曾慶寶，范瑞文，張秋月，郝曉娟，武良琦，任玉紅

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，太谷 030801)

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miR-324-3p通過(guò)調(diào)控MC1R基因影響黑色素的形成

曾慶寶，范瑞文，張秋月，郝曉娟，武良琦，任玉紅*

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，太谷 030801)

摘要：旨在證明miR-324-3p可以通過(guò)調(diào)控其預(yù)測(cè)的靶基因MC1R及其下游基因的表達(dá)從而對(duì)羊駝皮膚黑色素的合成產(chǎn)生影響。本研究在體外培養(yǎng)的羊駝皮膚黑色素細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-324-3p過(guò)表達(dá)載體，應(yīng)用qRT-PCR與Western blotting分析比較各試驗(yàn)組中MC1R基因與毛色相關(guān)基因小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Microphthalmia-associtated transcription factor，Mitf)、酪氨酸酶(Tyrosinase，Tyr)、酪氨酸相關(guān)蛋白2(Tyrosinase related protein 2，Tyrp2)的表達(dá)差異性，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)黑色素產(chǎn)量的變化。結(jié)果顯示：(1)miR-324-3p在棕色與白色羊駝皮膚中均有表達(dá)，且在棕色羊駝皮膚中極顯著表達(dá)(P<0.01)，其相對(duì)表達(dá)量是白色的1.64倍；(2)黑色素細(xì)胞被轉(zhuǎn)染了miR-324-3p過(guò)表達(dá)載體后，處理組靶基因MC1R及其下游調(diào)控基因Mitf、Tyr和Tyrp2的表達(dá)量與黑色素產(chǎn)量較空白對(duì)照組均有下調(diào)，且以Mitf基因表達(dá)量極顯著下調(diào)(P<0.01)。綜上表明，羊駝皮膚中miR-324-3p可能通過(guò)調(diào)控MC1R基因的表達(dá)，順勢(shì)下調(diào)MC1R基因下游調(diào)控基因Mitf、Tyr與Tyrp2的表達(dá)，最終對(duì)羊駝皮膚黑色素細(xì)胞中黑色素的類型及合成量產(chǎn)生影響。

關(guān)鍵詞：miR-324-3p；MC1R；黑色素；羊駝

動(dòng)物擁有豐富多彩的毛色，決定動(dòng)物毛色的物質(zhì)基礎(chǔ)主要是酪氨酸源性黑色素，在動(dòng)物界黑色素有兩種類型，一種是真黑素，另一種是偽黑素，正是這些色素分布與合成數(shù)量的不同造就了動(dòng)物不同的毛色[1]。黑色素的生物合成主要受到基因(主控基因及調(diào)控基因)與環(huán)境因素的影響，已有研究報(bào)道，黑素皮質(zhì)激素受體1(Melanocortin-1 receptors，MC1R)基因被視為影響動(dòng)物黑色素細(xì)胞合成的主控基因之一，其表達(dá)于成熟黑色素細(xì)胞膜表面，作為G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)家族的一員，有7個(gè)跨膜功能域，當(dāng)與其天然配體激動(dòng)劑α-黑素細(xì)胞刺激素(α-melanocytes stimulating hormone，α-MSH)相結(jié)合后，順式上調(diào)黑色素合成的關(guān)鍵酶—酪氨酸酶基因家族(Tyr、Tyrp1、Tyrp2)基因的表達(dá)，進(jìn)而增加黑色素細(xì)胞內(nèi)真黑素的相對(duì)含量[2]，而Agouti蛋白可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合MC1R，導(dǎo)致MC1R受體通路傳遞信號(hào)減弱，促使黑色素細(xì)胞相對(duì)大量合成偽黑素。MC1R基因的變異與動(dòng)物的膚色、鳥(niǎo)類羽毛、及人類毛發(fā)顏色差異密切相關(guān)，而且不同物種參與調(diào)控黑色素細(xì)胞合成的主效基因作用機(jī)制又各有差異；羊駝具有22種天然毛色，可調(diào)控黑色素合成的影響因子復(fù)雜多樣，而且對(duì)于MC1R是否直接參與羊駝毛色形成過(guò)程及黑色素合成的調(diào)控機(jī)制少有報(bào)道。

MicroRNA(miRNA)是一類長(zhǎng)約20～24 nt的非編碼調(diào)控單鏈小分子RNA，它們主要與靶基因轉(zhuǎn)錄成熟的mRNA分子的3′端非編碼區(qū)域(3′-untranslated region，3′UTR)不完全互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，進(jìn)而抑制或終止翻譯過(guò)程，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在動(dòng)植物細(xì)胞增殖、分化、凋亡、應(yīng)激與信息傳遞等方面發(fā)揮著重要作用，與癌癥等人類疾病的發(fā)生、發(fā)展及生物進(jìn)化密切相關(guān)[4]。近年來(lái)的研究證實(shí)，miRNA參與調(diào)控動(dòng)物毛色性狀及皮膚毛囊更新生長(zhǎng)，朱芷葳等[5]利用miRNA芯片雜交技術(shù)分析了羊駝皮膚毛囊中miRNA的表達(dá)譜，結(jié)果顯示有20個(gè)miRNAs信號(hào)在羊駝皮膚中高表達(dá)；X.Tian等[6]借助測(cè)序技術(shù)構(gòu)建白色與棕色羊駝皮膚中miRNAs的表達(dá)文庫(kù)，同時(shí)預(yù)測(cè)了不同miRNA可能的靶基因——參與黑色素生成與色素沉著。本研究擬通過(guò)Targetscan、miRBase在線軟件，預(yù)測(cè)篩選出miR-324-3p可能靶向調(diào)控MC1R基因。有研究表明，miR-324-3p在腎漸進(jìn)性纖維化、細(xì)胞凋亡中起調(diào)控作用[7]；在鼻咽癌診療中，miR-324-3p可直接靶向調(diào)控WNT2B與SMAD7基因的表達(dá)，其表達(dá)量的變化可作為預(yù)測(cè)組織對(duì)輻射抗性及癌細(xì)胞增殖或凋亡情況[8-9]；但有關(guān)miR-324-3p對(duì)羊駝黑色素的細(xì)胞合成影響的研究較少。本試驗(yàn)預(yù)通過(guò)體外轉(zhuǎn)染miR-324-3p過(guò)表達(dá)載體與NC載體于羊駝皮膚黑色素細(xì)胞，以期miR-324-3p下調(diào)MC1R基因的表達(dá)，通過(guò)檢測(cè)MC1R基因下游調(diào)控基因(Mitf、Tyr、Tyrp2)表達(dá)量及細(xì)胞內(nèi)黑色素產(chǎn)量為反饋，揭示MC1R在羊駝毛色形成機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)所用主要試劑及儀器

第4代羊駝皮膚黑色素細(xì)胞(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)羊駝生物工程實(shí)驗(yàn)室)；黑色素細(xì)胞培養(yǎng)基MelM(Sciencell Research Laboratories)；PCR儀(Bio-RAD)；miR-324-3p過(guò)表達(dá)載體與NC載體(上海生工)；PrimeScriptTMRT reagent Kit、熒光定量試劑盒(TaKaRa)；Step One Plus Real-Time PCR System(Thermo Fisher)；核酸蛋白測(cè)定儀ND-1000(Nanodrop)；Mitf兔抗多克隆抗體(武漢三鷹)；MC1R、Tyr與Tyrp2兔抗多克隆抗體(Abcam)；β-actin兔抗多克隆抗體、二抗山羊抗兔IgG/HRP(博奧森)。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)應(yīng)用在線Primer3.0軟件設(shè)計(jì)羊駝miR-324-3p、MC1R、Mitf、Tyr、Tyrp2目的基因和U6、18SrRNA內(nèi)參基因引物，并利用NCBI中的BLAST功能檢測(cè)各對(duì)引物的特異性，引物均由華大基因公司合成，引物信息見(jiàn)表1。

1.2.2羊駝皮膚黑色素細(xì)胞的傳代培養(yǎng)及載體轉(zhuǎn)染取凍存的羊駝皮膚黑色素細(xì)胞，于37 ℃無(wú)菌水浴鍋中速融，DMEM稀釋，4 ℃、1 000 r·min-1、離心10 min，沉淀用黑色素細(xì)胞全培養(yǎng)基重懸，以2×105細(xì)胞密度接種于6孔培養(yǎng)板中，37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；24 h后換液；待細(xì)胞融合度為90%時(shí)，用0.25%胰酶消化液消化8 min后，終止液終止消化，吹打并收集細(xì)胞液，離心后，重懸細(xì)胞沉淀，接種于培養(yǎng)板中，于培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)[10]。

取培養(yǎng)中的第5代羊駝皮膚黑色素細(xì)胞進(jìn)行載體轉(zhuǎn)染。試驗(yàn)分為處理組(miR組，只轉(zhuǎn)染miR-324-3p過(guò)表達(dá)載體)，陰性對(duì)照組(NC組，只轉(zhuǎn)染NC載體)及空白細(xì)胞組(KB組，不做載體轉(zhuǎn)染)；每組設(shè)12個(gè)重復(fù)孔，其中4孔用于提取黑色素，4孔用于提取總RNA，另外4孔用于提取總蛋白；每孔的載體轉(zhuǎn)染量為5 μg，轉(zhuǎn)染試劑量為10 μL。轉(zhuǎn)染12 h后終止轉(zhuǎn)染，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光，鑒定載體轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄cDNA合成收集已轉(zhuǎn)染載體40 h的羊駝皮膚黑色素細(xì)胞，使用Trizol法提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA質(zhì)量。20 μL反轉(zhuǎn)錄體系：5×Prime Script Buffer 4 μL、Prime Script RT Enzyme Mix I 1 μL、莖環(huán)RT引物(10 μmol·L-1)與U6-R(10 μmol·L-1)或 Oligo dT Primer(50 μmol·L-1)與Random 6 mers(100 μmol·L-1)(引物序列見(jiàn)表1)各1 μL、Total RNA 1 μL、RNase Free Water 12 μL，反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s、4 ℃ 保存，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可直接用于普通PCR或?qū)崟r(shí)熒光定量PCR。

表1　目的基因與內(nèi)參基因引物信息

1.2.4內(nèi)源性miR-324-3p的PCR擴(kuò)增10 μL的PCR反應(yīng)體系：2×Es Taq Master Mix 5 μL、特異性引物與通用引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL、模板1 μL、RNase Free Water 3.2 μL，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，12 ℃保存。同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照孔，已檢測(cè)是否有污染存在。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR10 μL的反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ5 μL，模板1 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各0.2 μL，ROX Reference Dye 0.2 μL，RNase Free Water 3.4 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s，退火溫度Tm(表1)30 s，72 ℃延伸15 s，40個(gè)循環(huán)。目的基因MC1R、Mitf、Tyr、Tyrp2與內(nèi)參(18SrRNA)及miRNA-324與內(nèi)參U6在同一條件不同管內(nèi)擴(kuò)增，做4個(gè)重復(fù)，并且設(shè)立以水代替模板的陰性對(duì)照，各個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量用2-△△Ct法表示。

1.2.6總蛋白的提取與Western blotting檢測(cè)收集轉(zhuǎn)染載體56 h的羊駝皮膚黑色素細(xì)胞，用RIPA∶PMSF(100∶1)裂解細(xì)胞并收集總蛋白；以每孔400 ng的總蛋白上樣量進(jìn)行SDS-PAGE；轉(zhuǎn)移至NC膜上；用5%的蛋白干粉室溫下封閉1 h；將膜置于目的基因兔抗多克隆抗體稀釋液中，垂直搖床上4 ℃過(guò)夜孵育；室溫下復(fù)溫30 min；TBST液洗膜；將膜置于山羊抗兔單克隆抗體(HRP)稀釋液中，37 ℃孵育1 h后，洗膜；涂布發(fā)光液，照相觀察；用Quantity One軟件分析各免疫印跡條帶相對(duì)定量。

1.2.7堿性可溶總黑色素ASM含量的測(cè)定采用文獻(xiàn)[11-12]的方法測(cè)定ASM含量。取轉(zhuǎn)染載體48 h的羊駝皮膚黑色素細(xì)胞，用PBS清洗后，收集各試驗(yàn)組細(xì)胞至15 mL離心管中，取一小部分進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)；然后以4 ℃、1 000 r·min-1離心10 min，棄上清，PBS重懸細(xì)胞，再離心；棄去PBS上清后，最后每管加入1 mL 0.2 mol·L-1的NaOH裂解細(xì)胞，裂解液于80 ℃加熱5 min。使用酶標(biāo)儀在475 nm波長(zhǎng)處對(duì)每組黑色素樣品進(jìn)行吸光值的測(cè)量，每組重復(fù)5孔，同時(shí)設(shè)立NaOH空白對(duì)照孔，ASM含量用5個(gè)重復(fù)的處理組A475 nm值與空白對(duì)照組A475 nm值的比值表示。

1.2.8統(tǒng)計(jì)分析各試驗(yàn)數(shù)據(jù)及柱狀圖用Microsoft Excel作統(tǒng)計(jì)分析處理，試驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Means±SD)”表示，應(yīng)用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1pPG/miR/eGFP/Blasticidin-miR-324-3p過(guò)表達(dá)載體

由上海生工構(gòu)建的pPG/miR/eGFP/Blasticidin-miR-324-3p過(guò)表達(dá)載體用1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果見(jiàn)圖1；載體圖譜見(jiàn)圖2，其中CMV是載體表達(dá)目的基因強(qiáng)啟動(dòng)子，eGFP是鑒定載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞效率的標(biāo)記基因，Blasticidin可用來(lái)篩選穩(wěn)定表達(dá)miR-324-3p的細(xì)胞系。

M．DNA marker Ⅵ；1～4．miR-324-3p過(guò)表達(dá)載體M．DNA marker Ⅵ；1-4．miR-324-3p over-expressive vectors圖1　pPG/miR/eGFP/Blasticidin-miR-324-3p載體瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)Fig.1　Agarose gel electrophoresis of pPG/miR/eGFP/Blasticidin-miR-324-3p vector

圖2　pPG/miR/eGFP/Blasticidin-miR-324-3p載體圖譜Fig.2　Vector map of pPG/miR/eGFP/Blasticidin-miR-324-3p

2.2總RNA的鑒定

所提取的總RNA用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，可清楚看到28S、18S條帶，說(shuō)明RNA未降解，5S條帶不太清楚(圖3)。用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定總RNA濃度，RNA樣品的A260 nm/A280 nm值均處于1.8～2.1、A260 nm/A230 nm>2.0，說(shuō)明提取RNA過(guò)程中沒(méi)有蛋白污染，可以用于后續(xù)試驗(yàn)。

1～2.白色羊駝黑色素細(xì)胞總RNA；3～4.棕色羊駝黑色素細(xì)胞總RNA1-2.Melanocytes total RNA of White alpaca；3-4.Melanocytes total RNA of Brown alpaca圖3　羊駝黑色素細(xì)胞總RNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.3　Agarose gel electrophoresis of melanocytes total RNA on alpaca

2.3PCR擴(kuò)增

白色與棕色羊駝皮膚黑色素細(xì)胞中表達(dá)的miR-324-3p經(jīng)反轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增及2.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)鑒定，得到65 bp片段的DNA產(chǎn)物，與理論片段大小一致，電泳條帶清晰，擴(kuò)增結(jié)果良好(圖4)。

M.低分子量DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～4.白色羊駝miR-324-3p的PCR產(chǎn)物；5～8.棕色羊駝miR-324-3p的PCR產(chǎn)物M．Low MW DNA marker；1-4．PCR products of miR-324-3p for White alpaca；5-8．PCR products of miR-324-3p for Brown alpaca圖4　白色與棕色羊駝黑色素細(xì)胞中miR-324-3p的PCR產(chǎn)物Fig.4　PCR amplification products of miR-324-3p in melanocytes from White and Brown alpaca

2.4miR-324-3p在白色與棕色羊駝皮膚黑色素細(xì)胞中的表達(dá)差異性

以U6為內(nèi)參基因，分別以白色與棕色羊駝皮膚黑色素細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，應(yīng)用qRT-PCR分析miR-324-3p在白色與棕色羊駝黑色素細(xì)胞中表達(dá)差異性。結(jié)果見(jiàn)表2，miR-324-3p在棕色羊駝黑色素細(xì)胞中的表達(dá)量極顯著高于白色的表達(dá)量，在棕色羊駝黑色素細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量是白色羊駝的1.64倍。

表2　miR-324-3p在白色與棕色羊駝黑色素細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量

a.差異極顯著；b.差異顯著。表3同

a.P<0.01；b.P<0.05.The same as table 3

2.5過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染羊駝黑色素細(xì)胞后，各試驗(yàn)組中miR-324-3p在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量

各試驗(yàn)組miR-324-3p在轉(zhuǎn)錄水平的相對(duì)表達(dá)量，qRT-PCR結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，miR組miR-324-3p在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量是KB組的1.891倍，是NC組的2.260倍，miR組miR-324-3p在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量極顯著的高于KB組(P<0.01)。

表3　各試驗(yàn)組轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)載體后miR-324-3p的相對(duì)表達(dá)量

miR.轉(zhuǎn)染miR-324-3p過(guò)表達(dá)載體細(xì)胞組；NC.轉(zhuǎn)染了miR-NC空載體細(xì)胞組；KB.未作轉(zhuǎn)染的空白細(xì)胞組；圖5～7同

miR.Cell group transfected over-expression vector of miR-324-3p；NC.Cell group transfected empty vector of miR-NC；KB.Cell group non-transfected；The same as Fig.5-7

2.6過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染羊駝黑色素細(xì)胞后各基因在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的變化

qRT-PCR結(jié)果，處理組MC1R、Mitf、Tyr及Tyrp2基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)見(jiàn)圖5。結(jié)果顯示，miR組MC1R、Mitf、Tyr及Tyrp2基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)量較KB組分別下降了0.981、0.679、0.820、0.653，miR組MC1R、Mitf、Tyr及Tyrp2基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)量較NC組分別下降了0.802、0.527、0.450、0.080，miR組中MC1R、Mitf、Tyr和Tyrp2較KB組均差異極顯著(P<0.01)，Tyrp2的miR組較NC組差異顯著(P<0.05)，MC1R、Mitf、Tyr的miR組較NC組均差異極顯著(P<0.01)。

不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著；不同小寫(xiě)字母表示差異顯著。圖6、圖7同Different uppercase letters．P<0.01；Different lowercase letters．P<0.05.The same as Fig.6 and Fig.7圖5　載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后羊駝毛色相關(guān)基因的表達(dá)差異性Fig.5　The expressive difference of coat color related genes from cell groups transfected vectors

2.7miR-324-3p對(duì)MC1RMitf、Tyr及Tyrp2基因蛋白表達(dá)量的影響

Western印跡結(jié)果顯示，羊駝黑色素細(xì)胞總蛋白中存在可與兔抗MC1R、Mitf、Tyr及Tyrp2多克隆抗體發(fā)生免疫陽(yáng)性反應(yīng)的蛋白條帶(圖6A)。對(duì)于試驗(yàn)組中各個(gè)目的基因蛋白表達(dá)量進(jìn)行定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-324-3p過(guò)表達(dá)載體于羊駝皮膚黑色素細(xì)胞后，靶基因MC1R及其下游調(diào)控的Mitf、Tyr及Tyrp2基因的蛋白表達(dá)量均下調(diào)，且Mitf基因蛋白表達(dá)量下調(diào)最為顯著，各處理組同對(duì)照組相比差異顯著或極顯著(圖6B)。

2.8miR-324-3p對(duì)羊駝皮膚黑色素細(xì)胞內(nèi)黑色素產(chǎn)量的影響

用酶標(biāo)儀測(cè)定miR組、NC組和KB組中黑色素細(xì)胞內(nèi)黑色素產(chǎn)量的A475 nm吸光值，用各處理組的黑色素產(chǎn)量占空白組的比值表示黑色素相對(duì)量。結(jié)果顯示，miR組與NC組的黑色素細(xì)胞內(nèi)黑色素產(chǎn)量均減少，以miR組的黑色素產(chǎn)量下降最顯著(圖7)。

A.蛋白免疫印跡圖；B.各蛋白在不同組中的表達(dá)差異性A.Western blotting；B.Expressive difference of proteins in each exprimental groups圖6　miR-324-3p對(duì)羊駝毛色相關(guān)基因蛋白表達(dá)的影響Fig.6　The effect of protein expression on coat color relative genes by miR-324-3p

圖7　轉(zhuǎn)染載體后各組黑色素細(xì)胞內(nèi)黑色素產(chǎn)量Fig.7　The melanin production of melanocyte groups transfected vectors

3討論

小RNA分子是非編碼的RNA分子(Noncoding RNA，ncRNA)，主要包括小干擾RNA(Short interfering RNA，siRNA)和微小RNA(microRNA、miRNA)兩類，同一個(gè)siRNA或miRNA可以作用于多種mRNA，多個(gè)siRNA或miRNA也可以同時(shí)作用于同一個(gè)mRNA，最終通過(guò)調(diào)控靶基因參與到真核細(xì)胞的多種行為中，因此靶基因的生物學(xué)功能驗(yàn)證常常成為研究miRNA功能的手段之一。miRNA通過(guò)以不完全互補(bǔ)方式同靶基因mRNA的3′UTR相識(shí)別結(jié)合，進(jìn)而抑制該基因的表達(dá)翻譯過(guò)程[13-14]。本試驗(yàn)通過(guò)向體外培養(yǎng)的羊駝皮膚黑色素細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-324-3p過(guò)表達(dá)載體，檢測(cè)到miR組的miR-324-3p表達(dá)量極顯著的高于NC組與KB組，而NC組的表達(dá)量略低于KB組，造成這種結(jié)果的可能原因是具有一定毒性作用的轉(zhuǎn)染試劑引起部分細(xì)胞死亡或脫落，致使miR組與NC組的總RNA量下降，進(jìn)而呈現(xiàn)出NC組miR-324-3p的表達(dá)量略低于KB組；研究還發(fā)現(xiàn)miR-324-3p在棕色羊駝黑色素細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于白色羊駝，揭示miR-324-3p可能通過(guò)靶向MC1R基因參與了羊駝黑色素細(xì)胞合成的調(diào)控。

應(yīng)用DNAMan軟件分析比對(duì)了人、鼠及羊駝等多種哺乳動(dòng)物MC1R-3′UTR區(qū)，發(fā)現(xiàn)羊駝MC1R-3′UTR與其他動(dòng)物的有著89%的同源性，預(yù)示著不同物種的MC1R-3′UTR區(qū)可能具有相同或相近的功能。已有研究表明棕色羊駝皮膚中MC1R的相對(duì)表達(dá)量是白色羊駝相對(duì)表達(dá)量的4.32倍[15-16]，說(shuō)明不同毛色羊駝皮膚中表達(dá)的MC1R與黑色素的細(xì)胞合成間存在一定的相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示，靶基因MC1R在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量下調(diào)不是極顯著，原因可能是與提取總RNA時(shí)機(jī)有關(guān)，但在蛋白水平的表達(dá)量下調(diào)極顯著。對(duì)于空白組或者羊駝皮膚組織中的黑色素細(xì)胞膜表面的MC1R當(dāng)與其天然配體特異性結(jié)合后，一方面引起胞漿內(nèi)Ca2+濃度增加，激活蛋白激酶C(PKC)，另一方面使胞漿內(nèi)cAMP水平升高，后者活化cAMP依賴性激酶PKA，PKC、PKA使胞漿內(nèi)的底物磷酸化或者在細(xì)胞核內(nèi)使核蛋白絲氨酸/酪氨酸磷酸化[17]；進(jìn)而使環(huán)磷酸腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白CREB(cAMP-responsive element-binding protein)磷酸化，磷酸化的CREB可激活小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Microphthalmia-associated transcription factor，Mitf)基因的表達(dá)[18]；Mitf可與酪氨酸酶家族基因啟動(dòng)子中的M-box結(jié)構(gòu)“CATGTG”序列識(shí)別結(jié)合，從而促進(jìn)酪氨酸酶基因家族的表達(dá)[19-20]；酪氨酸酶是黑色素合成過(guò)程中的限速酶，當(dāng)Tyr基因高表達(dá)時(shí)，將L-酪氨酸催化氧化聚合為多巴色素(DC)，DC經(jīng)Tyrp2羥化為5，6-二羥基吲哚羥酸(DHICA)，DHICA經(jīng)Tyrp1氧化形成5，6-吲哚醌，進(jìn)而最終形成真黑素[21]；當(dāng)Tyr基因表達(dá)下調(diào)時(shí)，積聚的L-多巴與谷胱甘肽(GSH)結(jié)合，經(jīng)多步反應(yīng)生成偽黑素[22]。當(dāng)MC1R基因表達(dá)被下調(diào)后順勢(shì)引起其下游調(diào)控基因表達(dá)量降低，這與本試驗(yàn)中Mitf、Tyr和Tyrp2基因在轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平表達(dá)下調(diào)結(jié)果相一致，而且Mitf基因表達(dá)極顯著下調(diào)；NC組中MC1R、Mitf、Tyr和Tyrp2基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量較KB組也有所下降，分析其原因可能是與轉(zhuǎn)染試劑的毒性作用相關(guān)，在提取RNA前，處于不同活力狀態(tài)的細(xì)胞尚未完全恢復(fù)，致使目的基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量都較低。MC1R、Mitf、Tyr和Tyrp2基因表達(dá)量的下降可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)黑色素合成量的減少，這與檢測(cè)到的羊駝皮膚黑色素細(xì)胞中黑色素合成量減少的結(jié)果相一致，這也證實(shí)了Tyr同Tyrp2基因表達(dá)的變化直接決定著黑色素產(chǎn)量的變化。綜上所述，MC1R通過(guò)G蛋白偶聯(lián)內(nèi)皮素受體通路調(diào)控著Mitf與酪氨酸酶基因家族基因的表達(dá)，然而MC1R是如何影響羊駝皮膚黑色素細(xì)胞內(nèi)黑色素的合成有待于進(jìn)一步的研究。

4結(jié)論

本研究間接驗(yàn)證了羊駝MC1R基因是miR-324-3p的直接靶基因，miR-324-3p通過(guò)從mRNA水平上靶向抑制MC1R基因的表達(dá)進(jìn)而下調(diào)靶基因下游調(diào)控基因的表達(dá)，最終影響羊駝皮膚黑色素細(xì)胞中黑色素的形成。

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(編輯程金華)

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.07.010

收稿日期：2015-12-30

基金項(xiàng)目：山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(20140311019-3)；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)博士科研啟動(dòng)項(xiàng)目(XB2009022)

作者簡(jiǎn)介：曾慶寶(1985-)，男，甘肅白銀人，碩士生，主要從事基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)研究，E-mail：gsjybwzqingbao@163.com *通信作者：任玉紅，教授，E-mail：renyuhong1963@163.com

中圖分類號(hào)：S852.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)07-1381-08

The Effect of miR-324-3p on Melanin Synthesis viaMC1R Gene

ZENG Qing-bao，F(xiàn)AN Rui-wen，ZHANG Qiu-yue，HAO Xiao-juan，WU Liang-qi，REN Yu-hong*

(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China)

Abstract:To investigate the effect of miR-324-3p on regulating melanin production by targeting MC1R，miR-324-3p was over-expressed by liposome transfection method in alpaca melanocytes in vitro.The expression of MC1R and hair color genes (Mitf，Tyr and Tyrp2) were detected by quantitative real time PCR and Western blotting and the melanin prodution was analyzed by Microplate Reader.The results showed that miR-324-3p was expressed extremely significant difference in the alpaca skins with 1.64 folds in brown alpaca skins vs white alpaca skins(P<0.01)，the gene expression of MC1R，Mitf，Tyr and Tyrp2 were down-regulated and the melanin production was reduced(especially Mitf (P<0.01)).The results suggested that miR-324-3p regulated melanogenesis by targeting MC1R gene to down-regulate the expression of the downstream genes including Mitf，Tyr and Tyrp2 in the skin of alpaca.

Key words:miR-324-3p；MC1R；melanin；alpaca