王　勇，劉　斌

(1. 徐州醫(yī)學(xué)院，江蘇 徐州 221042；2. 徐州醫(yī)學(xué)院附屬連云港市東方醫(yī)院，江蘇 連云港 222042；3. 徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，江蘇 徐州 221042)

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HCV核心蛋白對(duì)肝癌細(xì)胞系SMMC-7721增殖作用的研究

王勇1，2，劉斌3

(1. 徐州醫(yī)學(xué)院，江蘇 徐州 221042；2. 徐州醫(yī)學(xué)院附屬連云港市東方醫(yī)院，江蘇 連云港 222042；3. 徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，江蘇 徐州 221042)

[摘要]目的探討HCV核心蛋白對(duì)肝癌細(xì)胞系SMMC-7721的增殖作用。方法將空載質(zhì)粒(對(duì)照組)和HCV核心蛋白重組質(zhì)粒(實(shí)驗(yàn)組)分別轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系SMMC-7721，提取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞RNA、蛋白質(zhì)，比較2組細(xì)胞HCV核心蛋白mRNA、蛋白表達(dá)水平，收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清液，ELLSA檢測(cè)2組細(xì)胞上清液HCV核心蛋白表達(dá)差異，采用MTT檢測(cè)2組細(xì)胞增殖率，并采用transwell檢測(cè)2組細(xì)胞侵襲和遷移情況。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞HCV核心蛋白mRNA、蛋白表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組(P均<0.05)，同時(shí)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞上清液HCV核心蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖率明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞侵襲細(xì)、遷移細(xì)胞數(shù)均明顯高于對(duì)照組(P均<0.05)。結(jié)論HCV核心蛋白能夠顯著提高肝癌細(xì)胞系SMMC-7721增殖、侵襲及遷移。

[關(guān)鍵詞]HCV核心蛋白；肝癌細(xì)胞；增殖；侵襲；遷移

丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)核心蛋白是由HCV RNA核心區(qū)編碼的多功能蛋白，該病毒有包膜，是單股正鏈RNA病毒。HCV病毒的編碼區(qū)有且僅有一個(gè)開放閱讀框，能夠編碼3010—3030氨基酸序列蛋白前體。HCV核心蛋白共含有191個(gè)氨基酸，其既是病毒的核殼成分，又可調(diào)節(jié)病毒的啟動(dòng)子活性[1-2]。在慢性丙型肝炎、肝硬化及肝癌的致病過程中HCV核心蛋白具有重要致病作用，其可通過影響線粒體功能、細(xì)胞間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及與宿主細(xì)胞蛋白的直接作用參與細(xì)胞增殖和凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞周期異常[3-5]，但是HCV核心蛋白導(dǎo)致肝癌發(fā)生的機(jī)制仍不清楚。為了進(jìn)一步研究HCV核心蛋白在肝癌發(fā)病中的機(jī)制，本研究使用HCV核心蛋白的重組質(zhì)粒及空載質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染人源肝癌細(xì)胞系SMMC-7721，檢測(cè)2組細(xì)胞及細(xì)胞上清HCV核心蛋白的表達(dá)量，同時(shí)檢測(cè)2組細(xì)胞的增殖能力，分析比較2組細(xì)胞的增殖能力差異，探究HCV核心蛋白對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響。

1實(shí)驗(yàn)資料

1.1實(shí)驗(yàn)材料SMMC-7721細(xì)胞系：購(gòu)自上海生命科學(xué)研究所，在DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen)+胎牛血清10%(美國(guó)Gibco公司)，37 ℃，2.5% CO2孵箱中培養(yǎng)；質(zhì)粒：重組質(zhì)粒pcDNA3.0-C-EGFP及空載質(zhì)粒pcDNA3.0(-)購(gòu)于上海生命科學(xué)研究所；HCV核心蛋白ELLSA檢測(cè)試劑盒、MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒、Transwell小室購(gòu)于南京建成生物公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染于轉(zhuǎn)染前24 h將SMMC-7721細(xì)胞(2×105mL-1)接種在6孔板采用Lipofectamine 2000將重組質(zhì)粒和空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后提取細(xì)胞RNA，轉(zhuǎn)染72 h后提取細(xì)胞蛋白。

1.2.2HCV核心蛋白mRNA表達(dá)的檢測(cè)轉(zhuǎn)染48 h后采用Trizol提取2組細(xì)胞總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按1 μg 將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，RT-PCR檢測(cè)HCV核心蛋白mRNA表達(dá)水平，HCV核心蛋白引物：上游5’-CGCGGATCCATGAGCACAAATCC-3’，下游5’-CCGGAATTCGCAACCGGGC-3’; GAPDH:上游5’-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3’，下游5’-GGGTCATTGATGGCAACAATATC-3’；反應(yīng)體系(20 μL)：SYBR染料10 μL，ddH2O 8.6 μL，上游0.6 μL，下游0.6 μL，cDNA 0.2 μL。

1.2.3HCV核心蛋白表達(dá)的檢測(cè)采用Western blot檢測(cè)HCV核心蛋白表達(dá)水平，于轉(zhuǎn)染72 h后提取2組細(xì)胞蛋白，每孔蛋白上樣量40 μg，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉(BSA)，1∶1 000稀釋HCV核心蛋白一抗，4 ℃孵育過夜，TBS-T洗滌3遍，每遍15 min，加入二抗(兔抗)常溫孵育2 h，顯影液顯色，以β-actin為內(nèi)參。

1.2.4培養(yǎng)液上清HCV核心蛋白的檢測(cè)于轉(zhuǎn)染72 h收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清(100 μL)，于96孔板中4 ℃孵育過夜，硝酸鹽緩沖液洗滌3次，37 ℃封閉1 h，TBS-T洗滌3次，HCV核心蛋白一抗(10 μL/孔)，37 ℃孵育1 h，將96孔板內(nèi)液體吸干，TBS-T洗滌3次，采用ELISA試劑盒檢測(cè)表達(dá)量。

1.2.5細(xì)胞增殖率的檢測(cè)將轉(zhuǎn)染72 h的細(xì)胞種于96孔板，采用MTT方法檢測(cè)2組細(xì)胞增殖情況，于570 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度值，每組細(xì)胞設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，且平行進(jìn)行3次試驗(yàn)。增殖率=(實(shí)驗(yàn)組-對(duì)照組)/對(duì)照組×100%。

1.2.6細(xì)胞侵襲和遷移的檢測(cè)將100 μL Matrigel加置于transwell上室，37 ℃，2 h。加入轉(zhuǎn)染72 h的細(xì)胞(1×105mL-1)懸液，于下室加完全培養(yǎng)基，置于孵箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，去除上室Matrigel及未侵襲的細(xì)胞。采用多聚甲醛固定細(xì)胞10 min，Giemsa染色15 min，于顯微鏡下(200×)記錄侵襲細(xì)胞數(shù)，每孔取8個(gè)視野的平均值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 13.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.12組HCV核心蛋白mRNA及蛋白表達(dá)水平比較實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞HCV核心蛋白mRNA及蛋白水平均顯著高于對(duì)照組(P均<0.05)。見表1。

表1　2組HCV核心蛋白mRNA和蛋白

注：①與對(duì)照組相比，P<0.05。

2.22組細(xì)胞培養(yǎng)上清液HCV核心蛋白表達(dá)水平比較實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞上清液HCV核心蛋白表達(dá)水平為(4.61±1.09)μg/mL，對(duì)照組為(14.78±2.33)μg/mL，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.32組細(xì)胞增殖率比較實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖率為(49.6±6.7)%，對(duì)照組為(19.8±2.5)%，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.42組細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移情況比較實(shí)驗(yàn)組侵襲細(xì)胞數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)均明顯高于對(duì)照組(P均<0.05)。見表2。

表2　2組細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移情況比較±s，104個(gè))

注：①與對(duì)照組相比，P<0.05。

3討論

HCV核心蛋白與其他HCV蛋白相比，氨基酸序列高度保守，是組成病毒核衣殼的重要結(jié)構(gòu)蛋白[6]。HCV核心蛋白除形成核衣殼外，還可與病毒本身或宿主細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)合，形成二聚體或多聚體，調(diào)節(jié)病毒自身及宿主某些蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄及翻譯過程[7-8]。HCV核心蛋白結(jié)合重要調(diào)節(jié)蛋白，能夠直接影響宿主細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、脂質(zhì)代謝等過程，因此HCV核心蛋白與肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[9]。有研究表明在HepG2細(xì)胞系中HCV核心蛋白可通過抑制Jak-STAT通路的活化，下調(diào)ISGF-3水平，從而降低IFN-α的產(chǎn)生和應(yīng)答，這與IFN-α在HCV感染治療中臨床應(yīng)答率低息息相關(guān)[10]。HCV核心蛋白參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，并誘導(dǎo)、抑制凋亡，如死亡受體Fas家族、Bcl-家族等；HCV-core是HCV蛋白的核心，其各種亞型均高度保守[11-12]。HCV核心蛋白參與了細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、脂質(zhì)代謝，同時(shí)影響著細(xì)胞的死亡、凋亡以及增值。細(xì)胞維持正常生長(zhǎng)發(fā)育的重要條件就是細(xì)胞周期，多種蛋白參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)周期，包括p53、p21、pRb、E2f、c-Myc、cyclin D等，十分復(fù)雜[13]。相關(guān)研究表明，HCV核心蛋白能夠影響細(xì)胞生長(zhǎng)周期，但是實(shí)驗(yàn)條件不同或使用的細(xì)胞品系不同，所得到的結(jié)果也不盡相同。此外，HCV核心蛋白能顯著激活Wnt/β信號(hào)通路，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞系SMMC-7721的增長(zhǎng)[14]。

肝臟疾病發(fā)生發(fā)展的主要過程是慢性肝炎、肝硬化、肝癌，HCV的慢性持續(xù)感染能夠引起慢性肝炎、肝硬化，但是HCV是如何誘發(fā)肝臟疾病呢？相關(guān)研究表明，HCV核心蛋白能夠破壞細(xì)胞的生長(zhǎng)周期，導(dǎo)致細(xì)胞在分裂時(shí)滯留在G1期，無法進(jìn)入S期，從而使得HCV能夠潛伏在G0/G1期的細(xì)胞內(nèi)，G0期的細(xì)胞能夠維持長(zhǎng)期不增殖的狀態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞長(zhǎng)期處于HCV病毒感染的狀態(tài)，這樣宿主細(xì)胞會(huì)不斷地被損傷，甚至發(fā)生基因突變[15]。但是當(dāng)宿主細(xì)胞被某些生長(zhǎng)因子或其他增殖信號(hào)激活，又能夠進(jìn)入S期進(jìn)行增殖，導(dǎo)致大量HCV病毒被不斷地復(fù)制，最終誘發(fā)慢性肝炎、肝硬化，甚至肝癌[16-17]。

本研究重點(diǎn)集中在HCV核心蛋白對(duì)人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721增殖的作用，將HCV核心蛋白重組質(zhì)粒及空載對(duì)照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞HCV核心蛋白表達(dá)情況，觀察轉(zhuǎn)入HCV核心蛋白后SMMC-7721的增殖、侵襲及遷移能力的變化。本研究提取轉(zhuǎn)入HCV核心蛋白質(zhì)粒組細(xì)胞和空轉(zhuǎn)質(zhì)粒組細(xì)胞的蛋白和RNA，Western Blot 及RT-PCR結(jié)果顯示，HCV核心蛋白mRNA、蛋白表達(dá)水平均明顯高于空載組細(xì)胞。此外本研究采用ELLSA試劑盒檢測(cè)2組細(xì)胞上清HCV核心蛋白含量，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞上清HCV核心蛋白也明顯高于對(duì)照組，且差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果在蛋白水平和RNA水平上證實(shí)本研究采用的HCV核心蛋白質(zhì)粒能夠穩(wěn)定表達(dá)HCV核心蛋白。本研究采用MTT檢測(cè)2組細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖率明顯高于對(duì)照組；Transwell結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)均明顯高于對(duì)照組，表明當(dāng)SMMC-7721細(xì)胞表達(dá)HCV核心蛋白后，其增殖及遷移能力均較對(duì)照組大大增強(qiáng)。

綜上所述，HCV核心蛋白能顯著促進(jìn)SMMC-7721細(xì)胞增殖、侵襲及遷移能力，因此可推斷，HCV核心蛋白感染與肝癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。將研究目光聚焦在HCV核心蛋白表達(dá)量上或許能為將來臨床治療慢性肝炎、肝硬化或肝癌提供新的治療靶點(diǎn)。然而肝癌患者的臨床治療預(yù)后較差，手術(shù)和化療以及生物治療均是治療肝癌患者的重要治療方式，因此肝癌的治療是一個(gè)綜合治療的過程，不斷改進(jìn)和完善這個(gè)綜合治療的每個(gè)環(huán)節(jié)是提高肝癌患者臨床療效并進(jìn)一步改善患者預(yù)后的基礎(chǔ)，而目前手術(shù)和化療方面的治療手段已經(jīng)相對(duì)成熟，較難取得突破，微觀生物治療是目前研究的熱點(diǎn)，需要臨床同仁進(jìn)一步探索，一方面對(duì)于了解和掌握肝癌的發(fā)病和病情進(jìn)展機(jī)制具有重要意義，另一方面可以為臨床評(píng)估肝癌患者的病情及指導(dǎo)臨床治療方案提供幫助和參考。

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doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.21.020

[中圖分類號(hào)]R735.7

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]B

[文章編號(hào)]1008-8849(2016)21-2337-03

[收稿日期]2015-12-10