呂艷陽，陳芳芳，查純婷

(信陽師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，河南 信陽 464000)

0 引言

蒲公英為菊科多年生草本植物，由于蒲公英中的植物活性成分含有黃酮類、酚酸類物質(zhì)及植物甾醇等，故有一定的藥用價值，比如抑菌、解毒、抗氧化、抗腫瘤、通乳、提高免疫力、降低血糖等[1-4].現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床各科，如急性乳腺炎、呼吸道感染、淋巴結(jié)炎[5]等多種感染性炎癥.牛血清白蛋白(BSA)由580個氨基酸殘基組成的單鏈蛋白質(zhì)，其中包括能夠發(fā)出內(nèi)源性熒光的色氨酸殘基、酪氨酸殘基、苯丙氨酸殘基等[6-8].BSA的氨基酸序列與人血清白蛋白(HSA)的氨基酸序列高度相似，并且BSA具有相對分子質(zhì)量小、溶解度大、性質(zhì)穩(wěn)定、廉價易得的優(yōu)點.為了研究藥物與人血清白蛋白相互結(jié)合情況，所以人們經(jīng)常研究藥物與BSA的相互作用，因此具有廣泛的應(yīng)用價值.目前，關(guān)于天然藥物蒲公英與牛血清白蛋白相互作用的研究報道較少，本文利用熒光光譜法研究了蒲公英提取物與牛血清白蛋白BSA的相互作用，探討了不同濃度的蒲公英提取物和溶劑種類這兩個因素對熒光強度的影響.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Cary Eclipse型熒光分光光度計，美國瓦里安公司；HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞兒電器有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司.甲醇、95%乙醇、鹽酸、三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)(以上試劑均為分析純)，牛血清白蛋白(BSA，分子量為67 000，生化試劑)，實驗用水均為二次蒸餾水.蒲公英于2015年4月7日清晨采自信陽師范學(xué)院.

1.2 溶液的配制

0.100 0 mol/LTris溶液的配制：準確稱量三(羥甲基)氨基甲烷3.028 9 g，配成250 mL水溶液.

0.100 8 mol/L的HCl溶液的配制：用移液管準確移取2.1 mL濃鹽酸至250 mL容量瓶中，然后加蒸餾水定容.

1.0×10-4mol/L BSA水溶液的配制：稱量0.335 7 g，分子量為67 000 g/mol的牛血清白蛋白，加蒸餾水使之完全溶解，然后定容至50 mL容量瓶中.

1.3 實驗方法

1.3.1 蒲公英預(yù)處理

將新鮮的蒲公英洗凈，去除根.將蒲公英花、葉分離并剪碎.稱量20 g蒲公英花、蒲公英葉，分別加入100 mL甲醇、95%乙醇進行水浴回流，分別得到蒲公英花、葉甲醇提取液和蒲公英花、葉95%乙醇提取液.然后稀釋得到濃度為0.2 g/L的蒲公英花、葉甲醇分析試液，20 g/L的蒲公英花、葉95%乙醇分析試液.

1.3.2 相互作用的熒光發(fā)射光譜

在10 mL比色管中依次加入0、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5 mL蒲公英花(或葉)甲醇分析試液，1.5 mL鹽酸溶液，0.5 mLTris 溶液(pH=7.6)，濃度為1×10-4mol/L的BSA水溶液1 mL.最后加入蒸餾水定容至10 mL.混合均勻后靜止放置10 min，以280 nm為熒光激發(fā)波長，用Cary Eclipe 型熒光光譜儀在300～500 nm 范圍內(nèi)掃描其熒光發(fā)射光譜，并記錄實驗結(jié)果.

在10 mL比色管中依次加入0、1、2、3、4、5、6、7 mL蒲公英花(或葉)95%乙醇分析試液，1.5 mL鹽酸溶液，0.5 mL Tris 溶液(pH=7.6)，濃度為1×10-4mol/L的BSA水溶液1 mL.最后加入蒸餾水定容至10 mL.混合均勻后靜止放置10 min，以280 nm為熒光激發(fā)波長，用Cary Eclipe 型熒光光譜儀在300～500 nm 范圍內(nèi)掃描其熒光發(fā)射光譜，并記錄實驗結(jié)果.

2 結(jié)果與討論

2.1 蒲公英提取液濃度對熒光光譜的影響

按1.3.2實驗方法，分別改變蒲公英花、葉甲醇提取液，蒲公英花、葉乙醇提取液的濃度范圍，并分別掃描4種蒲公英提取液與BSA相互作用的熒光發(fā)射光譜，結(jié)果見圖1和圖2.

圖1 蒲公英花甲醇提取液與BSA的熒光發(fā)射光譜Fig.1 Fluorescence emission spectra of methanol extract of dandelion and BSA圖中從1到9曲線蒲公英甲醇提取液的濃度依次為：0、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11 g/L，Slit=5.0/5.0

圖2 蒲公英花乙醇提取液與BSA的熒光發(fā)射光譜Fig.2 Fluorescence emission spectra of ethanol extract of dandelion and BSA圖中從1到8曲線蒲公英乙醇提取液的濃度依次為：0、2、4、6、8、10、12、14 g/L，Slit=5.0/5.0

由圖1可以看出，在一定的蒲公英花甲醇提取液濃度范圍內(nèi)，其提取液會使BSA的熒光增強，且其熒光強度隨著蒲公英花甲醇提取液濃度的增加而增加.BSA的熒光最大發(fā)射波長隨著其濃度的增加無明顯紅移.蒲公英葉甲醇提取液也有類似現(xiàn)象.該結(jié)果表明，蒲公英花、葉甲醇提取液與BSA分子中能夠產(chǎn)生內(nèi)源熒光的色氨酸殘基發(fā)生了相互作用，其微環(huán)境發(fā)生了變化，以及受分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)的影響[6]，從而使其熒光強度增強.

由圖2可以看出，在一定的蒲公英花乙醇提取液濃度范圍內(nèi)，蒲公英花乙醇提取液均使BSA熒光猝滅，且其熒光強度隨著蒲公英花乙醇提取液濃度的增加而降低，BSA的熒光最大發(fā)射波長隨著蒲公英花乙醇提取液濃度的增加而明顯紅移.蒲公英葉乙醇提取液也有類似現(xiàn)象.該結(jié)果表明，BSA發(fā)出的內(nèi)源熒光強度的降低不僅是由于其殘基所處微環(huán)境的變化，還受分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)與熒光猝滅效應(yīng)的影響，BSA熒光的最大發(fā)射波長的紅移是由于BSA分子中Trp殘基[7]區(qū)域的疏水性減弱，導(dǎo)致BSA中熒光發(fā)色團本身及周圍環(huán)境極性增加.

2.2 熒光強度增值與蒲公英提取液濃度變化關(guān)系

蒲公英提取液與BSA相互作用的熒光強度增值隨其濃度的變化關(guān)系如圖3和圖4所示.

圖3 蒲公英花甲醇提取液與BSA相互作用的熒光強度增值隨其濃度的變化圖Fig.3 A graph of the fluorescence intensity value-added of methanol extract of dandelion and BSA interaction over its concentration

由圖3可以看出，隨著蒲公英花甲醇提取液濃度的增加，其與BSA相互作用的熒光強度增值也增加，基本呈線性增加關(guān)系.蒲公英葉甲醇提取液也是如此.

圖4 蒲公英花乙醇提取液與BSA相互作用的熒光強度增值隨其濃度的變化圖Fig.4 A graph of the fluorescence intensity value-added of ethanol extract of dandelion and BSA interaction over its concentration

由圖4可以看出，蒲公英花乙醇提取液與BSA相互作用的熒光強度增值隨其濃度的增加呈線性減少的關(guān)系.蒲公英葉乙醇提取液也是如此.

3 結(jié)論

通過對蒲公英提取物與BSA的相互作用的熒光光譜的研究，發(fā)現(xiàn)：蒲公英花、葉甲醇提取物使BSA的熒光強度增強，且其最大熒光發(fā)射波長無明顯紅移；蒲公英花、葉乙醇提取物使BSA的熒光產(chǎn)生猝滅，且其最大熒光發(fā)射波長明顯紅移；甲醇溶劑的熒光強度隨著其體積增加而增加，影響較大，乙醇則基本不變.蒲公英花或者葉甲醇提取液與BSA相互作用的熒光強度增值與其濃度的增加呈線性增加關(guān)系.蒲公英花乙醇提取液與BSA相互作用的熒光強度增值與其濃度的增加呈線性下降趨勢.蒲公英葉乙醇提取液與BSA相互作用的熒光強度增值與其濃度的增加呈平滑下降趨勢.