的報道.本實驗利用熒光光譜法研究Cu2+、Fe3+、Zn2+對香豆素-3-羧酸與牛血清白蛋白相互作用的影響，為探討金屬離子對香豆素類藥物在體內(nèi)的運轉(zhuǎn)、代謝及藥效等影響提供參考.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

日立F-7000熒光分光光度計，日立高新技術公司；T6-新世紀紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司.

牛血清白蛋白(BSA，Roche公司)用pH=7.4 Tris-HCl緩沖溶液(內(nèi)含0.05 mol/LNaCl)配制成1.0×10-4mol/L儲備液；香豆素3-羧酸(實驗室合成)，配成濃度為1.0×10-3mol/L溶液；CuCl2、Fe(NO3)3、Zn(NO3)2用水配成1.0×10-3mol/L溶液.

1.2 實驗方法

在10 mL比色管中依次加入0.5 mL 10-5mol/L BSA溶液、0.5 mL 1.0×10-3mol/LCu2+或Fe3+或Zn2+溶液、1.0 mL Tris-HCl(pH=7.4)緩沖溶液及不同體積1.0×10-3mol/L香豆素-3-羧酸溶液，定容，放置30 min，以280 nm為激發(fā)波長，掃描熒光光譜.

2 結(jié)果與討論

2.1 Cu2+、Fe3+、Zn2+存在下香豆素-3-羧酸與BSA作用的熒光光譜

Cu2+、Fe3+、Zn2+存在下不同濃度香豆素-3-羧酸對BSA的熒光猝滅光譜如圖1所示，不同濃度香豆素-3-羧酸對BSA的熒光猝滅光譜作為對照.由圖1可見， Cu2+、Fe3+、Zn2+的加入，使得香豆素-3-羧酸對BSA的熒光猝滅加強，BSA的峰形變化不大，熒光發(fā)射峰的位置沒有顯著移動.

CBSA=0.5×10-6mol·L-1，C(Cu2+)=C(Fe3+)=C(Zn2+)=0.5×10-4mol·L-1, C香豆素-3-羧酸(1-8)：0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 /10-5mol·L-1圖1 金屬離子存在下香豆素-3-羧酸對 BSA的熒光猝滅光譜Fig. 1 Fluorescence spectra of coumarin-3-carboxylic acid-BSA system in presence of metal ions

離子T/KStern-Volmer方程RKq/(1012×L·mol-1·s-1)空白298y = 0.78×104x + 1.040.9930.78310y = 0.67×104x + 1.020.9950.67Cu2+298y = 5.24×104x + 0.930.9955.24310y = 4.97×104x + 0.960.9964.97Fe3+298y = 7.42×104x + 0.950.9957.42310y = 7.28×104x + 0.940.9957.28Zn2+298y = 4.80×104x + 1.010.9984.80310y = 4.64×104x + 0.900.9934.64

2.2 Cu2+、Fe3+、Zn2+存在下香豆素-3-羧酸對BSA的熒光猝滅類型

為了進一步確定熒光猝滅類型，根據(jù)Stern-Volmer方程[7]F0/F=1+Ksv[Q]=1+Kqτ0[Q] (式中：F0和F分別為猝滅劑不存在和存在時體系的熒光強度；[Q]為猝滅劑的濃度)，做了25 ℃、37 ℃時Cu2+、Fe3+、Zn2+存在下，香豆素-3-羧酸對BSA的Stern-Volmer曲線，求得熒光猝滅常數(shù)Ksv，生物大分子的平均熒光壽命τ0為1×10-8s，而Ksv=Kqτ0，由此可計算出猝滅過程的猝滅速率常數(shù)Kq，列于表1中.

由表1可知，有無金屬離子，熒光猝滅速率常數(shù)Kq均隨溫度升高而減小，說明Cu2+、Fe3+、Zn2+的加入沒有改變熒光猝滅類型，香豆素-3-羧酸對BSA的熒光猝滅類型為靜態(tài)猝滅[8].在298 K金屬離子存在時的Kq均大于無金屬離子時的Kq，表明金屬離子的存在均增強了香豆素-3-羧酸對BSA的熒光猝滅，且Fe3+的影響最大.

2.3 Cu2+、Fe3+、Zn2+對香豆素-3-羧酸與BSA作用的影響

為進一步探討Cu2+、Fe3+、Zn2+對香豆素-3-羧酸與BSA作用的影響，根據(jù)公式[9]：lg[(F0/F)-1]=lgKA+nlg[Q]求得不同溫度時，Cu2+、Fe3+、Zn2存在下香豆素-3-羧酸與BSA的結(jié)合常數(shù)KA、結(jié)合位點數(shù)n，結(jié)果如表2所示.

表2 金屬離子存在下香豆素-3-羧酸與BSA的結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點數(shù)

結(jié)果表明，在298 K及310 K下，Cu2+、Fe3+、Zn2+存在時香豆素-3-羧酸與BSA的結(jié)合常數(shù)均有明顯增大，表明Cu2+、Fe3+、Zn2+加強了香豆素-3-羧酸與BSA的作用，延長了藥物在血漿中的貯留時間，有助于藥物持久緩釋發(fā)揮藥效.由表2還可以看出，金屬離子的存在影響香豆素-3-羧酸與BSA的結(jié)合常數(shù)，但結(jié)合位點數(shù)n都近似等于1，說明Cu2+、Fe3+、Zn2+參與了香豆素-3-羧酸與BSA的結(jié)合，香豆素-3-羧酸與BSA只在一個位點發(fā)生作用.

2.4 Cu2+、Fe3+、Zn2+存在下香豆素-3-羧酸與BSA作用的熱力學參數(shù)及作用力類型

有機小分子與蛋白質(zhì)等大分子之間的作用力主要有氫鍵、靜電作用力、疏水作用和范德華力等.而作用過程中的熱力學參數(shù)是判斷作用力類型的主要標準.當溫度變化范圍不大時，作用過程的ΔH可看做一定值.根據(jù)熱力學方程ln(K2/K1)=ΔH(1/T1-1/T2)/R和ΔG=-RTlnK=ΔH-TΔS可計算出Cu2+、Fe3+、Zn2+存在下香豆素-3-羧酸與BSA作用的熱力學參數(shù)結(jié)果如表3所示.

表3 金屬離子存在下香豆素-3-羧酸與BSA作用的熱力學參數(shù)Tab. 3 Thermodynamic parameters of coumarin-3-carboxylic acid-BSA system in presence of metal ions

根據(jù)反應前后熱力學焓變ΔH和熵變ΔS的相對大小，可判斷藥物小分子與蛋白質(zhì)之間的主要作用力類型[10]，即ΔH>0，ΔS>0時，屬于疏水作用；ΔH<0，ΔS<0，屬于氫鍵和范德華力；ΔH<0，ΔS>0時主要屬于靜電引力.表3中ΔG<0表明有無金屬離子存在香豆素-3-羧酸與BSA的作用過程均是自發(fā)過程.不存在金屬離子時，香豆素-3-羧酸與BSA間的作用力主要是疏水作用力，F(xiàn)e3+和Cu2+存在下，作用力類型改變?yōu)殪o電引力；Zn2+存在下，香豆素-3-羧酸與BSA間的作用力類型沒有發(fā)生變化，仍是疏水作用力，但熱力學參數(shù)值發(fā)生了變化，這進一步說明Cu2+、Fe3+、Zn2+參與了香豆素-3-羧酸與BSA的結(jié)合作用.

2.5 Cu2+、Fe3+、Zn2+對香豆素-3-羧酸紫外光譜的影響

以pH=7.4 Tris-HCl緩沖溶液為參比，分別做出香豆素-3-羧酸與Cu2+、Fe3+、Zn2+作用的紫外吸收光譜見圖2.由圖可知向香豆素-3-羧酸中加入不同濃度Cu2+、Fe3+、Zn2+后，其吸收曲線形狀幾乎沒變，最大吸收峰強度均增大，可能是香豆素-3-羧酸與金屬離子由于靜電力作用絡合而引起吸光度發(fā)生變化[11].結(jié)合2.3及2.4可以推斷金屬離子與香豆素-3-羧酸及BSA之間可能形成了三元配合物，增強了BSA與香豆素-3-羧酸的結(jié)合作用，使結(jié)合常數(shù)增大[12].

C香豆素-3-羧酸 =5×10-5mol·L-1，C(Cu2+) =C(Zn2+)(1-8)依次為(0,1,2,3,4,5,6,7)×10-5mol·L-1C(Fe3+) (1-7)依次為(0,1,2,3,4,6,7) ×10-5mol·L-1

3 結(jié)論

實驗表明，一定濃度的Cu2+、Fe3+、Zn2+存在對香豆素-3-羧酸對BSA的熒光有協(xié)同猝滅作用，增大了香豆素-3-羧酸與BSA的結(jié)合常數(shù)，不同的金屬離子對體系影響不同，F(xiàn)e3+和Cu2+的存在改變了香豆素-3-羧酸與BSA間的作用力類型.由此可知，Cu2+、Fe3+、Zn2+對香豆素-3-羧酸與BSA的作用有較大影響，血液中Cu2+、Zn2+、Fe3+在一定濃度下有助于藥效的發(fā)揮，為研究香豆素類藥物的藥理作用提供重要的信息.