席紅軍，張師紅,李炳義

(陜西省渭南市第二醫(yī)院 泌尿外科,陜西 渭南714000)

0 引言

Akt蛋白也稱作蛋白激酶B(PKB)，是一種絲氨酸特異性蛋白激酶，在多種細胞信號通路中發(fā)揮重要的作用，包括調(diào)控細胞存活、細胞凋亡、細胞增殖、轉(zhuǎn)錄和細胞遷移[1-3].研究表明，Akt蛋白在PI3K/AKT/mTOR等分子通路中[4]起關(guān)鍵性作用，并且通過磷酸化(p-Akt)和滅活特定蛋白，比如Bad，forkhead轉(zhuǎn)錄因子(forkhead transcription factors)，以及c-Raf 和caspase-9促進細胞存活[5-7].熱休克蛋白60( heat shock protein， HSP60)是一種線粒體分子伴侶，其功能是將細胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)折疊轉(zhuǎn)運到線粒體基質(zhì)，在細胞的免疫應答中起著重要作用[8]，在受到外界刺激后，迅速調(diào)節(jié)細胞免疫應答抵御各種侵襲.Tina[9]等人研究發(fā)現(xiàn),HSP60能夠激活細胞外信號相關(guān)激酶ERK-1/2、JNK、p38、NF-κB以及損傷性胰島素誘導的磷酸化Akt.活性氧(ROS)能夠攻擊細胞的遺傳物質(zhì)DNA，并可能對其增殖生長造成一定的影響.在此研究中，使用 H2O2對前列腺癌細胞PC3進行刺激，來研究HSP60的促炎癥或抗炎癥反應中是否對Akt蛋白的表達造成一定的影響，進而激活PI3K/AKT/mTOR，對細胞的存活形成一定的保護作用.

1 材料和方法

1.1 抗體及試劑

H2O2，Sigma公司；噻唑藍(MTT)及二甲基亞砜(DMSO)，Sigma公司；HSP60，Stressgen公司；Akt以及磷酸化Akt，Cell signaling公司；GAPDH，Ambion公司；辣根過氧化物二抗，BD公司.

1.2 主要儀器

倒置顯微鏡，Nikon公司；二氧化碳培養(yǎng)箱，美國Thermo公司；SDS電泳儀器以及電轉(zhuǎn)移，Bio-rad公司；臺式高速低溫離心機，美國Beckman 公司；DG-3022A 型酶標儀，美國Biotek 公司.

1.3 MTT法檢測細胞存活率

接種200 μL 3×104個·mL-1細胞于96 孔平底培養(yǎng)板上，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)72 h.加入H2O2與完全培養(yǎng)基混合液處理細胞，設(shè)置9組不同摩爾濃度的H2O2，見表1，每組設(shè)8 個平行孔，并設(shè)3個對照孔，即只加同摩爾濃度的H2O2混合液，培養(yǎng)24 h.每孔加入MTT 溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，去培養(yǎng)液，加200 μL DMSO溶液，振蕩10 min后，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定吸光度值(OD值)，測定波長570 nm.用公式(1)計算細胞存活率.

細胞存活率 (1)

1.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測蛋白的表達

收集處理24 h后的各組細胞，加入預冷的裂解液，輕微超聲粉碎細胞，低溫離心30 min，取上清即總蛋白.用Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度后，取50 μg蛋白上樣，通過分離膠后轉(zhuǎn)至NC膜上，10%脫脂奶粉+0.1%FBS室溫封閉1 h；加入鼠抗人HSP60、Akt、磷酸化Akt抗體和GAPDH抗體(抗體工作濃度均為1∶1000)；4 ℃過夜；用PBST洗膜10 min×3次，加入羊抗鼠二抗；室溫微搖1 h，PBS洗膜10 min×3次；曝光后照相以GAPDH抗體作為上樣對照，圖像分析系統(tǒng)測定HSP60、Akt和磷酸化Akt蛋白的表達，以目的蛋白與GAPDH相對灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量.

1.5 統(tǒng)計學方法

用ImageJ分析軟件測定Western Blotting印跡蛋白帶的灰度值，并計算目標帶測定值與GAPDH蛋白帶測定值的比值，繪制直方圖.采用GraphPad Prism 5.0 軟件進行分析，組間比較采用方差分析，p< 0.05為差別有顯著性統(tǒng)計意義.

2 結(jié)果

2.1 H2O2對細胞存活率的影響

細胞暴露于H2O2中，作用24 h后，細胞存活率呈下降趨勢，且細胞存活率與H2O2的摩爾濃度呈負相關(guān)，見圖1.各個濃度的實驗重復3次，結(jié)果表示為means±S.E.M.

圖1 不同濃度H2O2處理細胞24 h后細胞存活率

(與對照相比，*：p<0.05; **：p<0.01;***：p<0.001.下同)

2.2 H2O2對HSP60、Akt以及磷酸化Akt蛋白的影響

如圖2所示，7.312 μmol/L 的H2O2作用細胞24 h后，HSP60蛋白水平并未發(fā)生明顯改變，而15.625 μmol/L會導致HSP60蛋白表達水平的升高(p<0.05).同時，7.312 μmol/L以及15.625 μmol/L H2O2作用細胞24 h后，均會導致磷酸化Akt蛋白的顯著降低(p<0.05)，見圖3，但對總Akt蛋白的表達并無明顯改變(p>0.05)，見圖4.

圖2 不同摩爾濃度H2O2作用細胞24 h后 HSP60蛋白表達量Fig.2 The protein expression of HSP60treated by different concentrationsof H2O2 for 24 h圖3 不同摩爾濃度 H2O2作用細胞24 h后磷酸化Akt蛋白表達量Fig.3 The protein expression of p-Akt treated by different concentrations of H2O2 for 24 h圖4 不同摩爾濃度H2O2作用細胞24 h后,總Akt蛋白表達量Fig.4 The protein expression of Akt treated by different concentrations of H2O2 for 24 h

3 討論

HSP60蛋白能夠激活細胞外信號相關(guān)激酶(ERK1/2，JNK，P38，NF-kB)并能破壞胰島素介導脂肪細胞的p-Akt[9].在實驗中，HSP60蛋白表達上調(diào)，同時，檢測到磷酸化Akt蛋白表達下調(diào).PI3K是信號轉(zhuǎn)導酶中的一個保守家族，參與調(diào)控細胞增殖及存活.PI3K/Akt通路在炎癥發(fā)生發(fā)展和內(nèi)毒素血癥的發(fā)生中可能發(fā)揮重要的調(diào)控作用.PI3K持續(xù)表達于天然免疫細胞中，當細胞受病原微生物侵襲時，在TLRs成員的激發(fā)下，PI3K迅速活化，參與第一時間LPS信號通路的傳導及調(diào)控.研究表明LPS攻擊單核/巨噬細胞時可活化PI3K，活化的PI3K催化胞膜的磷脂肌醇的磷酸化，生成PI-3，4，5P3及PI3，4P2蛋白，從而引起PKB/Akt的膜移位及活化，在胞膜上募集的Akt可被磷脂酰肌醇依賴的激酶1活化，使其在Ser473及Thr308位雙磷酸化而被活化.本研究從H2O2刺激后Akt蛋白及磷酸化水平的表達變化角度，分析總Akt表達變化的原因及其意義，同時對HSP60的表達進行研究，以便對Akt信號通路的調(diào)控途徑有更深入的了解.該研究中，HSP60如何參與了Akt磷酸化水平的調(diào)控，從而在何種時期H2O2誘導的信號通路發(fā)揮了相應作用，如何發(fā)揮作用則是下一步需要研究的主要問題.