方志成，周昌娥，張浩明

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市太和醫(yī)院，湖北 十堰 442000)

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顱內(nèi)動脈瘤并心肌損傷與交感活性亢進(jìn)關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究

方志成，周昌娥，張浩明

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市太和醫(yī)院，湖北 十堰 442000)

[摘要]目的探討顱內(nèi)動脈瘤并心肌損傷與交感活性亢進(jìn)關(guān)系，以期明確其發(fā)病機(jī)制，尋找有效防治方法。方法選取80只日本大耳白兔，采用改良胰彈性蛋白酶誘導(dǎo)動脈瘤方法制作動脈瘤模型，根據(jù)心肌酶譜、心電圖變化等篩選心肌損傷動物并以此分為心肌損傷組和非心肌損傷組，經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附法測定2組術(shù)前及術(shù)后1，2，3周血漿去甲腎上腺素、腎上腺素濃度。術(shù)后3周處死動物，染料法熒光定量測定兔心肌組織中β2腎上腺素能受體mRNA表達(dá)情況。結(jié)果心肌損傷組術(shù)后血漿去甲腎上腺素、腎上腺素濃度均明顯高于術(shù)前(P均<0.05)，術(shù)后2周達(dá)峰值，第3周開始下降，而非心肌損傷組圍術(shù)期血漿去甲腎上腺素、腎上腺素濃度無明顯變化(P均>0.05)；同期組間比較，心肌損傷組血漿去甲腎上腺素、腎上腺素濃度均明顯高于非心肌損傷組(P均<0.05)。染料法熒光定量顯示心肌損傷組心肌局部組織中β2腎上腺素能受體mRNA表達(dá)量明顯低于非心肌損傷組(P<0.05)。結(jié)論動脈瘤并發(fā)心肌損傷可能與機(jī)體交感活性興奮甚至亢進(jìn)、兒茶酚胺大量釋放，引起心肌毒性損傷有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]顱內(nèi)動脈瘤；心肌損傷；交感活性；兒茶酚胺

臨床顱內(nèi)動脈瘤蛛網(wǎng)膜下腔出血患者易發(fā)生心血管并發(fā)癥，其以心律失常、心肌受損、心功能不全等為主要特點(diǎn)，導(dǎo)致病情復(fù)雜化[1-2]。目前其發(fā)生機(jī)制尚不明確，缺乏有效防治手段，導(dǎo)致住院時間延長、醫(yī)療費(fèi)用增加，明顯增加患者病死率，并易引發(fā)醫(yī)療糾紛[3-4]。本研究應(yīng)用改良胰彈性蛋白酶誘導(dǎo)動脈瘤方法制作顱內(nèi)動脈瘤動物模型，并根據(jù)心電圖、心肌損傷標(biāo)志物檢查等篩選合并心肌損傷動物，探討交感神經(jīng)興奮、亢進(jìn)與心肌損傷發(fā)生的關(guān)系，旨在明確顱內(nèi)動脈瘤并發(fā)心肌損傷的病理生理機(jī)制，為進(jìn)一步尋找防治策略奠定理論基礎(chǔ)。

1實(shí)驗(yàn)資料

1.1實(shí)驗(yàn)動物健康日本大耳白兔80只，3～6月齡，體質(zhì)量2～2.5 kg，雌雄不限，湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物合格證號：NO.42000900000184。實(shí)驗(yàn)前所有動物自由飲水、進(jìn)食。

1.2方法

1.2.1顱內(nèi)動脈瘤模型制作經(jīng)兔耳緣靜脈給予10%烏拉坦靜脈麻醉，沿頸部正中切口，分離筋膜，暴露氣管，在氣管右側(cè)游離出右頸總動脈(RCCA)，繼續(xù)向近心端方向游離直至右頸總動脈與右鎖骨下動脈(RSCA)分叉處，在距RCCA與RSCA分叉處上方2.5 cm處，結(jié)扎RCCA，然后動脈瘤夾夾閉RCCA與RSCA分叉，在距RCCA與RSCA分叉上方1.5 cm處，用26 G靜脈留置針(內(nèi)徑0.6 mm，長度1.5 cm，流量15 mL/min)穿刺RCCA并注入75 IU豬胰彈性蛋白酶，最后松開RCCA遠(yuǎn)心端結(jié)扎，并移除動脈瘤夾[5]，注意觀察穿刺口滲血情況。術(shù)中因失血性休克死亡7只，成功制作動物模型73只。術(shù)后8 h開始進(jìn)水、食物，每日給予青霉素20萬IU肌注預(yù)防感染，觀察動物術(shù)后神志、肢體活動情況，并做記錄。

1.2.2研究分組對所有實(shí)驗(yàn)動物測定血漿肌鈣蛋白I、腦型利鈉肽濃度，行心臟超聲、心電圖等相關(guān)檢查，根據(jù)檢測結(jié)果將造模成功白兔分為心肌損傷組42只和非心肌損傷組31只。心肌損傷確定依據(jù)：心肌損傷標(biāo)志物升高、心電圖各導(dǎo)聯(lián)有ST段下移、抬高等，或心臟超聲發(fā)現(xiàn)心功能異常、室壁運(yùn)動異常等現(xiàn)象均認(rèn)為合并心肌損傷。

1.2.3血漿兒茶酚胺濃度檢測術(shù)前及術(shù)后1周、2周、3周經(jīng)兔耳緣靜脈取靜脈血4 mL,室溫血液自然凝固10～20 min，2 000～3 000 r/min離心20 min左右，收集上清，用ELSIA法測定不同時間血漿腎上腺素、去甲腎上腺素濃度。

1.2.4心肌組織中β2腎上腺素能受體mRNA檢測術(shù)后3周處死實(shí)驗(yàn)動物后，取小塊心肌組織，RNAsimple Total RNA Kit提取細(xì)胞總RNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取質(zhì)量，ND-1000(NanoDrop Technologies，USA)提取濃度和純度。BioBRK RT Kit迅速合成cDNA：20 μL總體系含1 μg RNA，2.5 μmol/L的Oligo(dT)18，1× RT緩沖液，1 mmol/L每種dNTP，100 IU的ReverTra Ace，5unit 的Super-RI，0.5 μL 的RT-Enhancer， 無RNase 水加至終體積。逆轉(zhuǎn)錄程序：42 ℃ 40 min，99 ℃ 5 min 滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。合成的cDNA用滅菌蒸餾水稀釋5倍，-20 ℃ 保存?zhèn)溆谩YBR GreenⅠ染料法實(shí)時熒光定量PCR法檢測β2腎上腺素能受體mRNA表達(dá)：以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，設(shè)計(jì)GAPDH和β2腎上腺素能受體基因熒光定量引物，為避免DNA污染，上下游引物設(shè)計(jì)位點(diǎn)均應(yīng)跨越基因的相鄰?fù)怙@子。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性8s，60℃退火及延伸32s，共進(jìn)行40個循環(huán)，結(jié)果采用2-△△CT法進(jìn)行分析。RT-PCR反應(yīng)體系10 μL:SYBR?Premix Ex Taq TMⅡ(2×)5 μL， ROX reference Dye Ⅰ(50×)0.2 μL， GAPDH or β3-AR Forward Primer(10 μM)0.4 μL，GAPDH or β3-AR Reverse Primer(10 μM)0.4 μL， cDNA 500 ng， ddH2O加至總體積到10 μL。置于ABI實(shí)時熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，評估心肌組織中β2腎上腺素能受體mRNA表達(dá)情況。

2結(jié)果

2.1造模動物情況心肌損傷組動物傷口恢復(fù)時間略慢于非心肌損傷組，進(jìn)食也稍差。但2組動物均可自由活動，傷口愈合良好，術(shù)后意識清楚，無肢體活動障礙。

2.2血漿兒茶酚胺濃度變化心肌損傷組術(shù)后血漿去甲腎上腺素、腎上腺素濃度均明顯高于術(shù)前(P均<0.05)，術(shù)后2周達(dá)峰值，第3周開始下降，而非心肌損傷組圍術(shù)期血漿去甲腎上腺素、腎上腺素濃度無明顯變化(P均>0.05)；同期組間比較，心肌損傷組血漿去甲腎上腺素、腎上腺素濃度均明顯高于非心肌損傷組(P均<0.05)。見表1。

2.3局部心肌組織中β2腎上腺素能受體mRNA表達(dá)情況非心肌損傷組與心肌損傷組β2腎上腺素能受體mRNA表達(dá)量分別為1.03±0.06和 0.79±0.03，心肌損傷組β2腎上腺素能受體mRNA表達(dá)量明顯低于非心肌損傷組(P<0.05)。

表1　2組不同時間兒茶酚胺濃度變化

注：①與術(shù)前比較，P<0.05；②與非心肌損傷組同期比較，P<0.05。

3討論

顱內(nèi)動脈瘤合并心肌損傷臨床常見，前期研究發(fā)現(xiàn)，顱內(nèi)動脈瘤蛛網(wǎng)膜下腔出血后中樞性交感神經(jīng)興奮，導(dǎo)致交感神經(jīng)末梢釋放去甲腎上腺素、腎上腺素，后者作用于心肌，發(fā)生兒茶酚胺毒性作用，終致心肌損傷[2]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，合并心肌損傷的顱內(nèi)動脈瘤動物模型，術(shù)后血漿腎上腺素、去甲腎上腺素濃度逐漸升高，術(shù)后2周達(dá)到高峰，術(shù)后3周開始下降；心肌損傷組心肌局部組織中β2腎上腺素能受體mRNA表達(dá)明顯下降，而非心肌損傷組則無上述變化。提示動脈瘤并發(fā)心肌損傷可能與機(jī)體交感活性興奮甚至亢進(jìn)、兒茶酚胺大量釋放有關(guān)。分析原因可能為：①交感神經(jīng)系統(tǒng)興奮，交感神經(jīng)末梢釋放大量腎上腺素、去甲腎上腺素等兒茶酚胺，其與心肌表面包括β2受體在內(nèi)的腎上腺素能受體結(jié)合，產(chǎn)生兒茶酚胺毒性作用，臨床出現(xiàn)心律失常、心電圖ST段變化、肌鈣蛋白等心肌損傷標(biāo)志物升高、甚至心肌室壁運(yùn)動異常等心功能不全表現(xiàn)[6-7]。②氧化應(yīng)激損傷。多個研究已經(jīng)明確，去甲腎上腺素可誘導(dǎo)體外細(xì)胞模型中心肌細(xì)胞損傷，導(dǎo)致心肌細(xì)胞超氧化物歧化酶(SOD)活力明顯降低，丙二醛(MDA)含量明顯升高，應(yīng)用腎上腺能受體阻斷藥后SOD升高而MDA含量明顯下降，說明機(jī)體交感神經(jīng)活性興奮可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)而導(dǎo)致心肌損傷[8-9]。③心肌冠脈血管功能失調(diào)。交感神經(jīng)興奮，血漿兒茶酚胺濃度升高，作用于心肌冠脈血管內(nèi)皮相應(yīng)受體，導(dǎo)致冠脈血管收縮、舒張功能失調(diào)，繼之心肌細(xì)胞缺氧缺血，心肌細(xì)胞電生理異常，臨床出現(xiàn)各種類型心律失常，心肌細(xì)胞缺血嚴(yán)重時，還會導(dǎo)致心肌細(xì)胞器質(zhì)性損傷，包括肌鈣蛋白I在內(nèi)的心肌損傷標(biāo)志物升高，心功能受損[10]。④心肌無菌性炎癥。動脈瘤蛛網(wǎng)膜下腔出血，體內(nèi)交感神經(jīng)末梢釋放大量兒茶酚胺，其通過免疫細(xì)胞上α、β腎上腺素能受體產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)作用[11]，激活機(jī)體心肌局部炎癥因子，炎癥遞質(zhì)大量釋放，心肌局部炎癥反應(yīng)綜合征與抗炎反應(yīng)綜合征比例失調(diào)，炎癥反應(yīng)劇烈，加劇心肌損傷。⑤能量代謝異常，心肌細(xì)胞能量不足。顱內(nèi)動脈瘤蛛網(wǎng)膜下腔出血合并心肌損傷時，機(jī)體應(yīng)激狀態(tài)下兒茶酚胺分泌增多，營養(yǎng)物質(zhì)代謝異常，血中糖酵解增強(qiáng)，產(chǎn)生乳酸增多，ATP下降，心肌細(xì)胞鈉鉀泵功能失常，心肌細(xì)胞收縮、舒張功能及電生理功能受損；另外應(yīng)激時，兒茶酚胺是較強(qiáng)的脂解激素，其介導(dǎo)β2受體激活，導(dǎo)致脂肪分解加速，酮體大量生成，心肌細(xì)胞能量來源不足，心肌受損[12]。⑥激素允許作用。哺乳動物體內(nèi)存在糖皮質(zhì)激素，通過經(jīng)典的基因組機(jī)制促進(jìn)兒茶酚胺的生物合成或增加血管平滑肌細(xì)胞膜上兒茶酚胺受體數(shù)量，及調(diào)節(jié)受體介導(dǎo)的細(xì)胞信息傳遞過程，從而增加心血管系統(tǒng)對兒茶酚胺縮血管物質(zhì)的敏感性[13]，在交感神經(jīng)興奮、亢進(jìn)的情況下，激素允許作用強(qiáng)化，擴(kuò)大兒茶酚胺心肌毒性作用，加劇心肌損傷。

本研究已初步證實(shí)顱內(nèi)動脈瘤蛛網(wǎng)膜下腔出血合并心肌損傷動物模型中，血漿腎上腺素、去甲腎上腺素濃度明顯上升，隨時間推移逐步上升直至術(shù)后2～3周，此時間動脈瘤正在形成，也易于合并心肌損傷，同時術(shù)后心肌局部組織中β2腎上腺素能受體mRNA表達(dá)明顯下降，說明交感活性亢進(jìn)、兒茶酚胺大量釋放甚至兒茶酚胺毒性是引起動脈瘤并發(fā)心肌損傷的重要原因，為今后尋找有效治療方法提供了理論依據(jù)。本研究不足之處在于：①動物模型交感神經(jīng)興奮、亢進(jìn)原因除與動脈瘤原發(fā)疾病有關(guān)外，手術(shù)創(chuàng)傷、機(jī)體應(yīng)激也是原因之一，兩方面因素疊加在一起是否會干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，手術(shù)早期這種影響可能更為突出？②本研究在頸部制作動脈瘤模型，雖然動脈瘤組織形態(tài)學(xué)、病理學(xué)特征與顱內(nèi)動脈瘤高度相似，但哺乳動物頸部存在頸動脈竇，頸部交感神經(jīng)分布豐富，動脈瘤在形成過程中可能也會誘發(fā)頸部交感神經(jīng)興奮，釋放兒茶酚胺，可能干擾研究。③目前關(guān)于交感神經(jīng)興奮、亢進(jìn)的臨床檢測方法不多，手段有限，不能全面、深入的觀察、分析交感神經(jīng)功能變化。④心肌損傷原因眾多，本研究僅關(guān)注交感神經(jīng)興奮所釋放的兒茶酚胺毒性對心肌損傷作用，除此以外尚有其他原因。⑤如果給予腎上腺素能受體阻滯劑如美托樂爾等，是否可以阻斷、逆轉(zhuǎn)、恢復(fù)心肌損傷，如此，則能更進(jìn)一步證明顱內(nèi)動脈瘤蛛網(wǎng)膜下腔出血并發(fā)心肌損傷與交感神經(jīng)興奮、亢進(jìn)之間關(guān)系。上述這些都需要今后進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Tada Y,Kanematsu Y,Kanematsu M，et al. A mouse model of intracranial aneurysm-technical considerations[J]. Acta Neurochir Suppl，2011，111(111):31-35

[2]方志成，周昌娥，鄭翔. 顱內(nèi)動脈瘤并蛛網(wǎng)膜下腔出血患者心肌損傷的變化[J]. 臨床心血管病學(xué)雜志，2011,27(8):606-608

[3]Bouzeghrane F,Naggara O,Kallmes DF，et al. In vivo experimental intracranial aneurysm models:a systematic review[J]. AJNR Am J Neuroradiol,2010，31(3):418-423

[4]吳靈潝，鄒捍東，夏文芳. 右美托咪定對膿毒癥患者心肌損傷的保護(hù)作用[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2014,23(29)：3281-3283

[5]王奎重，劉建民，黃清海. 改良的胰彈性蛋白酶誘導(dǎo)兔囊狀動脈瘤模型[J]. 中華神經(jīng)外科雜志,2010,26(8):744-747

[6]部俊清，楊偉，劉宗軍. 經(jīng)皮腎動脈去交感神經(jīng)治療中重度心力衰竭的臨床觀察[J]. 臨床心血管病雜志，2015，31(11)：1211-1214

[7]Kim YW,Neal D,Hoh BL，et al. Risk factors,incidence,and effect of cardiac failure and myocardial infarction in aneurysmal subarachnoid hemorrhage patients[J]. Neurosurgery，2013，72(6)：625-637

[8]Keiko S,Joji I,Yuichi H,et al. The role of norepinephrine and estradiol in the pathogenesis of cardiac wall motion abnormality associated with subarchnoid hemorrhage[J]. Stroke,2012,43(7):1897-1903

[9]方志成，周昌娥，鄭翔. 顱內(nèi)動脈瘤合并心肌損傷的臨床研究[J]. 陜西醫(yī)學(xué)雜志，2011,40(8)：962-964

[10] 徐斌，李紅莉. 心力衰竭中交感神經(jīng)激活的中樞機(jī)制[J]. 國際心血管病雜志，2014,41(5)：308-310

[11] Mruder N,Rabinstein A. Cardiovascular and pulmonary complications of aneurysmal subarachnoid hemorrhage[J]. Neurocrit Care，2011，15(2):257-269

[12] Heo WJ,Kang JH,Jeong WS，et al. Subarachnoid hemorrhage misdiagnosed as an acute ST elevation myocardial infarction[J]. Korean Circ J，2012，42(3):216-219

[13] 謝紅明. 顱內(nèi)動脈瘤患者圍拔管期應(yīng)用右美托咪定對應(yīng)激反應(yīng)和蘇醒質(zhì)量的影響[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2015，24(26)：2945-2947

[作者簡介]方志成，男，主任醫(yī)師，主要從事急危重癥研究。 [通信作者]周昌娥，E-mail:13593751009@139.com

[基金項(xiàng)目]湖北省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(2014CFB314)

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.22.006

[中圖分類號]R-332

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)22-2411-03

[收稿日期]2016-03-10

Experimental study of the relationship between myocardial injury of intracranial aneurysm and hyperfunction of sympathetic activity

FANG Zhicheng, ZHOU Chang’e，ZHANG Haoming

(TaiHe Hospital,HuBei University of Medicin，Shiyan 442000，Hubei,China)

Abstract:Objective It is to explore the relationship between myocardial injury of intracranial aneurysm and hyperfunction of sympathetic activity, thus to find out its mechanism and effective method for prevention and treatment. Methods 80 Japanese big ear rabbit were selected to establish aneurysm models by modified method of pancreatic elastase induction. According to the changes of myocardial enzyme spectrum, electrocardiogram (EKG) the myocardial injury animals were screened and divided into myocardial injury group and non-myocardial injury group.Plasma contents of noradrenaline (NE) and epinephrine (E) were determined by enzyme linked immunosorbent assay in both groups before operation and in 1, 2, 3 weeks after operation.In 3 weeks after operation the animals were killed and the expression of mRNA of β2-adrenoreceptor in myocardial tissue was detected by fluorescence analysis. Results The contents of NE and E were significantly higher after operation compared with that before operation in myocardial injury group(P<0.05), the contents reached peak value at 2 weeks after operation and began to decrease in the third weeks. No significant changes of the contents were found in non-myocardial injury group(P>0.05). The contents in myocardial injury group were higher than that in non-myocardial group at the same stage (P>0.05). Fluorescence quantitative analysis showed that the expression of mRNA of β2-adrenoreceptor in myocardial tissue of myocardial injury group was lower than that in non-myocardial injury group(P<0.05). Conclusion Aneurysm complicating with myocardial injury may be related with hyperfunction of sympathetic activity, much release of catecholamine which could induce cardiac muscle toxicity injury.

Key words:intracranial aneurysm; sympathetic toxicity;catecholamine