常洪濤，劉慧敏，李永濤，賀秀媛，趙　軍，陳　陸，王新衛(wèi)，楊　霞，王川慶*

(1.河南農業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，鄭州 450002；2.河南農業(yè)大學生命科學學院，鄭州 450002)

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豬圓環(huán)病毒2型合并感染腦心肌炎病毒對仔豬的致病性分析

常洪濤1#，劉慧敏2#，李永濤1，賀秀媛1，趙軍1，陳陸1，王新衛(wèi)1，楊霞1，王川慶1*

(1.河南農業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，鄭州 450002；2.河南農業(yè)大學生命科學學院，鄭州 450002)

摘要：旨在研究豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)感染仔豬后造成免疫抑制條件下，探索合并感染腦心肌炎病毒(EMCV)對仔豬的生長性能影響和致病性分析。選取16頭健康仔豬設計了EMCV攻毒組、PCV-2攻毒組、PCV-2/EMCV聯(lián)合攻毒組和對照組，通過臨床表現(xiàn)、組織病理學檢測、生長性能、免疫指標以及排毒情況等多方面評價，對二者合并感染仔豬的影響進行了研究。結果顯示，2種病毒單獨感染后，均表現(xiàn)出各自的典型臨床特征，危害均不嚴重。但合并感染后死亡率迅速上升，平均日增重顯著降低，體重負增長率升高，心肌和腦組織變性、壞死更為嚴重，血液中淋巴細胞比率始終較低，EMCV中和抗體較長時間維持在低水平。EMCV排毒期可持續(xù)至感染后第12 天，略長于EMCV單獨攻毒組的第9天。研究結果證實，PCV-2先期感染可使EMCV對仔豬表現(xiàn)出更為嚴重的致病性和致死性，免疫功能降低，并可能使得EMCV在豬體內的復制、排毒能力增強。

關鍵詞：豬圓環(huán)病毒2型；腦心肌炎病毒；合并感染；仔豬；致病性

腦心肌炎(encephalomyocarditis，EMC)是由腦心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus，EMCV)引起的一種以腦炎、心肌炎和繁殖障礙為主要臨床特征的人畜共患傳染病，目前呈世界性分布，也是危害養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的重要疫病之一[1]。國內自2005年成功分離到首株病毒以來[2]，截止2013年已分離到20多株不同動物源EMCV[3-5]，并證實豬群中感染較為普遍，但抗體陽性率差異顯著[6-9]，盡管尚未發(fā)生嚴重疫情，但其威脅日趨嚴重。EMCV屬微RNA病毒科、心病毒屬，為單股正鏈RNA病毒，基因組全長約7.8 kb，基本結構含有2個非翻譯區(qū)(5′-UTR：800～1 200 bp；3′-UTR：120 bp左右)[10]，二者之間為1個較大的ORF，長約6 879 bp，編碼一個由2 292個氨基酸組成的“多聚蛋白”，經(jīng)蛋白酶切割和進一步水解為VP1～VP4、2A～2C、3A～3D以及L蛋白等12個成熟的單體蛋白。

豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus，PCV)是一種無囊膜的單股環(huán)狀DNA病毒，可分為PCV-1和PCV-2兩型。PCV-1無致病性，PCV-2可造成斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、豬皮炎與腎病綜合征(PDNS)、先天性震顫(CNS)和繁殖障礙等疾病，其中以PMWS危害最為嚴重和普遍[11]。自1991年于加拿大首次報道以來，包括我國在內的許多國家和地區(qū)都有該病的發(fā)生和流行[12]。2010年后隨著商品化疫苗的大面積應用推廣，危害明顯有所降低。但PCV-2的靶細胞是單核-巨噬細胞[13]，可造成機體的嚴重免疫抑制，干擾和破壞免疫抗體的產生和維持，致使抵抗力下降，易繼發(fā)或并發(fā)其他病原體，使病情進一步加劇和復雜化。國內外已大量開展了關于PCV-2與豬繁殖與呼吸綜合征病毒[14]、豬細小病毒[15-16]等豬重要致病性病原合并感染或繼發(fā)感染的試驗，但系統(tǒng)研究PCV-2所致免疫抑制條件下，合并感染EMCV后對仔豬的生長性能影響和致病性分析，國內外迄今未見報道，因此進行了本試驗。

1材料與方法

1.1毒株和試驗動物

PCV-2 HNYY株由本實驗室分離、鑒定并保存，經(jīng)SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR 方法[17]測定病毒拷貝數(shù)為3.351×106copies·μL-1。

豬源EMCV YM13株由本實驗室分離、鑒定并保存，測定其TCID50為10-8.51·0.1 mL-1。

5周齡健康仔豬由洛陽市宜陽縣鵝宿種豬場提供，應用RT-PCR[18]和PCR分別檢測EMCV和PCV-2抗原均為陰性，應用ELISA法分別檢測EMCV和PCV-2血清抗體均為陰性。

1.2主要試劑

組織病理學檢測所用的常規(guī)試劑由河南農業(yè)大學動物病理學實驗室配制；PCV-2 ELISA抗體檢測試劑盒購自武漢科前動物生物制品有限責任公司；PCR和RT-PCR方法的相關試劑均由河南農業(yè)大學動物傳染病學實驗室提供。

1.3仔豬攻毒試驗

將16頭仔豬隨機分為4組，每組4頭，隔離飼養(yǎng)，分別命名為EMCV攻毒組、PCV-2攻毒組、PCV-2/EMCV聯(lián)合攻毒組和對照組。試驗前對圈舍進行徹底消毒，觀察5 d，無任何異常情況進行攻毒試驗，具體操作見表1。各組攻毒后置于相同條件下飼養(yǎng)，每日定時測量直腸體溫至14 d。同時詳細觀察、記錄各組豬臨床反應情況，至5周時試驗結束，隨機選擇2頭撲殺，采集病料用于相關指標的檢測。各組于試驗前稱量平均初始重，整個試驗期間每日仔細記錄試驗豬的采食量、日增重及飼料報酬，試驗結束后計算平均日增重，以測定對仔豬生長性能的影響。

1.4組織病理學檢測

采集各組試驗豬的新鮮心和腦組織，迅速固定，經(jīng)脫水透明、浸蠟和包埋，制作組織切片，用蘇木素-伊紅法(HE)染色后，置于顯微鏡下觀察。

1.5淋巴細胞比率測定

各組于試驗開始后第1、3、7、14和35 天分別于前腔靜脈采血2 mL，置入含EDTA的抗凝管中，應用全自動血細胞分析儀測定血液內的淋巴細胞比率。

1.6EMCV中和抗體測定

各組試驗豬于試驗開始后第1、3、7、14和35 天分別于前腔靜脈采血2 mL，測定EMCV中和抗體。

表1　仔豬攻毒試驗情況

1.7EMCV排毒情況測定

EMCV攻毒組于試驗開始后第1、7、9、10和14 天時，PCV-2/EMCV聯(lián)合攻毒組和對照組于試驗開始后第1、7、9、10、11、12、13、14和21 天時，分別采集肛門拭子，接種BHK-21細胞后收毒，應用RT-PCR方法檢測EMCVVP1基因[18]，以掌握排毒情況。

2結果

2.1體溫和日增重變化

2.1.1體溫變化各組動物試驗前測量體溫均在正常范圍。EMCV攻毒組感染后第1天體溫升至39.8 ℃，第3天達到峰值(40.5 ℃)，隨后逐步下降，第7天后一直在39.6～39.8 ℃之間波動；PCV-2攻毒組感染后第3～6天體溫略有升高(39.6～39.9 ℃)，隨后始終保持正常范圍；PCV-2/EMCV聯(lián)合攻毒組在感染EMCV后第1天體溫迅速升至40.5 ℃，至第3天達到峰值(41.2 ℃)，隨后逐步下降，第8 天后趨于穩(wěn)定，維持在39.7～39.9 ℃之間；對照組在整個試驗期內的體溫均在正常范圍值(圖1A)。2.1.2日增重變化各組平均日增重結果顯示(圖1B)，EMCV攻毒組(0.34 kg)、PCV-2攻毒組(0.30 kg)和PCV-2/EMCV聯(lián)合攻毒組(0.18 kg)的平均日增重均明顯低于正常對照組(0.45 kg)(P<0.05)。EMCV攻毒組和PCV-2攻毒組差異不顯著(P>0.05)，聯(lián)合攻毒組顯著低于2個單感染組和對照組(P<0.05)。分析相對增重率顯示(圖1C)，EMCV攻毒組(-24.4%)、PCV-2攻毒組(-33.3%)和聯(lián)合攻毒組(-60.0%)均為負值，且差異較為明顯，與對照組比較，提示生長速度均受到較大影響。

圖1　各試驗組的體溫和日增重變化Fig.1　Temperature and clinical symptoms and pathological daily gain changes in experimental groups

2.2病理變化

2.2.1EMCV攻毒組感染1～5 d時，出現(xiàn)精神不佳(圖2A)、食欲減退、呼吸困難、震顫等癥狀，至試驗結束無死亡，剖檢可發(fā)現(xiàn)心包積液(圖2B)，心肌柔軟、變性，胸腔積水，腦部輕度充血(圖2C)。

2.2.2PCV-2攻毒組感染14 d內的臨床表現(xiàn)和對照組基本一致，無明顯癥狀，僅見腹股溝淋巴結輕微腫大。22 d時逐步出現(xiàn)漸進性消瘦、被毛粗亂、貧血(圖3A)、黃疸和腹瀉，至試驗結束無死亡。剖檢可見全身淋巴結水腫、變性，心變形、質地柔軟、心包積液、心冠脂肪有膠凍樣滲出(圖3B)，腦部無明顯病變(圖3C)。2.2.3PCV-2/EMCV聯(lián)合攻毒組感染PCV-2 14 d時，臨床表現(xiàn)和對照組基本一致。繼發(fā)感染EMCV 1～3 d時，出現(xiàn)精神沉郁、食欲廢絕，5 d時出現(xiàn)步態(tài)蹣跚、呼吸困難和進行性麻痹，死亡2頭，其余存活至試驗結束，但瀕臨死亡(圖4A)。剖檢均可發(fā)現(xiàn)心包積液，并有纖維素性滲出，心肌嚴重變性(圖4B)，腦部充血明顯(圖4C)，脾腫大變形，腎腫脹、顏色變淡、時有灰白色壞死，胃、腸黏膜出血、壞死，有胸水、腹水。

圖2　EMCV感染豬的臨床癥狀和病理變化Fig.2　Clinical symptoms and pathological changes of EMCV infected piglets

圖3　PCV-2感染豬的臨床癥狀和病理變化Fig.3　Clinical symptoms and pathological changes of PCV-2 infected piglets

圖4　PCV-2/EMCV聯(lián)合感染豬的臨床癥狀和病理變化Fig.4　Clinical symptoms and pathological changes of PCV-2/EMCV concurrent infected piglets

2.2.4對照組至試驗結束時，對照組均未出現(xiàn)異常情況，無任何臨床癥狀和病理變化。

2.3組織病理學檢測

2.3.1EMCV攻毒組組織病理學檢查可發(fā)現(xiàn)心肌炎，心肌橫紋消失、心肌毛細血管充血(圖5A)，炎性細胞浸潤和心肌細胞變性壞死(圖5B)，組織顯微結構異常；神經(jīng)細胞變性、壞死(圖5C)。

2.3.2PCV-2攻毒組組織病理學檢查可發(fā)現(xiàn)心肌細胞充血，細胞質溶解(圖6A)，神經(jīng)細胞充血，有小膠質細胞包圍，呈現(xiàn)衛(wèi)星現(xiàn)象(圖6B)，腦細胞輕微壞死等。

2.3.3PCV-2/EMCV聯(lián)合攻毒組組織病理學檢查可發(fā)現(xiàn)心外膜充血，炎性細胞浸潤，橫紋消失，心肌細胞變性(圖7A)；神經(jīng)細胞嚴重變性、壞死，毛細血管擴張(圖7B)。

圖5　EMCV感染豬的組織病理學變化(40×)HEFig.5　Histopathological changes of EMCV infected piglets

圖6　PCV-2感染豬的組織病理學變化(40×)HEFig.6　Histopathological changes of PCV-2 infective piglets

圖7　PCV-2/EMCV聯(lián)合感染豬的組織病理學變化(40×)HEFig.7　Histopathological changes of PCV-2/EMCV concurrent infective piglets

2.3.4對照組組織病理學檢查未發(fā)現(xiàn)心肌和神經(jīng)細胞有明顯病理變化，心肌橫紋完整，神經(jīng)細胞正常。

2.4淋巴細胞比率測定

各組試驗豬的淋巴細胞比率測定結果顯示，攻毒EMCV 1 d時的淋巴細胞比率快速上升，至7 d達到峰值，隨后逐步下降，21 d后趨于穩(wěn)定；攻毒PCV-2 1 d時的淋巴細胞比率上升較慢，但至試驗結束一直呈逐步上升趨勢；PCV-2/EMCV聯(lián)合攻毒組的淋巴細胞比率緩慢上升，在整個試驗期內始終較低，且低于2個單獨攻毒組(表2)。正常對照組在整個試驗期內均在21.7%～26.4%之間波動，為正常范圍值。

表2　各試驗組的淋巴細胞比率測定±s)

2.5EMCV中和抗體測定

EMCV攻毒組和PCV-2/EMCV聯(lián)合攻毒組在感染EMCV的第1天，均可檢測到EMCV中和抗體，隨時間而逐步升高，14 d時達到峰值，EMCV攻毒組為29.5，PCV-2/EMCV聯(lián)合攻毒組僅為25.5，隨后緩慢下降。整個試驗期內，聯(lián)合攻毒組的中和抗體明顯低于EMCV攻毒組。PCV-2攻毒組和正常對照組的EMCV中和抗體在整個試驗期內均為0。

2.6EMCV排毒情況測定

排毒情況測定結果顯示，EMCV攻毒組和PCV-2/EMCV聯(lián)合攻毒組試驗豬所采集的肛門拭子，在攻毒后第1天均可檢測、分離到病毒；EMCV攻毒組最遲于第9天、PCV-2/EMCV聯(lián)合攻毒組最遲于第12天仍可檢測、分離到病毒(圖8)。

M.DL2000相對分子質量標準；1.陰性對照；2.陽性對照；3～5.EMCV攻毒組第1、7和9天；6～11.聯(lián)合攻毒組第1、7、9、10、11和12天；12.EMCV攻毒組第10、14天和聯(lián)合攻毒組第13、14和21天M.DL2000 DNA marker；1.Negative control；2.Positive control；3-5.1，7 and 9 d after EMCV challenge；6-11.1，7，9，10，11 and 12 d after concurrent challenge；12.10，14 d of after EMCV challenge and 13，14，21 d after concurrent challenge圖8　EMCV排毒情況測定Fig.8　Detection of EMCV detoxification

3討論

先前對EMCV的致病性研究均集中于單純感染[19-20]，而在生產實踐中多種病原體的共感染現(xiàn)象極為普遍，尤其是豬群中感染率極高的PCV-2所致的嚴重免疫抑制條件下，并發(fā)或繼發(fā)EMCV應引起高度關注。本研究所有試驗設計均在同一環(huán)境下完成，最大程度減少因環(huán)境差異而造成的誤差，從臨床表現(xiàn)、組織病理學檢測、免疫指標和排毒情況等多方面進行評價，以期為研究二者合并感染后在體內的相互作用及致病機制奠定基礎。

PCV-2感染所導致的PCVD為慢性、消耗性疾病，發(fā)病率和死亡率一般為10%～20%[21]。EMCV感染斷奶豬時多呈亞臨床感染，死亡率極低，易感性也隨日齡增長進一步降低。本試驗中，2種病毒單獨感染后，均表現(xiàn)出各自的典型臨床特征，危害均不嚴重，與現(xiàn)有研究結論相一致，而繼發(fā)感染5 d時死亡率已上升至50%，其余試驗豬也瀕于死亡，平均日增重也顯著低于2個單獨感染組和正常對照組，體重負增長率最高(60%)，病理學檢查可發(fā)現(xiàn)心肌和腦組織變性、壞死更為嚴重。由此推斷，PCV-2的先期感染可致使機體防御系統(tǒng)嚴重損害，抵抗力下降，為EMCV的感染創(chuàng)造了機會。而EMCV感染后又進一步降低了PCV-2感染豬的抵抗力，加快了PCV-2的致病進程。因此，兩種病毒對機體的損傷起協(xié)同作用，從而表現(xiàn)出更為嚴重的致病性和致死性。

血液中淋巴細胞比率和中和抗體動態(tài)變化均能反映出機體免疫的狀態(tài)。正常生理情況下，淋巴細胞比率一般為20%～40%，比率上升通常提示發(fā)生病毒性感染。本試驗中，EMCV攻毒1 d時的淋巴細胞比率快速上升，至7 d達到峰值，而攻毒PCV-2 1 d時上升較慢，隨后呈逐步上升趨勢，提示大劑量的EMCV感染為急性疾病，PCV-2感染為慢性、消耗性疾病。繼發(fā)感染組的淋巴細胞比率始終較低，且明顯低于2個單獨攻毒組，這主要是由于PCV-2感染所造成的嚴重免疫抑制和免疫缺陷致使外周血液中的B淋巴細胞明顯減少。由于中和抗體是由B淋巴細胞產生，因此也使得繼發(fā)感染組的EMCV中和抗體較長時間維持在低水平。

現(xiàn)有研究證實EMCV在糞便中帶毒時間最長為9 d，明顯長于病毒血癥期[22]。本試驗中EMCV攻毒組最遲于攻毒后第9天可檢測、分離到病毒，與現(xiàn)有研究結論相一致。聯(lián)合感染組最遲于攻毒EMCV后第12天仍可檢測、分離到EMCV，排毒時間有所延長，提示先期感染PCV-2后，EMCV在豬體內的復制、排毒能力可能得以加強，但由于本試驗并未測定PCV-2感染后的排毒情況，這一結論有待今后進一步驗證和研究。本試驗結論提示，諸如EMCV等某些具有潛在威脅的人獸共患病病原在免疫抑制條件下的生物學特性、致病力和免疫特性等均可能發(fā)生較大改變，應引起醫(yī)學界和獸醫(yī)學界的高度關注。

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`(編輯白永平)

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.07.017

收稿日期：2015-07-25

基金項目：河南省高?？萍紕?chuàng)新團隊支持計劃(14IRTSTHN015)；國家自然科學基金(31272567)

作者簡介：常洪濤(1978-)，男，河南虞城人，副教授，博士，主要從事動物傳染病免疫防治研究，E-mail：ndcht@163.com。常洪濤和劉慧敏并列第一作者 *通信作者：王川慶，博士，教授，E-mail：wchuanq@163.com

中圖分類號：S858.285.3

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)07-1435-08

Analysis of Pathogenicity in Piglets Concurrent Infection with Encepholomyocarditis Virus under Immunosuppression Caused by Porcine Circovirus Type 2

CHANG Hong-tao1#，LIU Hui-min2#，LI Yong-tao1，HE Xiu-yuan1，ZHAO Jun1，CHEN Lu1，WANG Xin-wei1，YANG Xia1，WANG Chuan-qing1*

(1.CollegeofAnimalHusbandryandVeterinary，HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou450002，China；2.CollegeofLifeScience，HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou450002，China)

Abstract:The objective of our research was to evaluate the growth performance and pathogenicity of piglets concurrent infection with porcine encepholomyocarditis virus (EMCV) under immunosuppression condition caused by porcine circovirus type 2 (PCV-2).Sixteen piglets were chosen for three challenge groups including EMCV，PCV-2 and concurrent infection with PCV-2 and EMCV，and control group.The effect of concurrent infection on piglets was conducted by the relevant indexes including clinical symptoms，pathological examinations，growth performances，immune index，detoxification and so on.The results indicated that the groups infection only with EMCV or PCV-2 showed their own classical clinical characteristic and minimal injury.However，the mortality rate of concurrent infection increased rapidly，the average daily weight gain decreased significantly，degeneration and necrosis in myocardium and brain tissues was more severe，the lymphocyte ratio in the blood still remained low and the neutraliz-ation antibody of EMCV maintained at a low level in a long time.The piglets shed virus lasted 12 days after infection，longer than the group infected only with EMCV for 9 days.The results showed that PCV-2 early infection can promote more severe pathogenicity and lethality，and lower immunity in piglets induced by EMCV，and the ability of virus replication and detoxification in piglets enhanced.

Key words:PCV-2；EMCV；concurrent infection；piglets；pathogenicity