任　爽,張　杰

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院， 遼寧 沈陽 110001)

?

論著

毛蕊異黃酮抗肝星狀細(xì)胞活化的作用機制研究

任爽,張杰

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院， 遼寧 沈陽 110001)

[摘要]目的觀察毛蕊異黃酮對TGF-β1/Smads信號通路的影響，探討毛蕊異黃酮抗肝星狀細(xì)胞活化的作用機制。方法以人肝星狀細(xì)胞株(LX-2)為研究對象，采用高內(nèi)涵系統(tǒng)觀察細(xì)胞增殖 (EdU)及細(xì)胞內(nèi)F-actin骨架的聚合情況，RT-PCR法檢測細(xì)胞I型膠原(Col-Ⅰ)、α-SMA、 TGF-β1 mRNA表達(dá)水平，Wstern-blot法檢測細(xì)胞內(nèi)p-Smad2、Smad2及Smad7蛋白表達(dá)水平。結(jié)果TGF-β1可顯著促進(jìn)LX-2細(xì)胞增殖、活化，EdU陽染細(xì)胞明顯增加，α-SMA、TGF-β1、p-Smad2及Col-Ⅰ mRNA 或蛋白表達(dá)顯著增加(P均<0.05)，Smad7表達(dá)顯著下降；毛蕊異黃酮可顯著降低TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2中EdU陽染細(xì)胞率以及α-SMA、p-Smad2與 Col-Ⅰ的mRNA或蛋白表達(dá)(P均<0.05)，顯著提高Smad7蛋白表達(dá)，且作用與TβRI激酶抑制劑SB-431542相當(dāng)。結(jié)論毛蕊異黃酮可顯著抑制肝星狀細(xì)胞活化，其機制與抑制TGF-β1、p-Smad2的表達(dá)，提高Smad7蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制TGF-β1/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]毛蕊異黃酮，肝纖維化，肝星狀細(xì)胞，TGF-β1/Smads 信號通路

肝纖維化是組織損傷導(dǎo)致的愈合反應(yīng)，是諸多慢性肝病發(fā)展為肝硬化的重要病理過程?，F(xiàn)代分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，肝星狀細(xì)胞(HSC)的活化及表型改變是其核心事件，轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1是致纖維化的關(guān)鍵細(xì)胞因子。TGF-β1的生物學(xué)效應(yīng)是通過其激活的下游信號如Smads蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其作用于靶基因，能促進(jìn)膠原的合成[1]。黃芪是一味常用的傳統(tǒng)中藥，其可用于治療各類慢性肝病，而毛蕊異黃酮(CA)是從黃芪中提取的單體成分，被認(rèn)為是黃芪黃酮類主要活性成分，其具有明確的抗氧化作用[2-3]。本研究以人肝星狀細(xì)胞株LX-2為研究對象，觀察CA對肝星狀細(xì)胞活化的影響，旨在闡釋其調(diào)控TGF-β1/Smads信號通路的作用機制。

1實驗資料

1.1細(xì)胞人肝星狀細(xì)胞株LX-2 獲贈于上海中醫(yī)藥大學(xué)。

1.2藥物CA為西安鴻生生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，含量≥90%，采用中藥指紋圖譜質(zhì)量監(jiān)控技術(shù)控制質(zhì)量。

1.3主要試劑轉(zhuǎn)化生長因子受體(TβR)-Ⅰ激酶抑制劑 SB-431542, 購自TOCRIS Bioscience(USA)；重組人TGF-β1(reconstituted with sterile 4 mmol/L HCl containing 1 mg/mL BSA toa final concentration of 1 μg/mL) 購自R&D Systems(USA)； DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清購自Gibico(USA)；EDU細(xì)胞增殖試劑盒，購自廣州銳博科技有限公司；兔單克隆I型膠原抗體,購自SIGMA-ALDRICH(USA)；兔單克隆抗體抗磷酸化Smad2、Smad2,購自CST公司(USA)；兔單克隆抗體抗Smad7抗體,購自Epetomics；RNA提取試劑盒及First strand cDNA 合成試劑盒,購自Fermentas, St. Leon-Roth(德國)；SYBR Green Real Time PCR 試劑盒,購自TakaRa Biotech(日本)； RT-PCR引物序列由大連寶生物設(shè)計合成。

1.4方法

1.4.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理LX-2細(xì)胞培養(yǎng)于5% CO2、濕度95%、10%FBS/高糖DMEM,18 h后更換為含0.5%血清的DMEM孵育。

1.4.2細(xì)胞活力檢測實驗分為對照組及CA 30，60，120，240，480 μmol/L組。將1.4.1正常培養(yǎng)18 h后的LX-2細(xì)胞5 000個/孔接種于96孔板，對照組培養(yǎng)液為0.5%FBS/DMEM，CA各組加入不同濃度的CA藥液，經(jīng)過24 h孵育后，棄培養(yǎng)液，加入0.5 mg/mL MTT液，孵育4 h，小心吸棄工作液，加入DMSO 100 μL/孔至充分溶解，于酶標(biāo)儀490 nm吸收波長檢測吸光值。

1.4.3高內(nèi)涵多指標(biāo)細(xì)胞毒性檢測實驗分為對照組及CA 30，60，120，240 μmol/L組。將1.4.1正常培養(yǎng)18 h后的LX-2 細(xì)胞5 000個/孔接種于96孔板，對照組培養(yǎng)液為0.5%FBS/DMEM，CA各組加入不同濃度的CA藥液，經(jīng)過24 h孵育后，棄培養(yǎng)上清，每孔加入40 μL預(yù)熱(37 ℃)的通透性染液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min。吸棄通透性染液，每孔加入50 μL預(yù)熱的4%甲醛固定液，室溫下置通風(fēng)柜內(nèi)固定15 min。吸棄固定液，PBS洗滌2次，每孔加50 μL細(xì)胞核染液室溫避光孵育5 min，吸棄染核液，PBS洗滌2次，每孔加入200 μL PBS，ArrayScan VTI HCS Reader采集圖像，Multiparameter Cytotoxicity Bio Application Software對圖像進(jìn)行分析。

1.4.4高內(nèi)涵EdU摻入法細(xì)胞增殖檢測實驗分為對照組、TGF-β1(2.5 ng/mL)組、TGF-β1(2.5 ng/mL)+CA 30 μmol/L組、TGF-β1(2.5 ng/mL)+ CA 60 μmol/L組、TGF-β1(2.5 ng/mL)+ CA 120 μmol/L組。將1.4.1正常培養(yǎng)18 h后的LX-2 細(xì)胞5 000個/孔接種于96孔板，在相應(yīng)條件下孵育24 h后，棄培養(yǎng)液，每孔加入50 μmol/L EdU溶液100 μL孵育2 h，4%多聚甲醛固定15 min，0.2%甘氨酸孵育10 min，PBS洗5 min×2次，0.5% Triton X-100透化10 min，PBS洗5 min，Appllo ?染色反應(yīng)液避光孵育30 min，PBS洗5 min，0.5% Triton X-100 孵育10 min×3次，Hoechst避光孵育10 min，PBS洗5 min×2次，ArrayScan VTI HCS Reader采集圖像，Cell Health Profiling BioApplication Software 對圖像進(jìn)行分析。

1.4.5高內(nèi)涵細(xì)胞免疫熒光染色實驗分組同1.4.4，孵育結(jié)束后，棄培養(yǎng)液，每孔加入50 μL 4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS洗滌，以0.5% Triton X-100 孵育10 min，F(xiàn)-actin 染色37 ℃孵育1 h，PBS洗滌后，滴加DAPI染核5 min，PBS洗滌，ArrayScan VTI HCS Reader采集圖像，Cell Health Profiling BioApplication Software 對圖像進(jìn)行分析。

1.4.6LX-2細(xì)胞中α-SMA mRNA、Col-Ⅰ mRNA和TGF-β1mRNA表達(dá)檢測采用Real-time PCR法檢測。實驗分為對照組、TGF-β1(2.5 ng/mL)組、TGF-β1(2.5 ng/mL)+ CA(120 μmol/L)組、TGF-β1(2.5 ng/mL) + SB-431542(10 μmol/L)組，各組LX-2細(xì)胞在相應(yīng)條件下培養(yǎng)24 h后，參照RNeasy Mini Kit操作說明提取RNA，檢測RNA濃度及完整性，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行cDNA 合成，-20 ℃保存?zhèn)溆?。Real-time PCR在Rotor-Gene 3000或ABI完成，PCR反應(yīng)體系為cDNA 1 μL，SYBR Green 10 μL，引物2 μL，雙蒸水7 μL。反應(yīng)條件為95 ℃ 1 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。

1.4.7LX-2細(xì)胞中p-Smad2、Smad2、Smad7蛋白表達(dá)檢測采用Wstern-blot法檢測。實驗分組同1.4.6，各組LX-2細(xì)胞在相應(yīng)條件下培養(yǎng)24 h后采用RIPA緩沖液裂解，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清液，采用十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠(濃度8%～10%)電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜。5%脫脂奶粉封閉，第一抗體4 ℃孵育過夜，紅外染料標(biāo)記的第二抗體室溫下孵育1 h，采用Odyssey紅外掃描儀掃描、分析蛋白條帶。

2結(jié)果

2.1CA對LX-2細(xì)胞活力的影響MTT實驗檢測顯示，與對照組相比，240 μmol/L和480 μmol/L CA對細(xì)胞增殖具有顯著抑制作用(P均<0.05)，提示兩濃度可能對細(xì)胞具有毒性作用。見圖1。

2.2CA對LX-2細(xì)胞毒性的影響CA 240 μmol/L組孵育24 h細(xì)胞膜通透性明顯高于對照組(P<0.05)，提示有細(xì)胞毒性；而CA其他組細(xì)胞膜通透性與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，表明對細(xì)胞無毒性作用 。見圖2。

2.3CA對LX-2細(xì)胞增殖的影響TGF-β1可顯著促進(jìn)LX-2細(xì)胞的增殖，EdU陽染細(xì)胞比率明顯高于對照組(P<0.05)；而TGF-β1+ CA 120 μmol/L組EdU陽染細(xì)胞比率顯著低于TGF-β1組(P<0.05)，提示120 μmol/L CA 可以顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞增殖。見圖3～8。

2.4CA對LX-2細(xì)胞表達(dá)F-actin的影響高內(nèi)涵檢測見到，LX-2在TGF-β1的刺激下，其細(xì)胞內(nèi)F-actin聚合成粗大的纖維束，沿細(xì)胞長軸平行排列，分布均勻，呈明顯活化狀態(tài)；而TGF-β1+ CA120 μmol/L組F-actin染色明顯變淡、模糊，分布不均，見圖 9～13。各組骨架平均熒光值變化與圖片觀測趨勢一致，見圖14。提示TGF-β1誘導(dǎo)了明顯的LX-2活化，而120 μmol/L CA可以有效抑制TGF-β1引起的LX-2活化。

圖1　各組LX-2 細(xì)胞活力

圖2　各組LX-2 細(xì)胞膜通透性

圖3　各組LX-2 細(xì)胞增殖情況

圖4　對照組LX-2細(xì)胞增殖染色表現(xiàn)

圖5　TGF-β1組LX-2細(xì)胞增殖染色表現(xiàn)

圖6　TGF-β1+ CA 120 μmol/L組LX-2細(xì)胞增殖染色表現(xiàn)

圖7　TGF-β1+ CA 60 μmol/L組LX-2細(xì)胞增殖染色表現(xiàn)

圖8　TGF-β1+ CA 30 μmol/L組LX-2細(xì)胞增殖染色表現(xiàn)

圖9　對照組LX-2細(xì)胞中F-actin表達(dá)情況

2.5CA對TGF-β1誘導(dǎo)LX-2細(xì)胞表達(dá)α-SMA、Col-Ⅰ 和TGF-β1mRNA的影響TGF-β1組α-SMA mRNA、Col-Ⅰ mRNA和TGF-β1mRNA表達(dá)量均明顯高于對照組(P均<0.05)，TGF-β1+ CA 120 μmol/L組α-SMA mRNA、Col-Ⅰ mRNA和TGF-β1mRNA表達(dá)量均明顯低于TGF-β1組(P均<0.05)，與SB-431542組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見圖15～17。

圖10　TGF-β1組LX-2細(xì)胞中F-actin表達(dá)情況

圖11　TGF-β1+ CA 120 μmol/L組LX-2細(xì)胞中

圖12　TGF-β1+ CA 60 μmol/L組LX-2細(xì)胞中F-actin表達(dá)情況

圖13　TGF-β1+ CA 30μmol/L組LX-2細(xì)胞中F-actin表達(dá)情況

2.6CA對LX-2細(xì)胞中p-Smad2、Smad2及Smad7蛋白表達(dá)的影響各組Smad2蛋白表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但TGF-β1可顯著促進(jìn)p-Smad2蛋白表達(dá)，引起Smad7的蛋白表達(dá)下調(diào)；120 μmol/L CA和SB-431542可以顯著抑制p-Smad2蛋白的表達(dá)，顯著提高Smad7蛋白的表達(dá)。見圖18。

圖14　各組骨架平均熒光值

圖15　各組LX-2細(xì)胞中α-SMA mRNA表達(dá)量

圖16　各組LX-2細(xì)胞中Col-Ⅰ mRNA表達(dá)量

圖17　各組LX-2細(xì)胞中TGF-β1 mRNA表達(dá)量

3討論

肝纖維化指肝纖維組織彌漫性增生，抑制肝纖維化可以有效防治肝硬化、肝癌的發(fā)生。肝星狀細(xì)胞的活化在肝纖維化進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用，活化的肝星狀細(xì)胞是肝纖維化中ECM的主要來源。抑制肝星狀細(xì)胞的激活、增殖及膠原合成，對肝纖維化防治有重要價值[4-7]。F-actin可反映肝星狀細(xì)胞活化程度，而α-SMA和Col-Ⅰ表達(dá)增加提示肝星狀細(xì)胞活化、肝纖維進(jìn)展。

圖18　各組LX-2細(xì)胞中p-Smad2、Smad2及Smad7蛋白表達(dá)情況

TGF-β1是肝纖維化發(fā)生的重要刺激因子，促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的活化，而TGF-β1生物效應(yīng)的發(fā)揮必須通過特定的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，該過程已基本明了。TGF-β1胞外激活后，與其胞膜上特異性受體(TGF-β type Ⅰ/Ⅱ Receptor,TβRⅠ/Ⅱ)結(jié)合，繼而主要由 Smad蛋白介導(dǎo)胞內(nèi)信號傳遞。Smad蛋白分為3類：①受體調(diào)控型，與TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的是Smad2/3；②共同型，主要是Smad 4；③抑制型， Smad7等。Smad2/3是TβRⅠ型受體胞內(nèi)激酶的特異性底物，經(jīng)受體激酶磷酸化后與Smad 4結(jié)合，轉(zhuǎn)位細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)控細(xì)胞目的基因表達(dá)，在TGF-β1胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起關(guān)鍵作用。Smad7作為該通路負(fù)性調(diào)控因子，主要通過與TβR-Ⅰ結(jié)合，阻止Smad蛋白的磷酸化，進(jìn)而抑制了TGF-β/Smad通路的信號傳導(dǎo)[8-9]。

目前尚缺乏有效的抗肝纖維化化學(xué)藥物[10]。中醫(yī)藥治療慢性肝病具有悠久的歷史，已經(jīng)有大量體內(nèi)體外研究表明中藥復(fù)方或者中藥提取物可以有效對抗肝纖維化。而采用效應(yīng)跟蹤、從復(fù)方及藥物化學(xué)組分及成分的角度探索復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)是當(dāng)前該領(lǐng)域的重要研究思路之一[11]。黃芪湯(《普濟(jì)本事方》)又名黃芪六一湯(《太平惠民和劑局方》)，由黃芪、甘草、大棗3味藥組成，治諸虛不足、肢體勞倦、心中煩悸、唇口干渴、食少面黃，該方作為一古典方劑，廣泛應(yīng)用于慢性肝病的治療中；多中心、隨機、雙盲、對照試驗以及動物實驗均提示其良好的抗肝纖維化作用[12-15]。本研究采用體外實驗，以TGF-β1刺激LX-2星狀細(xì)胞活化模型，應(yīng)用SB-431542這一特異性TβR-Ⅰ激酶抑制劑作為陽性對照，選用有效且無毒劑量的CA(120 μmol/L)作為干預(yù)因素，實驗結(jié)果提示CA和SB-431542可以有效抑制TGF-β1引起的LX-2的增殖、活化，即下調(diào)EdU陽染細(xì)胞率及a-SMA、F-actin和Col-Ⅰ表達(dá)；顯著抑制TGF-β1、p-Smad2的表達(dá)，提高Smad7表達(dá)，提示CA影響TGF-β1刺激星狀細(xì)胞活化與抗纖維化的主要機制在于抑制TGFβ/Smads信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。本實驗雖已了解CA干預(yù)TGFβ/Smads信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的部分重要作用，但是對于CA通過何種途徑抑制TGFβ1mRNA的轉(zhuǎn)錄，是否影響TGF-β1胞外激活與HSCs信號跨膜以及HSCs胞內(nèi)其他信號分子等，尚需進(jìn)一步研究，以期系統(tǒng)明確CA干預(yù)TGF-β1/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗肝纖維化的關(guān)鍵作用機制。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Friedman SL. Mechanisms of disease: mechanisms of hepatic fibrosis and therapeutic implications[J]. Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol，2004，1(2):98

[2]張莎莎，張旭，呂文良. 黃芪防治肝纖維化的研究現(xiàn)狀[J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2013，31(11):2384

[3]張薔,高文遠(yuǎn),滿淑麗. 黃芪中有效成分藥理活性的研究進(jìn)展[J]. 中國中藥雜志，2012,37(21)：3203-3207

[4]劉成海，慕永平，劉平. 肝纖維化中西醫(yī)結(jié)合治療進(jìn)展與發(fā)展方向[J]. 中華消化病與影像雜志，2014，4(6)：1-4

[5]Kisseleva T,Brenner DA. Anti-fibrogenic strategies and the regression of fibrosis[J]. Best Pract Res Clin Gastroenterol,2011,25(2):305-317

[6]郝立然，李娜，李海玲，等. 復(fù)方中藥治療慢性病毒性肝炎肝纖維化的Meta分析[J]. 臨床醫(yī)藥實踐，2011,20(7):494-496

[7]雷娜，鄭仕中，陸茵. 活血化瘀類中藥防治肝纖維化的機制及研究進(jìn)展[J]. 中華中醫(yī)藥雜志，2010,25(2):265-269

[8]Nakao A,Afrakhte M,Moren A,et al. Identification of Smad7, a TGFbeta-inducible antagonist of TGF-beta signalling[J]. Nature,1997,389(6651):631-635

[9]Argentou N,Germanidis G,Hytiroglou P,et al. TGF-β signaling is activated in patients with chronic HBV infection and repressed by SMAD7 overexpression after successful antiviral treatment[J]. Inflamm Res，2016，65(5)：355-365

[10] Yoon YJ,Friedman SL,Lee YA. Antifibrotic Therapies: Where Are We Now?[J]. Semin Liver Dis,2016,36(1):87-98

[11] 張霞. 黃芪化學(xué)成分及藥理作用概述[J]. 實用中醫(yī)藥雜志，2013,29(7):608-609

[12] 張琴，劉平，章浩偉，等. 900例肝炎后肝硬化中醫(yī)證候判別模式的研究[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2006，26(8):694-697

[13] 仝欣,陳高峰,陸雁，等. 基于均勻設(shè)計分析黃芪湯活性組分抗二甲基亞硝胺大鼠肝纖維化的配伍作用[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2011,31(10):1389-1393

[14] Du JX，Sun MY，Du GL，et al. Ingredients of Huangqi decoction slow biliary fibrosis progression by inhibiting the activation of transforming growth factor beta signaling pathway[J]． BMC Complement Altern Med，2012,12(1):33

[15] 杜琴，胡兵，沈克平. 抗癌中藥配伍研究[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志，2010,16(13):232-235

[作者簡介]任爽，女，博士，主治醫(yī)師，研究方向為中醫(yī)藥抗肝纖維化基礎(chǔ)與臨床。 [通信作者]張杰，E-mail:zhangjie945@126.com

[基金項目]遼寧省科學(xué)技術(shù)廳自然科學(xué)基金項目(201202262)；遼寧省名老中醫(yī)藥專家傳承工作室建設(shè)項目

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.21.001

[中圖分類號]R-33

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)21-2281-05

[收稿日期]2016-02-15

Study on the mechanism of Calycosin in inhibition of hepatic stellate cell activation

REN Shuang, ZHANG Jie

(The First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning, China)

Abstract:Objective It is to observe the influence of Calycosin (CA) in the signaling pathway of TGF- β1/Smads, and investigate its mechanism of action in inhibition of hepatic stellate cell activation. Methods Human hepatic stellate cell line LX-2 cells were taken as the research object, the high content system was used to observe the cell proliferation (EdU) and the aggregation of F-actin skeleton in the cell, RT-PCR method was used to detect the mRNA expression levels of collagen type I (Col-Ⅰ), α-SMA and TGF-β1, Wstern-blot method was used to detect the protein expression levels of p-Smad2, Smad2 and Smad7 in the cell. Results Compared to the control, the proliferation and activation of LX-2 was significantly promoted by TGF-β1, and the expression of mRNA or protein of EdU, F-action, α-SMA, TGF-β1, p-Smad2, Col-Ⅰ were significantly increased (all P<0.05), as well as the Smad7 was significantly decreased (P<0.05). The rate of EdU positive cells in LX-2 induced by TGF-β1 and the mRNA or protein expression of α-SMA, p-Smad2 and Col-Ⅰ were significantly reduced by CA (all P<0.05), and the expression of Smad7 protein was significantly increased (P<0.05), and the role was equivalent to TβRI kinase inhibitor SB-431542. Conclusion CA can significantly inhibit the activation of hepatic stellate cells, the mechanism is related to inhibiting the expression of TGF-β1 and p-Smad2, enhancing the expression of Smad7 protein, and then inhibiting the signal transduction of TGF-β1/Smads.

Key words:Calycosin; liver fibrosis; hepatic stellate cell; signaling pathway of TGF-β1/Smads