劉揚(yáng)

（三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 骨外科，湖北 宜昌 443000）

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論著

白細(xì)胞介素-24基因在膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病中的作用及意義

劉揚(yáng)

（三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 骨外科，湖北 宜昌 443000）

摘要：目的探討白細(xì)胞介素-24（IL-24）基因在膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎（KOA）疾病中的作用及意義，為KOA的早期診斷及基因治療提供一定的科學(xué)依據(jù)。方法選擇該醫(yī)院骨科原發(fā)性KOA的滑膜標(biāo)本，提取總R NA，用實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（R eal-time R T-PCR）檢測(cè)KOA滑膜組織中IL-24基因的表達(dá)。結(jié)果IL-24基因表達(dá)在KOA滑膜組織中降低（P<0.01）。結(jié)論IL-24在膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎滑膜中的表達(dá)降低，且與KOA病變關(guān)系密切，為將來(lái)診斷和基因治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎疾病提供參考。

關(guān)鍵詞：膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎；IL-24；基因

骨性關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是發(fā)生于老年人群中的一種慢性退行性關(guān)節(jié)疾病，使患者逐漸散失關(guān)節(jié)功能[1]。其主要特點(diǎn)是軟骨下骨的改變、關(guān)節(jié)軟骨的破壞、細(xì)胞外基質(zhì)的減少及滑膜炎性的改變。其特征是骨贅的形成和軟骨下骨的破壞[2]。年齡、肥胖、外傷、性別等是引起OA的常見(jiàn)風(fēng)險(xiǎn)因素[3]。在臨床上最為常見(jiàn)的是膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA），其發(fā)病率最高，是一組病因不同，但是有相似的生物學(xué)、形態(tài)學(xué)和臨床表現(xiàn)的疾病[4]。KOA主要損害關(guān)節(jié)軟骨、半月板、軟骨下骨及滑膜等關(guān)節(jié)組織，容易引起軟骨代謝的變化。膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎是一種自身炎癥反應(yīng)，可以引起分解代謝和軟骨細(xì)胞的凋亡，從而導(dǎo)致軟骨的降解[5-6]。研究表明，KOA發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程與多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子有關(guān)，如白細(xì)胞介素-1（Interleukin-1，IL-1）家族、轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子、炎癥因子等[7]。白細(xì)胞介素是一種在細(xì)胞間發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，可以對(duì)免疫反應(yīng)起刺激或者抑制作用，其主要由單核細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。IL-24是一種抑制炎性白細(xì)胞介素，在骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病中起重要作用。IL-24由外周血單核細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞等免疫細(xì)胞，以及黑色素細(xì)胞、皮膚角化細(xì)胞、結(jié)腸漿膜下肌成纖維細(xì)胞等[8-9]非免疫細(xì)胞分泌。研究發(fā)現(xiàn)，IL-24除具有抑制腫瘤作用，還參與銀屑病、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病的免疫病理過(guò)程[10-11]。總體來(lái)說(shuō)，KOA是多種細(xì)胞因子相互調(diào)節(jié)引起的復(fù)雜病理過(guò)程。目前，還沒(méi)有IL-24與KOA的相關(guān)性及機(jī)制的系統(tǒng)性研究，本文通過(guò)IL-24基因在膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病中的作用研究，為KOA的發(fā)病機(jī)制研究和進(jìn)一步的基因治療提供依據(jù)。

1　資料與方法

1.1一般資料

1.1.1KOA組選取2010年1月-2012年12月在本院骨科就診的膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者42例，男性22例，女性20例，平均年齡（61.00±2.12）歲，取膝關(guān)節(jié)滑膜標(biāo)本作為KOA組實(shí)驗(yàn)標(biāo)本。

1.1.2對(duì)照組選取2010年1月-2012年12月在本院體檢，未患過(guò)膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎、創(chuàng)傷性截肢的患者32例。其中男性18例，女性14例；平均年齡（51.00±1.49）歲，取其膝關(guān)節(jié)滑膜組織來(lái)作為對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)標(biāo)本。

1.1.3標(biāo)本存放KOA組和對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)標(biāo)本取出后，直接置于無(wú)菌的裝有液氮的凍存管中，30min后存于-80℃冰箱冷凍保存中。

1.2診斷及納入標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1診斷標(biāo)準(zhǔn)滿(mǎn)足美國(guó)風(fēng)濕協(xié)會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)：患者具有膝關(guān)節(jié)疼痛，患膝X線檢查可以發(fā)現(xiàn)骨贅；受累的膝關(guān)節(jié)晨僵<30 cm；有骨擦聲音，在近1個(gè)月內(nèi)有膝關(guān)節(jié)疼痛。

1.2.2納入標(biāo)準(zhǔn)篩選本院骨科年齡>50歲的原發(fā)性KOA患者，患者符合Ahlback膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)節(jié)間隙消失、輕度骨磨損、中度骨磨損（磨損0.5～1.0cm）的表現(xiàn)。

1.3實(shí)驗(yàn)試劑

M-MLV轉(zhuǎn)移液（美國(guó)Invitrogen公司），dNTP混合液（日本TaKaRa公司），RNase合成酶抑制劑Inhibitor（美國(guó)Promega公司），TRIzol提取液（美國(guó)Invitrogen公司），RQI無(wú)RNase活性的DNA酶（美國(guó)Promega公司），RNeasy提取試劑盒（德國(guó)QIAGEN公司），SYBR GreenⅠ嵌合熒光聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）混合液（美國(guó)Applied Biosystems公司），ABI熒光定量PCR儀專(zhuān)用96孔板（美國(guó)Applied Biosystems公司），ABI熒光定量PCR儀專(zhuān)用封板膜（美國(guó)Applied Biosystems公司），引物（9N逆轉(zhuǎn)錄引物PCR引物）（美國(guó)Invitrogen公司）。

1.4實(shí)驗(yàn)儀器

小型臺(tái)式高速離心機(jī)5415D（德國(guó)Eppendorf公司），離心機(jī)581OR（德國(guó)Eppendorf公司），梯度PCR（德國(guó)Eppendorf公司），多孔道DNA檢測(cè)儀PTC-225（美國(guó)MJ公司），凝膠成像系統(tǒng)CBC/UVP I-DOOl（北京CapitalBio公司），分光光度計(jì)ND-1000（美國(guó)Nano Drop公司），7900HT實(shí)時(shí)定量PCR（美國(guó)Applied Biosystems），移液槍P-2.5，P-20，P-200，P-l000（德國(guó)Eppendorf公司）。

1.5實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1R NA的提取（Trizol法）用電子天平稱(chēng)0.3～0.5 g取出的組織樣本，使用液氮預(yù)冷的研缽來(lái)研磨，為使組織不融化，研磨過(guò)程中注意隨時(shí)添加液氮；按組織∶Trizol=100∶1的比例加入Trizol，繼續(xù)研磨組織使其至比較細(xì)的粉末，轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)，等融化后，把液體轉(zhuǎn)移到體積為1.5ml的離心管中，每管大約1 ml，室溫下將其放置>15 min；按照氯仿∶Trizol=0.2∶1.0的比例加入氯仿，將其游禍震蕩30 s混勻，室溫下放置2～3 min，再在4℃、15 000 r/min離心15 min；將離心后得到的上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新Eppendorf管，按照異丙醇∶Trizol= 0.5∶1.0的比例加入異丙醇，混勻，在-20℃放置> 10 min，4℃、15 000 r/min離心15 min；將異丙醇棄掉，加入1 ml 75%乙醇，用手指彈起沉淀塊，顛倒幾次，4℃、7500r/min離心5 min；將75%乙醇棄掉，在超凈臺(tái)中自然干燥15～30min；視RNA沉淀大小加入一定體積的無(wú)核酸酶水，65℃助溶5～10 min；置入-20℃冰箱冷凍保存，在-80℃長(zhǎng)期冷凍保存。

1.5.2cDNA第一鏈的合成取2μg RNA置于反應(yīng)管中，加入Oligo dT 1μl，再加入2.5 mmol dNTP mix 4μl，混勻，加ddH2O至13μl。在60℃條件下靜置10 min后，放在冰上放置>1 min。在反應(yīng)管中加入5×第一鏈緩沖液4μl，0.1 mol二硫蘇糖醇（DL-dithiothreito，DDT）1μl，RNaseout（40u/μl）1μl，SuperscriptⅢRT 1μl，震蕩混勻后離心，70℃條件下通過(guò)滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，合成cDNA第一鏈，4℃條件下保存。

1.5.3實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（real-time reverse transcription-polymerasechainreaction，R eal-time R T-PCR） ①逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系和反應(yīng)程序見(jiàn)表1；②逆轉(zhuǎn)錄終止反應(yīng)程序：在70℃條件下加入5μl 1.5mol Na（OH）來(lái)終止逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)10 min后，加入1μl 10mol乙酸以發(fā)生中和反應(yīng)，再加入無(wú)核酸酶水至50μl，在4℃可以短期低溫保存，在-80℃下能夠長(zhǎng)期低溫保存。

1.5.4R eal time PCR反應(yīng)①Real time PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表2；②Real time PCR反應(yīng)程序見(jiàn)表3；③Real time PCR產(chǎn)物1.5%非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)見(jiàn)表4。1.5%非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條件：120V，15～20min。1.5%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條件：120～130V，15～20min。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率表示，用χ2檢驗(yàn)，用直線相關(guān)回歸描述IL-24 mRNA的相對(duì)表達(dá)量與KOA病程的相關(guān)性，用散點(diǎn)圖描述兩者的相關(guān)性，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1兩組患者一般情況比較

KOA組和對(duì)照組在性別、年齡方面比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表5。

2.2RT-PCR檢測(cè)不同組織中IL-24 mRNA表達(dá)的電泳圖

人膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎滑膜組織與正常滑膜組織表達(dá)IL-24 mRNA的Real-time RT-PCR檢測(cè)電泳圖見(jiàn)圖1。

2.3Real-time RT-PCR分析

Real-time RT-PCR反應(yīng)結(jié)果表明，兩組IL-24基因表達(dá)比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 19.263，P=0.000），KOA組較對(duì)照組IL-24基因表達(dá)降低。見(jiàn)圖2。

2.4IL-24 mRNA統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

KOA組IL-24 mRNA的表達(dá)值為（0.051± 0.006），對(duì)照組為（0.940±0.070），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.734，P=0.001），KOA組低于對(duì)照組。

表1　Real-time RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系及反應(yīng)程序

表2　Real Time PCR反應(yīng)體系

表3　Real Time PCR反應(yīng)程序

表4　Real time PCR產(chǎn)物1.5%非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

2.5IL-24 mRNA相對(duì)表達(dá)量與KOA病程的相關(guān)分析

隨著病程的增加即關(guān)節(jié)磨損程度加重，IL-24 mRNA相對(duì)表達(dá)量減少，表明IL-24 mRNA的相對(duì)表達(dá)量與KOA病程呈負(fù)相關(guān)（r=-0.827，P=0.000）。見(jiàn)圖3。

表5　兩組患者一般情況比較

圖1　不同組織中IL-24 mRNA表達(dá)的電泳圖

圖2　兩組IL-24 mRNA的相對(duì)表達(dá)量比較

圖3　IL-24 mRNA的相對(duì)表達(dá)量和KOA病程散點(diǎn)圖

3　討論

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎又稱(chēng)增生性膝關(guān)節(jié)炎，是指膝關(guān)節(jié)由于外傷、慢性勞損及關(guān)節(jié)畸形等引起關(guān)節(jié)軟骨變性、增生，從而導(dǎo)致腫脹、疼痛、伸屈受限等癥狀的退行性關(guān)節(jié)疾病。MURPHY等[12]研究表明，1/2的成年人85歲之前患有癥狀的骨性關(guān)節(jié)炎。膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎易導(dǎo)致軟骨代謝的變化，其變化開(kāi)始于關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)的變化，滑膜的炎癥參與該過(guò)程?；ぱ资求w內(nèi)細(xì)胞因子合成釋放綜合作用的結(jié)果，進(jìn)而影響到關(guān)節(jié)軟骨的改變?；ぱ资且鹪缙谙リP(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎臨床癥狀的主要因素。任紅革等[13]通過(guò)查閱文獻(xiàn)，總結(jié)出細(xì)胞因子在膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，部分細(xì)胞因子能促進(jìn)骨性關(guān)節(jié)炎軟骨降解、滑膜炎癥及軟骨下骨的吸收，部分細(xì)胞因子也有抑制骨性關(guān)節(jié)炎病變發(fā)展的作用。與分解代謝有關(guān)的細(xì)胞因子主要有基質(zhì)金屬蛋白酶；與合成代謝有關(guān)的細(xì)胞因子主要有轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、胰島素樣生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子；在關(guān)節(jié)組織中發(fā)現(xiàn)的影響細(xì)胞功能的炎癥因子包括白細(xì)胞介素、趨化因子和腫瘤壞死因子等。

白細(xì)胞介素含促炎癥白細(xì)胞介素和抑制白細(xì)胞介素兩類(lèi)，其在膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮重要作用。促炎癥白細(xì)胞介素主要有IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-5、IL-6、IL-8、IL-17、IL-18等，抑制炎癥白細(xì)胞介素主要有IL-4、IL-10、IL-13、IL-24等。研究表明，IL-24同腫瘤的抑制、炎癥的抑制、損失的修復(fù)作用密切相關(guān)[14-15]。IL-24對(duì)腫瘤的抑制作用比較廣泛，能夠抑制肺癌、鼻咽癌、宮頸癌等癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[16]。大量對(duì)其機(jī)制的研究表明，主要從PKR途徑、抑制腫瘤血管的生成、抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲，以及IL-24的免疫調(diào)節(jié)作用來(lái)發(fā)揮作用。同時(shí)DOMINIK等[17]經(jīng)免疫組織化學(xué)法、遷移分析等研究發(fā)現(xiàn)，IL-24在損傷修復(fù)過(guò)程中，在皮膚角化細(xì)胞中表達(dá)升高，并抑制由TGF-α引起的促炎癥作用。在本研究中通過(guò)Real-time RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，IL-24基因在膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎滑膜中表達(dá)顯著降低，考慮原因?yàn)镮L-24的低表達(dá)作用能很好地促進(jìn)TGF-α引起的促炎癥反應(yīng)以及關(guān)節(jié)軟骨的降解作用，從而引起人發(fā)生膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎。

通過(guò)IL-24基因在膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病中的作用研究，筆者發(fā)現(xiàn)，IL-24基因在膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎滑膜中表達(dá)顯著降低，IL-24與KOA的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)。同時(shí)對(duì)IL-24基因的表達(dá)水平研究，能夠幫助早期診斷膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎，并且對(duì)IL-24基因進(jìn)一步深入研究可以為將來(lái)膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的診斷和基因治療提供參考。

參考文獻(xiàn)：

[1]FORESTIER R,FRANCON A,BRIOLE V,et al.Prevalence of generalized osteoarthritis in a population with knee osteoarthritis[J]. Joint Bone Spine,2011,78(3):275-278.

[2]BLAGOJEVIC M,JINKS C,JEFFERY A,et al.Risk factors for onset of osteoarthritis of the knee in older adults:a systematic review and meta-analysis[J].Osteoarthritis Cartilage,2010,18:24-33.

[3]LOESER R F.Age-related changes in the musculoskeletal system and the development of osteoarthritis[J].Clin Geriatr Med, 2010,26:371-386.

[4]MIYAZAKI T,WADA M,KAWAHARA H,et al.Dynamic load at baseline can predict radiographic disease progression in medial compartment knee osteoarthritis[J].Ann Rheum Dis,2002,61(7): 617-622.

[5]GOLDRING M B,OTERO M.Inflammation in osteoarthritis[J]. Current Opinion in Rheum-atology,2011,23(5):471-478.

[6]ABRAMSON S B.Inflammationin osteoaithritis[J].The Journal of Rheumatology,2004,70:70-76.

[7]帥明.白細(xì)胞介素-1β、HIF-lα和VEGF在兔骨性關(guān)節(jié)炎模型的滑膜中的表達(dá)[D].廣州:南方醫(yī)科大學(xué),2010.

[8]ANDOH A,SHIOYAM,NISHIDAA,etal.Expression of IL-24,an activator of the JAK1/STAT3/SOCS3 cascade,is enhanced in inflammatory bowel disease[J].J Immunol,2009,183: 687-695.

[9]KUN S,WOLK K,WITTE E,et al.Interleukin(IL)-19,IL-20 and 11X24 are produced by and act on keratinocytes and are distinct from classical ILs[J].Exp Dermatol,2006,15:991-1004.

[10]MIAO H,PENG L.JL-24 Transgenic mice:in vivo evidence of overlapping functions for IL-20,IL-22 and IL-24 in the epidermis[J].J Immunol,2010,184:1793-1798.

[11]WU B,HUANG C H,MIDORI K M.IL-24 modulates IFN-y expression in patients with tuberculosis[J].Immunol Lett,2008, 117(1):57-62.

[12]MURPHY L,SCHWARTZ T A,HELMICK C G,et al.Lifetime risk of symptomatic knee oteoarthritis[J].Arthritis Rheum,2008, 59:1207-1213.

[13]任紅革,崔逢德.細(xì)胞因子在骨性關(guān)節(jié)炎中的表達(dá)與應(yīng)用 [J].中國(guó)組織工程研究,2012,16(52):9828-9835.

[14]CHOI Y M,ROH M S,HONG Y S,et al.Interleukiii-24 is correlated with differentiation and lymph node numbers in rectal cancer[J].World J Gastroenterol,2011,17(9):1167-1173.

[15]ANDOH A,SHIOYA M,NISHIDA A,et al.Expression of IL-24,an activator of the JAK1/STAT3/SOCS3 Cascade,is enhanced in inflammatory bowel disease[J].J Immunol,2009,183: 687-695.

[16]FISHER P B.Is mda-7/IL-24 a magic bullet for cancer[J]. Cancer Res,2005,65(22):10128-10138.

[17]DOMINIK R H,BAO N,JIAN F,et al.Rho-dependent CCL20 induced by dynamic compression of human chondrocytes[J]. Arthritis Rheum,2008,58(9):2735-2742.

（童穎丹編輯）

中圖分類(lèi)號(hào)：R 684.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.13.012

文章編號(hào)：1005-8982（2016）13-0063-05

收稿日期：2015-07-09

Expression ofIL24 gene in knee osteoarthritis and its significance

Yang Liu
（Department of Bone Orthopedics，the First College of Clinical Medical Science，China Three Gorges University，Yichang，Hubei 443000，China）

Abstract:Objective To investigate expression and significance ofIL24 gene in the knee osteoarthritis （KOA），and to provide scientific basis for early diagnosis and gene therapy for knee osteoarthritis.Methods Fresh synovial specimens were collected from orthopedic patients in our hospital.Trizol was used to extract total RNA.Expression ofIL24in knee osteoarthritis synovium was detected by RT-PCR.ResultsIL24gene expression in knee KOA synovial tissue obviously decreased（P＜0.01）.ConclusionsIL24 expression in the synovium of osteoarthritis knee joint obviously declines and is negatively correlated with the progress of KOA. Therefore，it can provide a reference for future diagnosis and gene therapy of knee osteoarthritis.

Keywords:knee osteoarthritis；IL24；gene