宋健，喻超，詹磊，張宏，趙小毅，張棟，孫誠(chéng)誼

（貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 肝膽外科，貴州 貴陽(yáng) 550004）

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論著

膽固醇代謝相關(guān)蛋白及相關(guān)特異microRNAs在膽固醇型膽囊結(jié)石患者血清中的表達(dá)及意義*

宋健，喻超，詹磊，張宏，趙小毅，張棟，孫誠(chéng)誼

（貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 肝膽外科，貴州 貴陽(yáng) 550004）

摘要：目的探討膽固醇型膽囊結(jié)石患者和健康對(duì)照人群血清中膽固醇代謝相關(guān)蛋白，以及可能靶向ABCA1的相關(guān)microR NAs（miR NAs）表達(dá)差異及意義。方法選取60例膽固醇型膽囊結(jié)石患者（結(jié)石組）和60例健康對(duì)照人群（非結(jié)石組）的血清樣本，采用Western blot檢測(cè)膽固醇代謝相關(guān)蛋白（SR EBP-2、FX R、LX R、ABCA1、ABCB11）的表達(dá)，利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)可能靶向調(diào)控ABCA1的相關(guān)miR NAs，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（R T-qPCR）對(duì)相關(guān)miR NAs的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果結(jié)石組血清中SR EBP-2、FX R、LX R、ABCA1、ABCB11蛋白的表達(dá)量較非結(jié)石組降低（P<0.05），結(jié)石組血清中miR NA-26a、miR NA-144、miR NA-758表達(dá)較非結(jié)石組升高（P<0.05）。結(jié)論膽固醇代謝相關(guān)蛋白差異性表達(dá)及可能靶向ABCA1的相關(guān)miR NA在膽固醇型膽囊結(jié)石的發(fā)病過(guò)程中可能發(fā)揮極為重要的作用。

關(guān)鍵詞：膽固醇型膽囊結(jié)石??；膽固醇代謝；microR NAs；生物信息學(xué)

膽囊結(jié)石是一種世界范圍的常見(jiàn)疾病，患病人數(shù)逐年增加，各年齡段均可發(fā)病[1]。膽汁中的一種或多種成分出現(xiàn)失衡則有可能誘發(fā)膽囊結(jié)石的形成。以結(jié)石成分劃分，37%～86%為膽固醇型膽囊結(jié)石、2%～27%為膽色素膽囊結(jié)石、4%～16%為混合型膽囊結(jié)石[2]。膽固醇型膽囊結(jié)石的成因尤為復(fù)雜，主要可歸結(jié)于：膽固醇過(guò)度分泌及膽汁膽固醇過(guò)飽和、膽汁促成核及抗成核蛋白失衡、膽囊動(dòng)力失調(diào)[3]，其中任何一個(gè)因素的積極干預(yù)都可能對(duì)治療膽囊結(jié)石起重要作用。

ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體（adenosine triphosphate binding cassette，ABC）基因超家族中的ABCA1是體內(nèi)膽固醇代謝的關(guān)鍵分子[4]，在膽固醇型膽囊結(jié)石形成的兩個(gè)重要生物學(xué)進(jìn)程中，即膽固醇代謝和膽汁成分的影響中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[5]。microRNAs （miRNAs）是一種內(nèi)生性微小（長(zhǎng)度為18～25個(gè)核苷酸）非蛋白編碼RNAs，幾乎存在于所有的器官組織中，且存在穩(wěn)定的表達(dá)。miRNAs通過(guò)與靶向調(diào)控mRNAs的3'-UTR端結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)mRNA的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控[6]。關(guān)于miRNAs對(duì)膽囊結(jié)石成因的相關(guān)研究極少，但大量研究證明，miRNAs可通過(guò)靶向ABCA1 mRNA對(duì)體內(nèi)膽固醇代謝進(jìn)行調(diào)控[7]。因此，本研究利用Western blot檢測(cè)及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real time-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）對(duì)膽固醇型膽囊結(jié)石患者血清中膽固醇代謝相關(guān)蛋白及可能存在靶向調(diào)控ABCA1的相關(guān)miRNAs表達(dá)情況進(jìn)行分析，為膽固醇型膽囊結(jié)石臨床預(yù)防和治療提供新的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1　資料與方法

1.1一般資料

選取2015年1月-2015年6月貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽外科的60例膽固醇型膽囊結(jié)石患者血清樣本（結(jié)石組）。其中，男性22例，女性38例；年齡21～77歲，平均（53.4±6.3）歲。另收集60例在本院體檢中心體檢的健康人員血清（非結(jié)石組）作為對(duì)照。其中，男性22例，女性38例；年齡22～75歲，平均（51.6±4.9）歲。兩組患者性別、年齡等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。排除病毒性肝炎、心腦血管疾病、糖尿病及代謝性疾病、近3個(gè)月內(nèi)有膽囊炎急性發(fā)作及使用抗生素者。對(duì)膽囊結(jié)石采用肉眼觀察結(jié)合三酰甘油檢測(cè)試劑盒（glycerol phosphate oxidase peroxidase-anti-peroxidase，GPO-PAP）測(cè)定膽固醇含量的方法對(duì)膽囊結(jié)石進(jìn)行分類，總膽固醇含量≥70%為膽固醇型膽囊結(jié)石，納入實(shí)驗(yàn)結(jié)石組[8]。材料的選取及標(biāo)本的獲得均通過(guò)貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)，實(shí)驗(yàn)在倫理委員會(huì)的監(jiān)督及指導(dǎo)下進(jìn)行。

總膽固醇試劑盒（total cholesterol，T-CHO）試劑盒（南京建成生物工程研究所），Trizol試劑（美國(guó)Invitrogen公司），miRcute miRNA提取分離試劑盒（北京天根生化科技有限公司），Revert Aid第一鏈cDNA合成試劑盒（美國(guó)Thermo Scientific公司），Maxima-SYBR-Green/ROX-qPCR-Master Mix（美國(guó)Thermo Scientific公司），引物設(shè)計(jì)及合成（上海生工生物工程股份有限公司），SREBP-2、FXR、LXR、ABCA1、ABCB11兔抗人單克隆抗體（美國(guó)Abcam公司），兔抗人單克隆抗β-肌動(dòng)蛋白（以下簡(jiǎn)稱βactin）抗體，二抗：辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)，中國(guó)）。

1.2方法

1.2.1總膽固醇檢測(cè)切取部分膽結(jié)石放入預(yù)冷的研缽中磨成粉末，每個(gè)樣本精確稱取10 mg，放入15 ml離心管中，加入氯仿、甲醇混合液（體積比2∶1）14ml，充分振搖1～2min后，避光常溫放置20min，再充分振搖，2 min后，6 000 r/min×10 min，取上清液，按照T-CHO試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，采用單試劑GPO-PAP法測(cè)定膽固醇含量。

1.2.2外周血清采集檢測(cè)對(duì)象禁食12 h后，于次日清晨經(jīng)肘靜脈穿刺采集5 ml外周全血。4℃靜置2 h至血液自凝；4℃、2000×g離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至新無(wú)RNA酶Eppendorf管中。4℃、12000×g離心15min，以徹底除去細(xì)胞碎片與雜質(zhì)；將上清分裝至0.2 ml Eppendorf管中，置于-80℃冰箱冷凍保存待檢。

1.2.3Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)4℃、10 000×g離心30min，提取上清液即為總蛋白。用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測(cè)定蛋白濃度，取40μg總蛋白上樣；經(jīng)8%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，封閉液封閉3 h，分別加入一抗：兔抗人ABCA1（1∶40000）、ABCB11（1∶1000）、SREBP-2（1∶800）、FXR（1∶400）、LXR（1∶400）和抗βactin（1∶2 000），在4℃下孵育過(guò)夜；二抗在室溫下孵育2 h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色后，經(jīng)自動(dòng)電泳凝膠成像分析儀采集圖像，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。以β-actin為內(nèi)參，檢測(cè)兩組血清的SREBP-2、FXR、LXR、ABCA1、ABCB11平均相對(duì)表達(dá)量，以目的蛋白與內(nèi)參灰度值的比值作為其蛋白表達(dá)水平。采用自動(dòng)電泳凝膠成像分析軟件進(jìn)行圖像掃描和分析。

1.2.4生物信息學(xué)預(yù)測(cè)以 PicTar、miRanda、DI ANA-microT-CDS、和TargetScanS 4個(gè)常用miRNA靶標(biāo)預(yù)測(cè)軟件對(duì)ABCA1進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)確立待檢測(cè)的7個(gè)miRNAs：miR-10b、miR-26a、miR-33a、miR-143、miR-144、miR-145、miR-758。

1.2.5R T-qPCRmiRNA抽提嚴(yán)格按miRcute miRNA提取分離試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用miRNAs特異性引物和RevertAidTMM-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶對(duì)每個(gè)樣本中的總miRNA（0.5μg）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火60s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)反應(yīng)設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值，miRNAs的相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt計(jì)算。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1ABC A1、ABCB11、SREBP-2、FXR、LXR在血清中的表達(dá)

本研究首先通過(guò)Western blot檢測(cè)對(duì)60例膽固醇型膽囊結(jié)石患者和60例年齡、性別相匹配的健康人血清中的ABCA1、ABCB11、SREBP-2、FXR、LXR蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，結(jié)石組患者血清中的ABCA1、ABCB11、SREBP-2、FXR、LXR蛋白表達(dá)低于非結(jié)石組（t=12.150、7.669、9.251、8.990、和10.350，P=0.000、0.001、0.000、0.000、和0.000）。見(jiàn)圖1。

圖1　Western blot檢測(cè)

2.2生物信息學(xué)預(yù)測(cè)

膽固醇代謝受多種蛋白的調(diào)節(jié)，SREBP-2、FXR、LXR報(bào)道較多，目前針對(duì)ABCA1對(duì)膽固醇代謝的研究較熱[9]，但其與膽固醇型膽囊結(jié)石的報(bào)道較少。故以Pic Tar、miRanda、DIANA-microT-CDS和Target Scan S 4個(gè)常用miRNA靶標(biāo)預(yù)測(cè)軟件對(duì)ABCA1進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)確立待檢測(cè)的 7個(gè) miRNAs：miR-10b、miR-26a、miR-33a、miR-143、miR-144、miR-145、miR-758。

2.3兩組血清中miRNAs的表達(dá)

兩組血清中的7種miRNAs（miR-10b、miR-26a、miR-33a、miR-143、miR-144、miR-145、miR-758）進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，結(jié)果顯示，結(jié)石組患者血清中的3種miRNAs（miR-26a、miR-144、miR-758）的表達(dá)水平高于非結(jié)石組（t=3.305、1.993和2.579，P=0.001、0.049和0.011），其他4種miRNAs（miR-10b、miR-33a、miR-143、miR-145）的表達(dá)水平比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.680、1.889、0.921和1.162，P=0.096、0.061、0.359和0.248）。見(jiàn)圖2。

圖2　兩組血清miRNAs相對(duì)表達(dá)量比較

3　討論

膽囊結(jié)石是一種常見(jiàn)的消化系統(tǒng)疾病[10]，其發(fā)病率在美國(guó)為5%～25%，在歐洲為5.9%～21.9%，在亞洲為4%～15%，在我國(guó)為3%～11%[1，11-12]。隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展、飲食結(jié)構(gòu)西化、人口老齡化加劇，我國(guó)膽囊結(jié)石患病率也逐年增加[13-14]。目前膽囊結(jié)石的治療仍以腹腔鏡膽囊切除術(shù)為主，膽囊切除后會(huì)出現(xiàn)膽汁反流、膽總管結(jié)石患病率升高、結(jié)腸癌發(fā)生率升高等不良后果[15-16]。國(guó)內(nèi)外學(xué)界對(duì)于膽囊結(jié)石疾病的成因及膽囊結(jié)石發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)因素的研究仍無(wú)定論，存在較大爭(zhēng)議。因此，從表觀遺傳學(xué)思路入手，探尋膽囊結(jié)石成石機(jī)理十分重要。

本研究選取膽固醇型膽囊結(jié)石及健康人血清為研究對(duì)象，首先通過(guò)Western blot檢測(cè)結(jié)石組與非結(jié)石組血清之間 SREBP-2、FXR、LXR、ABCA1、ABCB11蛋白的表達(dá)，確實(shí)存在差異。有研究證明，F(xiàn)XR在小鼠肝內(nèi)膽管結(jié)石模型中呈低表達(dá)狀態(tài)，這可能與FXR促進(jìn)膽汁酸和磷脂向膽小管的分泌，進(jìn)而降低膽固醇/膽汁酸的比例，即調(diào)控膽固醇的飽和度有關(guān)[17]。LXRa與脂類代謝關(guān)系密切，可激活A(yù)BCA1和ABCG5/ABCG8的表達(dá)，增加膽固醇從肝內(nèi)排出[18]。SREBP-2是膽固醇生物合成途徑中的關(guān)鍵分子，降低其表達(dá)可導(dǎo)致膽汁中膽固醇過(guò)量分泌[19]。ABCA1、ABCB11是ABC基因超家族中的重要一員，是膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)（reverse cholesterol transport，RCT）的關(guān)鍵因素，介導(dǎo)細(xì)胞膽固醇外流，在膽固醇和血漿脂蛋白代謝中發(fā)揮重要作用，進(jìn)而調(diào)控膽固醇輸出[20]，兩者在高膽固醇血癥、心血管疾病、丹吉爾病、糖尿病等代謝性疾病中存在明顯低表達(dá)，該低水平的表達(dá)將逆向破壞RCT過(guò)程，因此被認(rèn)為是人類膽囊膽固醇結(jié)石發(fā)病可能的重要成石基因之一[21-22]。有研究認(rèn)為，兩者升高可導(dǎo)致膽固醇型膽囊結(jié)石的形成[23]，但這樣的觀點(diǎn)仍然存在爭(zhēng)議[24-25]。筆者研究發(fā)現(xiàn)，兩者低表達(dá)可能導(dǎo)致膽固醇型膽囊結(jié)石的形成。

以上提及的膽固醇代謝相關(guān)蛋白中，ABCA1作為體內(nèi)膽固醇平衡的關(guān)鍵分子[4]，在膽固醇型膽囊結(jié)石形成過(guò)程發(fā)揮重要影響，在膽固醇代謝和膽汁酸成分的平衡中起重要的調(diào)控作用[5]。研究表明，膽固醇型膽囊結(jié)石患者膽囊黏膜中ABCA1呈高表達(dá)[26]，本研究結(jié)果與其相互印證。目前針對(duì)miRNAs 與ABCA1的研究，主要集中在miRNAs靶向調(diào)控ABCA1進(jìn)而形成高膽固醇血癥和高甘油三酯血癥這一領(lǐng)域，其能極大地增加患動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)[27]，考慮膽固醇型膽囊結(jié)石與動(dòng)脈粥樣硬化同為代謝綜合征，有相似的致病機(jī)理[28]。因此筆者推測(cè)miRNAs同樣可能靶向ABCA1，影響膽固醇型膽囊結(jié)石的形成。因此，在確定ABCA1在結(jié)石組中呈高表達(dá)后，筆者利用生物信息學(xué)技術(shù)并查閱相關(guān)文獻(xiàn)，選取可能對(duì)膽固醇型膽囊結(jié)石存在潛在調(diào)控作用的miRNAs[20，29-31]，并通過(guò)qPCR反應(yīng)檢測(cè)miRNA的表達(dá)，其中miR-26a、miR-144、miR-758的表達(dá)相對(duì)升高，提示miR-26a、miR-144、miR-758極有可能通過(guò)靶向調(diào)控ABCA1影響膽固醇型膽囊結(jié)石的形成。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)膽固醇型膽囊結(jié)石患者與非結(jié)石組血清中膽固醇代謝相關(guān)蛋白（SREBP-2、FXR、LXR、ABCA1、ABCB11）表達(dá)降低，可能存在靶向ABCA1調(diào)控的miR-26a、miR-144、miR-758表達(dá)升高，這種miRNAs特異性的表達(dá)升高可能靶向下調(diào)ABCA1，從而損害RCT過(guò)程，最終導(dǎo)致膽固醇型膽囊結(jié)石的形成。miR-26a、miR-144、miR-758有可能成為膽固醇型膽囊結(jié)石治療的新靶點(diǎn)，為最終揭示膽固醇型膽囊結(jié)石的形成機(jī)理，提供極為重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)及理論依據(jù)。

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（童穎丹 編輯）

中圖分類號(hào)：R 657.42

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.13.008

文章編號(hào)：1005-8982（2016）13-0043-05

收稿日期：2016-01-27

*基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（No：81560477）；貴州省科技計(jì)劃項(xiàng)目[No：黔科合SY字（2015）3047]

[通信作者]孫誠(chéng)誼，E-mail：sunchengyi2014@163.com；Tel：0851-86771326

Expressions and significance of cholesterol metabolism related proteins and miRNAs targeting to ABCA1 in serum of patients with cholesterol gallstones*

Jian Song，Chao Yu，Lei Zhan，Hong Zhang，Xiao-yi Zhao，Dong Zhang，Cheng-yi Sun
（Department of Hepatobiliary Surgery，the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University，Guiyang，Guizhou 550004，China）

Abstract:Objective To investigate the expressions of serum cholesterol metabolism related proteins and miRNAs maybe targeting to ABCA1 in the cholesterol gallstone patients and control subjects and the significance.Methods Serum samples from 60 patients with cholesterol gallstones（GS）and 60 without gallbladder stone（GP）were collected.The expressions of serum cholesterol metabolism related proteins（SREBP-2，F(xiàn)XR，LXR，ABCA1 and ABCB11）were examined by Western blot assay.The miRNAs possibly targeting to ABCA1 were predicted by bioinformatics method，the expressions of the selected miRNAs were detected by real timequantitative polymerase chain reaction（RT-qPCR）.Results SREBP-2，F(xiàn)XR，LXR，ABCA1 and ABCB11 expressions in serum were significantly decreased in the GC patients compared to those in the healthy controls（P ＜0.05）.The serum expressions of miRNA-26a，miRNA-144 and miRNA-758 were significantly higher in the GC patients than in healthy controls（P ＜0.05）.Conclusions Abnormal expressions of cholesterol metabolism related proteins and the differential levels of microRNAs targeting to ABCA1 may play an important role in occurrence and development of cholesterol gallstones.

Keywords:cholesterol gallstone；cholesterol metabolism；microRNA；bioinformatics