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        缺氧微環(huán)境下人肺腺癌A549細胞的microRNA基因芯片結(jié)果分析*

        2016-08-10 06:06:05耿瑩鮑永霞肖景濱葛冬杰梁錚
        中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志 2016年13期
        關(guān)鍵詞:缺氧肺腺癌芯片

        耿瑩,鮑永霞,肖景濱,葛冬杰,梁錚

        (1.哈爾濱醫(yī)科大學附屬二院 呼吸科,黑龍江 哈爾濱 150081;2.黑龍江省軍區(qū)醫(yī)院 首長保健室,黑龍江 哈爾濱 150009;3黑龍江省哈爾濱市第一醫(yī)院 呼吸科,黑龍江 哈爾濱 150010)

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        論著

        缺氧微環(huán)境下人肺腺癌A549細胞的microRNA基因芯片結(jié)果分析*

        耿瑩1,鮑永霞1,肖景濱2,葛冬杰3,梁錚1

        (1.哈爾濱醫(yī)科大學附屬二院 呼吸科,黑龍江 哈爾濱 150081;2.黑龍江省軍區(qū)醫(yī)院 首長保健室,黑龍江 哈爾濱 150009;3黑龍江省哈爾濱市第一醫(yī)院 呼吸科,黑龍江 哈爾濱 150010)

        摘要:目的研究缺氧對肺腺癌A549細胞中microR NA(miR NA)表達譜的影響,分析靶基因參與的生物學功能和通路。方法基于miR NA芯片技術(shù)和生物信息學分析方法,分析缺氧條件和正常氧條件下培養(yǎng)的A549細胞中差異表達的miR NA,并預測該miR NA的靶基因,分析靶基因參與的生物學功能和通路。結(jié)果本研究共篩選出14個差異表達miR NA,包括9個在缺氧細胞中上調(diào)miR NA和5個下調(diào)miR NA。上調(diào)和下調(diào)miR NA的靶基因都參與DNA轉(zhuǎn)錄、核染色質(zhì)修飾等功能,并且都參與Wnt信號、轉(zhuǎn)化生長因子-β信號和絲裂原活化蛋白激酶信號通路。結(jié)論缺氧的肺腺癌A549細胞中miR NA表達譜發(fā)生顯著改變,一些差異表達miR NA對某些基因具有調(diào)控作用。

        關(guān)鍵詞:肺腺癌;A549細胞;芯片;缺氧;差異表達microR NA

        肺癌是世界人口中最常見的惡性腫瘤之一,位居腫瘤死亡率之首,盡管其發(fā)生的蛋白和基因組圖譜已經(jīng)部分闡明,但是其發(fā)病率仍逐年升高,缺乏有效的早期診斷和治療手段是主要原因。MicroRNAs (miRNA)是近年來生命科學領(lǐng)域的一個研究熱點[1-2],其廣泛存在于真核生物體中,是一類高度保守、長度很短的非編碼調(diào)控單鏈小分子RNA,約18~24個堿基,通過抑制mRNA的翻譯和降解靶mRNA來調(diào)控生物體中基因的表達,在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起至關(guān)重要的作用。miRNA具有組織特異性,與肺組織相關(guān)的包括Let-7、Let-34、Let-21、Let-143、Let-145、Let-31、Let-146等40余種,其在肺癌組織表達中降低或升高,以癌基因或抑癌基因樣作用調(diào)解轉(zhuǎn)錄后翻譯,促進或抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展。

        有研究表明,缺氧可以引起肺癌中一些基因和miRNA表達水平的變化[3-4]。盡管人們對肺癌細胞缺氧引起的分子生物學變化已經(jīng)有一定的了解,但是其中的分子機制錯綜復雜,還有很多可能發(fā)生重大變化的基因、miRNA和相關(guān)的生物學通路等還未被發(fā)現(xiàn)。因此,還需進一步的深入研究,而目前還沒有關(guān)于缺氧對肺癌細胞中miRNA表達譜影響的報道。

        本研究利用缺氧培養(yǎng)箱對肺腺癌細胞系A549進行缺氧處理,采用miRNA芯片技術(shù)分析缺氧處理的A549細胞和正常氧狀態(tài)下的A549細胞中差異表達的miRNA,并利用公共數(shù)據(jù)庫預測差異表達miRNA的靶基因,分析靶基因所參與的生物學功能和通路。

        1 材料與方法

        1.1細胞系

        本研究選取人肺腺癌A549細胞為研究材料,該細胞系購自于中國科學院上海細胞庫。

        1.2細胞培養(yǎng)

        肺癌A549細胞系冷凍存于液氮中,取出后置于37℃電熱恒溫水浴箱中快速解凍復蘇。1 000 r/min離心10 min,棄上清液,更換新鮮的培養(yǎng)基。細胞在含有胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng),正常條件下的培養(yǎng)條件為37℃、5%二氧化碳CO2;缺氧條件則使用缺氧細胞培養(yǎng)箱,培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2、1%氧氣O2。選擇缺氧狀態(tài)下(1%O2)和正常條件下培養(yǎng)8 h的A549細胞用于miRNA芯片分析。

        1.3芯片數(shù)據(jù)分析

        將上述培養(yǎng)好的兩組A549細胞交給哈爾濱欣科瑞經(jīng)貿(mào)有限公司做miRNA芯片分析。

        1.4差異表達miRNA的篩選

        基于倍數(shù)法篩選兩組樣本的差異表達miRNA。計算兩組間芯片miRNA表達值的差異倍數(shù),將滿足差異倍數(shù)>2的miRNA識別為差異表達的miRNA。

        1.5預測差異表達miRNA的靶基因

        利用數(shù)據(jù)庫Target Scan,預測得到差異表達miRNA調(diào)控的所有靶基因。該數(shù)據(jù)庫是目前利用理論方法預測miRNA靶基因較為理想的數(shù)據(jù)庫。

        1.6統(tǒng)計學方法

        分別使用基因本體(gene ontology,GO)數(shù)據(jù)庫和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路數(shù)據(jù)庫,對差異表達miRNA調(diào)控的靶基因進行GO功能和KEGG通路富集分析,利用Fisher精確檢驗和多重比較檢驗計算每個功能的顯著性水平(P值),并用Benjamini-Hochberg法[5]校正P值,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結(jié)果

        2.1差異表達miRNA的統(tǒng)計分析

        根據(jù)篩選標準,本研究共篩選14個在缺氧A549細胞和正常A549細胞之間差異表達的miRNA。其中,9個在缺氧組中上調(diào)的miRNA(如hsa-miR-301b、hsa-miR-769-5p等)和5個下調(diào)的miRNA(如hsamiR-622、hsa-miR-181a-3p等)(見表1)。hsa-miR-301b上調(diào)的差異倍數(shù)最大,hsa-miR-622下調(diào)的差異倍數(shù)最大。

        2.2差異表達miRNA的靶基因分析

        為研究差異表達的miRNA在缺氧條件下對哪些基因產(chǎn)生調(diào)控作用,本研究利用Target Scan數(shù)據(jù)庫來預測差異表達miRNA的靶基因。共有4個上調(diào)的miRNA(hsa-mir-301b、hsa-mir-148b-3p、hsa-mir-769-5p和hsa-mir-1180)和2個下調(diào)的miRNA(hsamir-622和hsa-mir-202-3p)預測到靶基因,靶基因數(shù)目總共3259個,例如,上調(diào)表達的hsa-miR-301b調(diào)控的靶基因包括FOXF2、CRE5B、MARK3和MYB等;hsa-mir-148b-3p調(diào)控NOG、WNT10B等基因;hsa-miR-769-5p調(diào)控ARID1A、PTCH1、GRAMD3等基因;hsa-mir-1180調(diào)控SCN5A、ISOC2等基因。而下調(diào)表達的hsa-mir-622調(diào)控G3BP1、CELF2等基因;hsa-mir-202-3p調(diào)控TFAP2B、CLCN5等基因。見表2。

        表2 差異表達miRNA調(diào)控的靶基因

        2.3差異表達miRNA靶基因的生物學功能分析

        為進一步研究差異表達miRNA所涉及的生物學功能,本研究對預測到的miRNA靶基因進行GO功能和KEGG通路富集分析,間接揭示差異表達miRNA所參與的生物學功能。

        在上調(diào)miRNA靶基因富集的GO功能中,DNA轉(zhuǎn)錄、多細胞有機體發(fā)育、離子轉(zhuǎn)運、核染色質(zhì)修飾、代謝過程和細胞周期等功能被富集到。其中DNA轉(zhuǎn)錄、多細胞有機體發(fā)育、離子轉(zhuǎn)運、核染色質(zhì)修飾與代謝過程功能也被下調(diào)miRNA靶基因富集到,另外,下調(diào)miRNA靶基因還富集在血液凝固等GO功能上。見表3。

        在上調(diào)miRNA和下調(diào)miRNA靶基因富集的顯著通路中,有很多通路是一樣的,比如Wnt信號通路、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factorβ,TGF-β)信號通路、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPK)信號通路、黏著斑等。見表4。

        表3 miRNA靶基因富集到的排名前10的GO功能 (按P值由小到大)

        續(xù)表3

        表4 miRNA靶基因富集到的排名前10的KEGG通路 (按P值由小到大)

        3 討論

        在腫瘤中,細胞快速增殖,但新生血管的生成速度相對較慢,來不及為實體瘤內(nèi)部和腫瘤周圍細胞供應血氧,所以這些細胞就會產(chǎn)生缺氧狀態(tài)。有研究表明,幾乎所有的實體瘤中都存在缺氧細胞[6]。缺氧對于腫瘤的發(fā)展具有十分重要的意義[7]。①缺氧會直接導致細胞凋亡或者壞死;②缺氧會激活與細胞代謝和蛋白質(zhì)合成等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄,從而減緩增殖速度,增加無氧糖酵解,使細胞能適應缺氧環(huán)境,抑制細胞的凋亡;③缺氧可以刺激肺癌細胞中血管內(nèi)皮細胞生長因子和堿性成纖維細胞生長因子的表達,促進移植瘤中新血管的生成,提高腫瘤的生長能力;④缺氧還會刺激缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)的表達,激活轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear transcription factor-κB,NF-κB)通路[8]。

        本研究利用miRNA芯片技術(shù)和生物信息學方法,分析缺氧對肺腺癌A549細胞中miRNA表達譜的影響,并預測差異表達miRNA的靶基因,分析靶基因所參與的生物學功能和通路。

        本研究共篩選出14個在缺氧A549細胞和正常A549細胞之間差異表達的miRNA,包括9個在缺氧組中上調(diào)的miRNA和5個下調(diào)的miRNA。在上調(diào)表達的miRNA中,hsa-miR-769-5p調(diào)控ARID1A 和SMAD2等基因。ARID1A基因編碼SWI/SNF家族蛋白,該蛋白具有解旋酶和腺苷三磷酸酶活性。本研究發(fā)現(xiàn),ARID1A被富集到染色質(zhì)修飾功能上。有研究報道,ARID1A可以通過改變核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)來調(diào)控某些基因的轉(zhuǎn)錄[9]。有研究報道稱,SWI/SNF家族蛋白可以結(jié)合到缺氧誘導因子HIF-1α的啟動子上,通過HIF-1α的表達來調(diào)控細胞缺氧應答[10]。目前,還沒有研究報道ARID1A基因與缺氧肺癌的關(guān)系。筆者推測,ARID1A可能是通過其染色質(zhì)修飾功能來調(diào)節(jié)某些與缺氧相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達,從而對肺腺癌細胞的缺氧應答產(chǎn)生影響。

        SMAD2基因編碼的蛋白是信號傳感器和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器,調(diào)節(jié)多個信號通路。在本研究中,SMAD2被富集在Wnt信號通路和TGF-β信號通路上。已有很多文獻報道,Wnt信號與缺氧之間的關(guān)系,例如,Wnt信號通路中的β-連環(huán)蛋白可以與缺氧誘導因子HIF-1α相互作用,增強細胞對缺氧的適應能力[11]。HIF-1α可以通過抑制β-連環(huán)蛋白的活性來阻礙Wnt信號通路,該機制可能與缺氧誘導的腫瘤細胞生長抑制有關(guān)[12]。上述研究表明,Wnt信號通路在細胞缺氧應答過程中具有非常重要的作用。另外,目前也有很多關(guān)于缺氧與TGF-β信號關(guān)系的研究報道,例如缺氧(1%O2)可以誘導TGF-β1的表達和SMAD2磷酸化,激活肝星狀細胞的活性[13]。TGF-β信號通路還可以調(diào)節(jié)缺氧誘導的新生小鼠肺血管重建過程[14]。上述研究結(jié)果顯示,TGF-β信號通路與缺氧關(guān)系密切。缺氧會誘導SMAD2蛋白的磷酸化,這是細胞缺氧應答過程中一個十分重要的機制[15-16]。但目前還沒有文獻報道hsa-miR-769-5p與缺氧的關(guān)系。筆者推測,hsa-miR-769-5p可能通過調(diào)節(jié)ARID1A和SMAD2等基因的表達,間接調(diào)控Wnt信號通路和TGF-β信號通路,從而在肺腺癌細胞的缺氧應答中發(fā)揮重要功能。

        本研究發(fā)現(xiàn),在上調(diào)miRNA和下調(diào)miRNA靶基因富集的GO功能和KEGG通路中,有些功能和通路是一樣的,例如在GO功能富集結(jié)果中,DNA轉(zhuǎn)錄、多細胞有機體發(fā)育、離子轉(zhuǎn)運、核染色質(zhì)修飾與代謝過程等功能均被上調(diào)miRNA和下調(diào)miRNA的靶基因富集到。該研究結(jié)果表明,在肺腺癌細胞的缺氧應答中,該功能可能受上調(diào)miRNA和下調(diào)miRNA的共同調(diào)控。在KEGG通路富集結(jié)果中,Wnt信號通路、TGF-β信號通路、MAPK信號通路和黏著斑等通路均被上調(diào)miRNA和下調(diào)miRNA的靶基因富集到。心肌缺氧導致細胞內(nèi)pH降低,促進P38 MAPK的磷酸化,從而激活該信號通路,而抑制該通路則會使心肌細胞免于缺氧導致的細胞凋亡[17]。還有研究報道,缺氧可以激活MAPK信號通路[18]。另外,缺氧也會激活黏著斑激酶的活性和亞細胞遷移,促進黏著斑蛋白的磷酸化[19]。

        綜上所述,本研究利用miRNA芯片技術(shù)和相關(guān)生物信息學分析手段,在經(jīng)缺氧處理的人肺腺癌A549細胞中篩選出14個差異表達的miRNA,包括9個上調(diào)miRNA和5個下調(diào)miRNA。而且差異表達的miRNA及其靶基因可能在肺腺癌A549細胞的缺氧反應中具有十分重要的功能。另外,靶基因參與的一些生物學功能以及一些通路功能可能在肺腺癌細胞的缺氧反應中發(fā)揮重要作用。該miRNA和靶基因的表達水平變化,以及對肺腺癌細胞的一些功能影響還需后續(xù)實驗進一步驗證。本研究結(jié)果為深入探索缺氧對肺癌細胞在分子層面的影響提供理論基礎和實驗依據(jù),也為臨床治療肺癌提供一些潛在藥物靶點。

        參考文獻:

        [1]SHENOUDA S K,ALAHARI S K.MicroRNA function in cancer: oncogene or a tumrosuppressor[J].Cancer Metastasis Rev,2009, 28(3/4):369-378.

        [2]KULSHRESHTHA R,DAVULURI R V,CALIN G A,et al.A microRNA component of the hypoxicresponse[J].Cell Death Differ, 2008,15(4):667-671.

        [3]BABAR I A,CZOCHOR J,STEINMETZ A,et al.Inhibition of hypoxia-induced miR-155radiosensitizes hypoxiclung cancer cells[J].Cancer Biology Therapy,2011,12(10):908-914.

        [4]GROSSO S,DOYEN J,PARKS S K,et al.MiR-210 promotes a hypoxic phenotype and increases radioresistance in human lung cancer cell lines[J].Cell Death Disease,2013,4(3):544.

        [5]BENJAMINI Y,HOCHBERG Y.Controlling the false discovery rate:a practical and powerful approach to multiple testing[J]. Journal of the Royal Statistical Society,1995,57(57):289-300.

        [6]TALKS K L,TURLEY H,GATTER K C,et al.The expression and distribution of the hypoxia-inducible factors HIF-1α and HIF-2α in normal human tissues,cancers,and tumor-associated macrophages[J].the American Journal of Pathology,2000,157(2): 411-421.

        [7]DEHDASHTI F,MINTUN M A,LEWIS J S,et al.In vivo assessment of tumor hypoxia in lung cancer with 60Cu-ATSM[J]. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging,2003,30(6):844-850.

        [8]YANG C,YANG Z,ZHANG M,et al.Hydrogen sulfide protects against chemical hypoxia-induced cytotoxicity and inflammation in HaCaT cells through inhibition of ROS/NF-κB/COX-2 pathway[J]. PLoS one,2011,6(7):DOI:10.1371/journal.pone.0021971.

        [9]NIE Z,XUE Y,YANG D,et al.A specificity and targeting subunit of a human SWI/SNF family-related chromatin-remodeling complex[J].Mol Cell Biol,2000,20(23):8879-8888.

        [10]KENNETH N S,MUDIE S,VAN UDEN P,et al.SWI/SNF regulates the cellular response to hypoxia[J].Journal of Biological Chemistry,2009,284(7):4123-4131.

        [11]KAIDI A,WILLIAMS A C,PARASKEVA C.Interaction between β-catenin and HIF-1 promotes cellular adaptation to hypoxia[J].Nature Cell Biology,2007,9(2):210-217.

        [12]LIM J H,CHUN Y S,PARK J W.Hypoxia-inducible factor-1α obstructs a Wnt signaling pathway by inhibiting the hARD1-mediated activation of β-catenin[J].Cancer Research,2008,68(13): 5177-5184.

        [13]SHI Y F,FONG C C,ZHANG Q,et al.Hypoxia induces the activation of human hepatic stellate cells LX-2 through TGF-β signaling pathway[J].FEBS Letters,2007,581(2):203-210.

        [14]AMBALAVANAN N,NICOLA T,HAGOOD J,et al.Transforming growth factor-βsignaling mediates hypoxia-induced pulmonary arterial remodeling and inhibition of alveolar development in newborn mouse lung[J].American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology,2008,295(1):86-95.

        [15]ZHANG H,AKMAN H O,SMITH E L,et al.Cellular response to hypoxia involves signaling via smad proteins[J].Blood,2003, 101(6):2253-2260.

        [16]TAKAHASHI T,TAKAHASHI I,KOMATSU M,et al.Mutations of the NOG gene in individuals with proximal symphalangism and multiple synostosis syndrome[J].Clin Genet,2001, 60(6):447-451.

        [17]ZHENG M,REYNOLDS C,JO S H,et al.Intracellular acidosis-activated p38 MAPK signaling and its essential role in cardiomyocyte hypoxic hypoxia and reoxygenation stimulates MAP kinase signaling injury[J].The FASEB Journal,2005,19(1): 109-111.

        [18]MILLAR T M,PHAN V,TIBBLES L A.ROS generation in endothelial and kinase-dependent neutrophil recruitment[J].Free Radical Biology and Medicine,2007,42(8):1165-1177.

        [19]SEKO Y,TAKAHASHI N,SABE H,et al.Hypoxia induces activation and subcellular translocation of focal adhesion kinase (p125 FAK)in cultured rat cardiac myocytes[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,1999,262(1):290-296.

        (童穎丹編輯)

        中圖分類號:R 734.2

        文獻標識碼:A

        DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.13.007

        文章編號:1005-8982(2016)13-0037-06

        收稿日期:2015-12-21

        *基金項目:黑龍江省自然科學然基金(No:D201230)

        [通信作者]鮑永霞,E-mail:baoyongxia@126.com;Tel:13936196255

        MicroRNA gene chip analysis of human lung adenocarcinoma A549 cells in anoxic microenvironment*

        Ying Geng1,Yong-xia Bao1,Jing-bin Xiao2,Dong-jie Ge3,Zheng Liang1
        (1.Department of Respiratory Diseases,the Second Affiliated Hospital,Harbin Medical University,Harbin,Heilongjiang 150081,China;2.Director Healthcare Room,the Military Region Hospital of Heilongjiang Province,Harbin,Heilongjiang 150009,China;3.Department of Respiratory Diseases,the First Hospital of Harbin,Harbin,Heilongjiang 150010,China)

        Abstract:Objective To analyze the effect of hypoxia on miRNA expression in lung adenocarcinoma A549 cells.Methods Based on miRNA chip technology and bioinformatic analysis methods,differential expression of miRNAs between hypoxia-treated A549 cells and normoxia-treated A549 cells were identified,and their target genes were predicted.Besides,biological functions and pathways of target genes were analyzed. Results In total,14 differentially-expressed miRNAs were screened,including 9 upregulated miRNAs and 5 downregulated miRNAs in the hypoxia-treated A549 cells.Target genes of both upregulated and downregulated miRNAs were enriched in GO terms,such as DNA transcription,chromatin modification,as well as a set of pathways,such as Wnt signaling,TGF-beta signaling and MAPK signaling.Conclusions In the hypoxic A549 cells,miRNA expressions have significantly changed.A series of differentially-expressed miRNAs regulate certain genes.

        Keywords:lung adenocarcinoma;A549 cell;chip;hypoxia;differentially-expressed microRNA

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