丁新倫　謝荔巖　張潔　吳祖建

(福建農(nóng)林大學 植物病毒研究所/福建省植物病毒重點實驗室， 福州 350002； *通訊聯(lián)系人， E-mail： wuzujian@126.com)

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水稻草矮病毒侵染的水稻根系差異蛋白鑒定

丁新倫謝荔巖張潔吳祖建*

(福建農(nóng)林大學 植物病毒研究所/福建省植物病毒重點實驗室， 福州 350002；*通訊聯(lián)系人， E-mail： wuzujian@126.com)

DING Xinlun， XIE Liyan， ZHANG Jie， et al. Identification of differentially expressed proteins in roots of rice(Oryzasativa) infected withRicegrassystuntvirus.ChinJRiceSci, 2016, 30(4): 356-362.

丁新倫， 謝荔巖， 張潔， 等. 水稻草矮病毒侵染的水稻根系差異蛋白鑒定. 中國水稻科學， 2016， 30(4)： 356-362.

摘要:為鑒定與水稻草矮病毒(Rice grassy stunt virus， RGSV)侵染引起的水稻根系發(fā)育不良的相關蛋白，解析根系發(fā)育不良癥狀的形成機理以及水稻草矮病毒與水稻互作的分子機制，采用雙向熒光差異凝膠電泳(2D-DIGE)結(jié)合基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF-MS)對RGSV侵染水稻后根系的差異表達蛋白進行分離和鑒定，并對鑒定的差異表達蛋白進行GO聚類分析和KEGG生物通路注釋。結(jié)果表明，差異倍數(shù)大于2的蛋白質(zhì)點有56個，其中，表達豐度升高的點有34個，表達豐度下降的點有22個；質(zhì)譜成功鑒定出27個蛋白質(zhì)點，分屬于25種蛋白質(zhì)。GO聚類分析表明差異表達蛋白涉及14個生物學過程，在生物功能上分屬10類。細胞組件分析顯示差異表達蛋白定位于不同的細胞部位。KEGG通路分析顯示差異蛋白參與了12個生物通路。

關鍵詞:水稻草矮病毒； 水稻根系； 差異表達蛋白； 雙向熒光差異凝膠電泳； 基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜技術(shù)

植物受病毒侵染后不僅地上部會表現(xiàn)各種癥狀，而且地下根系的發(fā)育也會受到影響。病毒侵染導致根系發(fā)育異常主要表現(xiàn)出根變短、根細弱、不定根減少、根質(zhì)量下降、褐根多和易拔起等癥狀。如南方水稻黑條矮縮病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus，SRBSDV)導致水稻根系不發(fā)達，須根少而短，嚴重時根系呈黃褐色[1]。黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)引起煙草和辣椒根系變短，根質(zhì)量下降[2]。大豆花葉病毒(Soybean mosaic virus，SMV)可使感病品種大豆根系生長量減少57%～60%[3]，馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)甚至可導致根系壞死[4]。盡管病毒侵染引起寄主根系發(fā)育異常的現(xiàn)象已引起關注，但已有報道多是對其癥狀的描述，而有關病毒引起根系癥狀異常的分子機制研究則較少，機理也不清楚。王煜煒等[5]研究表明黃瓜花葉病毒(CMV-Fny-satT1)和番茄不孕病毒(TAV-Bj)侵染番茄引起與根系發(fā)育相關miR164的含量升高，而其靶標NAC1mRNA含量明顯降低，最終導致側(cè)根數(shù)量大大減少。

水稻草矮病毒，又稱水稻草狀矮化病毒(Rice grassy stunt virus，RGSV)，屬于纖細病毒屬(Tenuivirus)。該病毒侵染引起的水稻草矮病(Ricegrassystunt)主要發(fā)生在熱帶和亞熱帶稻區(qū)，最早于1964年在菲律賓被首先確認，隨后在中國、日本、南亞及東南亞的一些國家陸續(xù)被報道。我國的廣東、廣西、海南、福建和臺灣等地也有發(fā)生的報道[6]。RGSV侵染除了引起水稻植株嚴重矮化和分蘗增多等地上癥狀外，還嚴重干擾根系的發(fā)育，表現(xiàn)為根系不發(fā)達、根長變短、根質(zhì)量減輕、不定根減少等癥狀。丁新倫等[7]研究發(fā)現(xiàn)，RGSV侵染水稻后可引起根系發(fā)育相關基因OsPHR2和Crl-5基因下調(diào)表達。

比較蛋白質(zhì)組學技術(shù)已成為生命科學領域十分有效的研究手段，可以檢測參與RGSV和寄主水稻互作的多個蛋白質(zhì)。本研究采用雙向熒光差異凝膠電泳(2D-DIGE)結(jié)合基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF-MS)對RGSV侵染的水稻根系在蛋白質(zhì)表達水平的變化進行了分析，旨在鑒定與RGSV侵染引起水稻根系發(fā)育不良的相關蛋白，結(jié)果將有助于解析根系發(fā)育不良癥狀的形成機理，也為進一步理解RGSV與水稻互作的分子機制提供線索。

1材料與方法

1.1材料

RGSV毒源和昆蟲介體無毒褐飛虱(Nilaparvata lugens)均由福建農(nóng)林大學植物病毒研究所保存。供試水稻為雜交水稻汕優(yōu)63。DIGE試劑盒、IPG膠條(24cm，pH4～pH7)均購自美國GE公司；甲醇和丙酮等有機試劑購自美國ThermoFisher公司；交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)購自美國BBI公司。

1.2方法

1.2.1取樣

將昆蟲介體褐飛虱在RGSV病株上飼毒72h，并轉(zhuǎn)飼于水稻健株上度過循回期，隨后接種汕優(yōu)63幼苗，傳毒72h，接種后30d取樣。經(jīng)無毒褐飛虱取食后的汕優(yōu)63植株作為對照。8～10株水稻根系混合取樣，RGSV處理和對照各設3次重復。樣品在液氮中速凍后，保存于-80℃下。

1.2.2蛋白質(zhì)的提取與純化

水稻根系蛋白的提取與純化參照Carpentier等[8]的方法，略有修改。取3g根系在液氮中研磨，酚提取液(0.1gPVPP、10mL酚提取液和10mLTris飽和酚)抽提；冰上30min后離心(5000r/min，30min)；取上層酚相，再用等體積的酚提取液抽提；加入5倍體積的醋酸銨甲醇溶液，冰上30min后，-20℃下過夜；離心(5000r/min，30min)，沉淀用甲醇和丙酮先后洗滌，再用丙酮溶解，離心(12 000r/min，20min)，將獲得的沉淀室溫干燥，即可得到蛋白質(zhì)團塊，-80℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3一向等電聚焦和二向SDS-PAGE

在干燥后的蛋白質(zhì)團塊中加入200μLAlKlysis緩沖液(20mmol/LTris，2mol/L硫脲，7mol/L尿素和2%CHAPs)溶解(pH8.5)。Cy3染料和Cy5染料分別用于標記健株和病株根系的蛋白，Cy2染料標記健株和病株根系等量混合后的蛋白作為內(nèi)標。使用不同染料標記的蛋白在同一根IPG膠條和同一張膠里進行電泳，IPG等電聚焦系統(tǒng)(GE公司)進行雙向凝膠電泳第1向，等電聚焦程序如下：S1， 0.5h升至300V；S2, 0.5h升至700V；S3， 1.5h升至1500V；S4，3h運行到9000V；S5， 9000V下保持4h，整個聚焦過程總電壓為52kV·h。將平衡好的膠條轉(zhuǎn)移到12.5%SDS-PAGE凝膠上，置于ETTANDALTsix電泳系統(tǒng)(GE)，二向電泳程序如下：先以2W/膠條運行45min；然后再以17W/膠條運行約4.5h，直至溴酚藍跑到底。

1.2.4掃描與圖像分析

經(jīng)熒光標記的蛋白用激光掃描儀Typhoon9400(GE公司)掃描獲得2D-DIGE的蛋白表達圖像，采用圖像分析軟件系統(tǒng)ImageMaster2Dplatinum7.0(GE)對圖像進行分析，以確立差異表達大于1.5倍的蛋白質(zhì)點。

1.2.5MALDI-TOF-MS鑒定及蛋白質(zhì)查詢

選取的蛋白質(zhì)經(jīng)酶解后，委托廣州輝駿生物科技有限公司采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀(AutoflexspeedTMMALDI-TOF-TOF，BrukerDalton，德國)進行質(zhì)譜分析。實驗樣品的質(zhì)譜圖均以默認模式獲得。利用軟件BioTools(BrukerDalton)在NCBI數(shù)據(jù)庫中尋找相匹配的蛋白質(zhì)并進行功能查詢。

1.2.6生物信息學分析

采用GOminer軟件對差異蛋白進行基因本體(Geneontology，GO)聚類分析，在京都基因與基因組百科全書(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes，KEGG)數(shù)據(jù)庫中進行生物通路分析。

A-Cy3標記水稻健株根部蛋白，Cy5標記RGSV水稻病株根部蛋白；B-Cy3 標記RGSV水稻病株根部蛋白，Cy5 標記水稻健株根部蛋白；C-RGSV病株根部差異蛋白表達升高；D-健株根部差異蛋白表達升高。

A,Cy3-labeledproteinsofRGSV-uninfectedriceroots.Cy5-labeledproteinsofRGSV-infectedriceroots.B,Cy3-labeledproteinsofRGSV-infectedriceroots；Cy5-labeledproteinsofRGSV-uninfectedriceroots.C,Up-regulatedproteinsinRGSV-infectedriceroots.D,Up-regulatedproteinsinuninfectedriceroots.

圖1水稻病健植株根部蛋白雙向凝膠電泳及差異表達蛋白位點

Fig. 1. 2-DEmapsofproteinsinricerootsinfectedwithRGSV.

2結(jié)果與分析

2.1RGSV侵染水稻根部差異表達蛋白質(zhì)組分析

RGSV水稻病株和健株根部蛋白的雙向熒光差異凝膠電泳疊加圖見圖1-A和1-B。DIGE分析顯示RGSV侵染水稻后根部差異倍數(shù)大于1.5的差異蛋白質(zhì)點有141個(圖1)，其中，表達豐度升高的點有60個(圖1-C)，表達豐度下降的點有81個(圖1-D)；而差異倍數(shù)大于2的蛋白質(zhì)點有56個，其中，表達豐度升高的點有34個，表達豐度下降的點有22個。

圖2經(jīng)質(zhì)譜鑒定的差異表達蛋白點的放大圖

Fig. 2.The‘spotview’ofproteinsidentifiedbyMS.

2.2差異表達蛋白MALDI-TOF-MS鑒定

在差異倍數(shù)大于2的蛋白質(zhì)點中選取42個差異表達最明顯的蛋白質(zhì)點進行MALDI-TOF-MS分析，鑒定出27個蛋白質(zhì)點，各蛋白的電泳斑點局部放大見圖2。在鑒定出的蛋白質(zhì)中表達上調(diào)的有15個，下調(diào)的有12個。B50和B51經(jīng)鑒定同為RGSV的P5蛋白，B53和B57經(jīng)鑒定同為RGSV的20.6kD非結(jié)構(gòu)蛋白。通過與NCBI數(shù)據(jù)庫比對和查詢，獲得各蛋白點的信息，包含蛋白質(zhì)的名稱、等電點、分子量、登錄號、蛋白質(zhì)得分和差異蛋白比值(表1)。

2.3差異蛋白的生物信息學分析

對已鑒定的差異蛋白進行GO功能注釋。生物學過程分析表明差異蛋白涉及生物合成過程、碳水化合物代謝過程、細胞氨基酸代謝過程、運輸、小分子代謝過程、分解代謝過程、對脅迫的響應、含堿基化合物的分解過程、細胞氮化合物代謝過程和前體代謝物質(zhì)和能量的產(chǎn)生等多個生物學過程。在生物功能上分屬10類，包括離子作用、激酶活性、ATP酶活性、跨膜轉(zhuǎn)運活性、氧化還原酶活性、裂解酶活性、RNA結(jié)合、DNA結(jié)合、結(jié)合核酸的轉(zhuǎn)錄因子活性和水解酶活性。細胞組件分析顯示差異蛋白定位于細胞質(zhì)、蛋白復合體、胞液、胞內(nèi)、線粒體、質(zhì)體、核、質(zhì)膜和細胞壁等部位。

KEGG通路分析顯示，3個蛋白參與了代謝途徑，2個蛋白參與了次級代謝產(chǎn)物的生物合成，其他10個蛋白分別參與了乙醛酸和二羧酸代謝、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的蛋白質(zhì)加工過程、丙酮酸代謝、檸檬酸循環(huán)、苯丙氨酸代謝、光合生物固碳反應、植物與病原物互作、氧化磷酸化、碳代謝和類苯丙烷合成等生物通路。

3討論

本研究利用2D-DIGE技術(shù)分析了RGSV侵染水稻根系的差異表達蛋白譜，并利用質(zhì)譜技術(shù)鑒定了部分差異蛋白。本研究鑒定了25個差異蛋白，其中包括2個RGSV編碼的病毒蛋白和23個寄主水稻的蛋白。水稻草矮病株根部OsPHR2和Crl-5基因表達下調(diào)[7]。本研究未鑒定到這兩個蛋白，這2個蛋白表達量變化還需進一步的實驗分析。丁新倫等[9]在水稻草矮病株葉部中鑒定了24個蛋白，包含2個病毒蛋白和22個寄主蛋白，在水稻草矮病毒根部和葉部鑒定到的病毒蛋白均為P5蛋白和20.6kD非結(jié)構(gòu)蛋白，而鑒定到的根部蛋白和葉部蛋白均不同。

表1經(jīng)質(zhì)譜鑒定的差異表達蛋白

Table1.DifferentiallyexpressedproteinsidentifiedbyMS.

編號SpotNo.蛋白質(zhì)名稱Proteinname登錄號AccessionNo.蛋白質(zhì)得分Proteinscore蛋白質(zhì)分子量ProteinMW/Da蛋白質(zhì)等電點ProteinPI差異蛋白比值RatioA09假定蛋白OsI_11950(秈稻)HypotheticalproteinOsI_11950(indica)gi|125544232186933785.94-2.56A135-甲基四氫蝶酰三谷氨酸高半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(長春花)5-methyltetrahydropteroyltriglutamate-homocysteinemethyltransfer(Catharanthusroseus)120850896.10-2.09A23Alpha-L-阿拉伯呋喃糖苷酶C端家族蛋白(粳稻)Alpha-L-arabinofuranosidaseC-terminusfamilyprotein(japonica)gi|108707861143744794.91-3.34A37Os04g0670800(粳稻)Os04g0670800(japonica)gi|11546123273378185.29-2.31A39假定蛋白OsJ_19476(粳稻)HypotheticalproteinOsJ_19476(japonica)gi|222632492294553896.00-2.05A42Os01g0615300(粳稻)Os01g0615300(japonica)gi|11543857677461335.13-2.26A46S-腺苷甲硫氨酸合成酶2S-adenosylmethioninesynthase2gi|3024122185433305.68-2.49A54腺苷激酶(水稻)Adenosinekinase(Oryzasativa)gi|21698922164325735.29-3.04A59Os10g0478200(粳稻)Os10g0478200(japonica)gi|115482534184358885.75-2.06A67Os05g0247100(粳稻)Os05g0247100(japonica)gi|297604125270327576.08-3.22A75苯丙氨酸解氨酶(粳稻)Phenylalanineammonia-lyase(japonica)PAL1_ORYSJ372760216.07-3.25A78Os04g0659300(粳稻)Os04g0659300(japonica)gi|115461070148279165.01-3.20B07具有CCCH鋅指結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)32(粳稻)ZincfingerCCCHdomain-containingprotein32(japonica)C3H32_ORYSJ25807955.33+2.41B09可能的依賴于RNA的RNA聚合酶4(粳稻)ProbableRNA-dependentRNApolymerase4(japonica)RDR4_ORYSJ231335126.65+2.59B12tRNAwybutosine合成同源蛋白1(粳稻)tRNAwybutosine-synthesizingprotein1homolog(japonica)TYW1_ORYSJ24720625.90+2.04B15熱激蛋白90(粳稻)Heatshockprotein90(japonica)gi|3910446899804494.98+11.05B38Os01g0940800(粳稻)Os01g0940800(japonica)gi|11544215598348334.65+2.81B41谷蛋白-2(玉米)Glutelin-2(Zeamays)GLU2_MAIZE26245288.40+2.29B47假定蛋白OsI_34134(秈稻)HypotheticalproteinOsI_34134(indica)gi|125532460177247415.50+2.25B48病程相關類甜蛋白(水稻)Pathogenesis-relatedthaumatin-likeprotein(Oryzasativa)gi|2062387199200244.52+2.10B50P5蛋白(水稻草矮病毒)P5protein(Ricegrassystuntvirus)gi|483926501204219326.89+10.59B51P5蛋白(水稻草矮病毒)P5protein(Ricegrassystuntvirus)gi|483926501387219326.89+10.09B5320.6kD非結(jié)構(gòu)蛋白(水稻草矮病毒)20.6kDnonstructuralprotein(Ricegrassystuntvirus)gi|9635244264207405.18+20.61B5720.6kD非結(jié)構(gòu)蛋白(水稻草矮病毒)20.6kDnonstructuralprotein(Ricegrassystuntvirus)gi|9635244264207405.18+344.16B58假定蛋白OsI_28286(秈稻)HypotheticalproteinOsI_28286(indica)gi|125560596168386505.85+3.57B59Os12g0555000(粳稻)Os12g0555000(japonica)gi|11548901478170044.88+2.13B60Os01g0348900(粳稻)Os01g0348900(japonica)gi|115436436216151635.00+2.70

+， 上調(diào)； -， 下調(diào)。

+,Up-regulated; -,Down-regulated.

在水稻病株根系中鑒定到2個RGSV編碼蛋白：22kDP5和20.6kD非結(jié)構(gòu)蛋白。RGSV22kDP5是vRNA5編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白，可在水稻病株葉片[9-10]和介體褐飛虱中大量積累[10]，可能在病毒侵染植物和昆蟲介體中起作用。20.6kD非結(jié)構(gòu)蛋白由vRNA6編碼，可在水稻病葉中大量積累[9-10]，其含量變化與癥狀的嚴重度密切相關，為病害特異性蛋白(Specific-diseaseprotein，SP)[11-12]。本研究表明，P5蛋白和20.6kD非結(jié)構(gòu)蛋白均可在RGSV侵染的水稻根系中積累，20.6kD非結(jié)構(gòu)蛋白積累量更多。P5和20.6kD非結(jié)構(gòu)蛋白可能是RGSV侵染引致水稻根系發(fā)育異常的關鍵蛋白。

在鑒定出的水稻蛋白中，有5個蛋白參與脅迫反應，包括S-腺苷甲硫氨酸合成酶2、熱激蛋白90、病程相關類甜蛋白、Os10g0478200、和Os12g0555000。蛋白點A46鑒定為S-腺苷甲硫氨酸合成酶2，催化合成S-腺苷甲硫氨酸，是生物體內(nèi)主要的甲基供體，并且另一蛋白點A13鑒定為5-甲基四氫蝶酰三谷氨酸高半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶。這2種蛋白均參與了與甲基轉(zhuǎn)移相關的反應，基因表達均下調(diào)。由此可以推測與甲基轉(zhuǎn)移相關的反應，如DNA的甲基化等，在RGSV和水稻互作中起調(diào)控作用。蛋白點B15鑒定為熱激蛋白90(Heatshockprotein90，HSP90)，HSP90在植物生長發(fā)育、對非生物脅迫環(huán)境應答和抗病性反應中起著重要作用[13]。煙草HSP90與RAR1和TIR-NB-LRR蛋白互作，提高了植株對煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)的抗性[14]。在小麥植株中過表達TaHsp90.2和TaHsp90.3基因，可顯著提高其對條銹病的抗性[15]。RGSV侵染后誘導HSP90上調(diào)表達，KEGG通路分析顯示其參與植物與病原物互作途徑。RGSV侵染可誘導HSP90在水稻根中表達，HSP90可能在水稻對RGSV的抗病反應中起重要作用。蛋白點B48鑒定為病程相關類甜蛋白(thaumatin-likeprotein,TLP)，該蛋白屬于病程相關蛋白的PR5家族，病原物可誘導其表達，與植物的抗逆性有關。TLPs可參與多種植物病原真菌侵染之后的主動防御反應，如水稻紋枯病菌(Rhizocotoniasolani)侵染水稻可誘導TLPs基因表達，提高了水稻對該病原菌的抗性[16-17]。RGSV侵染誘導TLP基因表達上調(diào)，TLP可能參與了RGSV侵染后水稻的主動防御反應過程。

蛋白點B09鑒定為可能的依賴于RNA的RNA聚合酶4。植物RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependantRNApolymerase,RDR)主要參與了與植物基因沉默相關的小RNA產(chǎn)生，通過基因沉默效應放大作用，以調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育、逆境應答以及對病毒的防御等生物學過程[18]。煙草NtRDR1和擬南芥AtRDR1受病毒感染的誘導而表達，并且基因的缺失影響著植物對病毒的防御能力[19-20]。RNA依賴性RNA聚合酶OsRDR6在水稻抵御條紋葉枯病毒的過程中發(fā)揮重要作用[21]。可能的依賴于RNA的RNA聚合酶4受RGSV的誘導表達上調(diào)，可能參與了水稻對RGSV的抗性反應。

蛋白點A75鑒定為苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanineammonia-lyase,PAL)。PAL是植物苯丙氨酸類代謝過程中關鍵限速酶，其產(chǎn)物木質(zhì)素、黃酮和酚類物質(zhì)與抗病性相關[22-23]。植物激素水楊酸(SalicylicAcid，SA)是植物抗病反應的信號分子，PAL也是SA合成途徑中的關鍵酶之一[24-25]。Tonnessen等[26]的研究表明OsPAL4參與水稻的防衛(wèi)反應，在病原物的抗性反應中表達上調(diào)，缺失了OsPAL4基因的水稻突變體對水稻白葉枯病、稻瘟病和稻紋枯病感病性增強。RGSV可能通過干擾PAL的表達抑制植物的防御反應。

其他蛋白如假定蛋白OsI_11950和Os04g0670800等其功能未知。本研究在水稻草矮病株根系中鑒定出來的部分蛋白可能在水稻抗RGSV的抗性中起作用，其在根系發(fā)育異常以及RGSV與水稻互作中的作用還需進一步驗證。

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收稿日期:2015-12-28； 修改稿收到日期: 2016-05-23。

基金項目:國家自然科學基金資助項目(31301640)； 國家科技支撐計劃資助項目(2012BAD19B03)。

中圖分類號:S435.111.4； S511.034

文獻標識碼:A

文章編號:1001-7216(2016)04-0356-07

Identification of Differentially Expressed Proteins in Roots of Rice(Oryzasativa) Infected withRicegrassystuntvirus

DING Xin-lun， XIE Li-yan， ZHANG Jie， WU Zu-jian*

(KeyLaboratoryofPlantVirologyofFujianProvince/InstituteofPlantVirology,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou350002,China；*Corresponding author, E-mail： wuzujian@126.com)

Abstract:In order to find the proteins related to root maldevelopment caused by Rice grassy stunt virus(RGSV), elucidate the mechanism of root maldevelopment and better understand the molecular basis of interaction between RGSV and host rice, 2D-DIGE coupled with MALDI-TOF-MS was used to screen and identify differentially expressed proteins between RGSV-infected and RGSV-uninfected rice roots. The acquired proteins were further analyzed using GoMiner programs and KEGG pathway database. The results showed that 56 protein spots (differential ratio>2) were differentially expressed, including 34 up-regulated and 22 down-regulated protein spots. Among them, 27 differentially expressed protein spots which belonged to 25 proteins were identified, and these proteins were mainly involved in 14 biological processes, 10 molecular functions and 12 KEGG pathways.

Key words:Rice grassy stunt virus; rice roots； differentially expressed proteins; 2D-DIGE; MALDI-TOF-MS