軒俊麗，馬曉萌，王慧華，3，曹家雪，魏彩虹，趙福平，馬友記，張　莉*，杜立新*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

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綿羊季節(jié)性繁殖相關(guān)基因TSHR外顯子多態(tài)性研究

軒俊麗1，2，馬曉萌2，王慧華2，3，曹家雪2，魏彩虹2，趙福平2，馬友記1*，張莉2*，杜立新1，2*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

摘要：旨在研究烏珠穆沁羊與湖羊這兩種具有不同繁殖性能和發(fā)情周期綿羊的促甲狀腺激素受體(Thyroid stimulating hormone receptor，TSHR)基因外顯子區(qū)遺傳變異特性及其構(gòu)建的單倍型在品種間的分布和對(duì)mRNA和蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，為進(jìn)一步揭示其對(duì)TSHR表達(dá)調(diào)控的影響及表型效應(yīng)奠定基礎(chǔ)。本研究采用直接測(cè)序的方法對(duì)中國(guó)蒙古系2個(gè)綿羊品種共172個(gè)個(gè)體TSHR基因的遺傳變異情況進(jìn)行分析。共發(fā)現(xiàn)了6個(gè)突變位點(diǎn)，獨(dú)立性卡方檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SNP1、SNP3、SNP4和SNP5 4個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的基因型在兩個(gè)綿羊群體間的分布存在極顯著差異(P<0.01)，其中SNP5為錯(cuò)義突變，其余為同義突變；對(duì)這4個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)，SNP3和SNP4兩個(gè)位點(diǎn)完全連鎖，其余位點(diǎn)兩兩之間存在不同程度連鎖關(guān)系；生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)不同的單倍型使TSHR基因的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，SNP5使受體蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。結(jié)果提示：(1)TSHR基因外顯子區(qū)存在4個(gè)在兩個(gè)綿羊品種中具有潛在生物學(xué)功能和表型效應(yīng)的突變位點(diǎn)，可組成H1～H6共6種單倍型，其中H1(CGCC)和H4(TTTG)分別在烏珠穆沁羊和湖羊群體中為優(yōu)勢(shì)單倍型，這可能與這兩種綿羊不同的發(fā)情周期有關(guān)。(2)外顯子區(qū)SNP5位點(diǎn)突變影響mRNA和蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，可能是具有潛在表型效應(yīng)的重要功能位點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：綿羊；季節(jié)性繁殖；TSHR基因；多態(tài)性

季節(jié)性繁殖活動(dòng)是哺乳動(dòng)物對(duì)各種環(huán)境因素變化的一種適應(yīng)性保護(hù)行為，其中，光周期變化是影響這一活動(dòng)的主要環(huán)境因素。其機(jī)理：褪黑激素(Melatonin，MEL)通過(guò)下丘腦—垂體—性腺軸(Hypothalamic-pituitary-gonadal axis，HPGA)系統(tǒng)來(lái)調(diào)節(jié)促性腺激素釋放激素(Gonadotropin releasing hormone，GnRH)、促性腺激素、黃體生成素以及孕激素等的合成與釋放，進(jìn)而影響哺乳動(dòng)物的季節(jié)性繁殖活動(dòng)[1-2]。近些年的研究表明，TSHR基因也能影響動(dòng)物的季節(jié)性繁殖活動(dòng)。

TSHR屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族，主要分布于甲狀腺，能夠通過(guò)特異性結(jié)合甲狀腺激素來(lái)提高甲狀腺攝入碘的能力，促進(jìn)甲狀腺的生長(zhǎng)發(fā)育及甲狀腺激素的合成分泌。TSHR不僅僅在甲狀腺中表達(dá)，它也可表達(dá)于綿羊的腦部(如下丘腦、松果體和垂體等)、卵巢和血液中[3]。趙賡等[4]研究發(fā)現(xiàn)，綿羊卵巢和下丘腦中的TSHR基因序列具有很高的相似性，并推測(cè)TSHR可以通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌過(guò)程來(lái)影響綿羊的季節(jié)性繁殖活動(dòng)。E.A.Hanon等[5]在Soay綿羊中研究發(fā)現(xiàn)光照長(zhǎng)短能夠影響TSH及其受體TSHR的表達(dá)，TSHR能夠受到光周期的影響調(diào)節(jié)綿羊的季節(jié)性繁殖活動(dòng)。進(jìn)一步研究表明，TSHR在動(dòng)物腦部中的表達(dá)主要集中在第三腦室內(nèi)皮細(xì)胞(Endothelial cell，EC)和垂體結(jié)節(jié)部[6]。EC細(xì)胞能夠連通垂體門(mén)脈系統(tǒng)和第三腦室的腦脊液(Cerebrospinal fluid，CSF)，且能與下丘腦中的GnRH神經(jīng)元形成突觸連接，而CSF中存在大量MEL，其濃度隨光周期變化而變化[7]。由此可見(jiàn)，TSHR可能會(huì)受光周期的作用，影響GnRH和MEL的分泌，進(jìn)而影響動(dòng)物的季節(jié)性繁殖活動(dòng)。C.Viguie等[8]通過(guò)試驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)綿羊的甲狀腺被切除后會(huì)一直處于季節(jié)性繁殖狀態(tài)，直到在其腦室注射T4后，才對(duì)光周期信號(hào)重新產(chǎn)生反應(yīng)，進(jìn)入休情期。

綜上所述，TSHR對(duì)綿羊的季節(jié)性繁殖活動(dòng)具有重要作用，它可能通過(guò)PT(垂體)-TSH-TSHR-DIO2/DIO3(下丘腦)-TH-GnRH通路，使綿羊感知光照的季節(jié)性差異，從而影響松果體分泌MEL，進(jìn)而影響通路下游GnRH的分泌，并最終影響綿羊季節(jié)性的發(fā)情行為和繁殖活動(dòng)[9]。

綿羊是季節(jié)性多次發(fā)情的動(dòng)物。中國(guó)寒冷地區(qū)的綿羊品種，如烏珠穆沁羊及呼倫貝爾羊等綿羊的發(fā)情周期處于6月下旬到12月末或來(lái)年1月初，主要集中于9～11月份。而湖羊和小尾寒羊等溫暖地區(qū)的綿羊品種，發(fā)情不存在明顯的季節(jié)性，但也具有秋季較為旺盛的規(guī)律。因此，本試驗(yàn)以烏珠穆沁羊和湖羊?yàn)檠芯繉?duì)象，全面了解TSHR基因SNP多態(tài)性、單倍型組成及其在不同群體中的分布，明確各單倍型對(duì)mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)及其蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，將有助于篩選出具有潛在生物學(xué)功能的單倍型組合，為下一步篩選合適的相關(guān)表型進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

以兩個(gè)綿羊品種共172只個(gè)體為研究對(duì)象，其中烏珠穆沁綿羊(Ujumqin sheep)96只，湖羊(Hu sheep)76只，分別來(lái)自內(nèi)蒙古東烏珠穆沁旗的烏珠穆沁羊原種場(chǎng)和蘇州市湖羊種羊場(chǎng)。綿羊頸靜脈采血5 mL，肝素抗凝，-20 ℃保存。

1.2基因組DNA提取、檢測(cè)及DNA池構(gòu)建

利用動(dòng)物血液基因組DNA提取試劑盒(天根，北京)提取血樣基因組DNA，并用含核酸染料的1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其完整性、含量及純度。從兩個(gè)品種中各隨機(jī)抽取DNA樣20份，每個(gè)樣品各取1 μL，分別構(gòu)建兩個(gè)品種基因組DNA池。

1.3SNP檢測(cè)

1.3.1引物設(shè)計(jì)與合成通過(guò)NCBI網(wǎng)站的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得綿羊TSHR基因(NM_001009410.1)外顯子序列，利用Primer 3.0在線軟件設(shè)計(jì)12對(duì)覆蓋TSHR基因外顯子的PCR擴(kuò)增引物(表1)，交由天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司(北京)合成。

表1　引物序列和擴(kuò)增產(chǎn)物

1.3.2PCR擴(kuò)增與測(cè)序PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(25 μL)包括約20 ng·μL-1的基因組DNA 2 μL，10 pmol的上下游引物各1 μL，2×Taq PCR Master Mix(內(nèi)含TaqDNA聚合酶、Mg2+dNTPs等)(北京 天根)12.5 μL，滅菌雙蒸水8.5 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火溫度退火30 s(退火溫度見(jiàn)表1)，72 ℃延伸70 s，32個(gè)循環(huán)；72延伸10 min；4 ℃保存。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測(cè)后送北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司回收純化后進(jìn)行混池測(cè)序。

1.3.3飛行時(shí)間質(zhì)譜(TOF-MS)分析通過(guò)混池測(cè)序的方法，尋找峰圖清晰、有明顯雙峰的位點(diǎn)，確定其為SNP位點(diǎn)，并應(yīng)用TOF-MS方法對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因型分析。為了驗(yàn)證分型的準(zhǔn)確率，本試驗(yàn)采用直接測(cè)序的方法檢驗(yàn)了一部分樣品的分型結(jié)果。

1.4TSHR基因群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

利用PopGene1.32軟件對(duì)SNPs位點(diǎn)進(jìn)行等位基因頻率、基因型頻率、有效等位基因數(shù)及多態(tài)信息含量(Polymorphism information content，PIC)等群體遺傳特性進(jìn)行分析[10]；利用χ2適合性檢驗(yàn)進(jìn)行符合Hardy-Weinberg平衡的檢驗(yàn)；并利用獨(dú)立性卡方檢驗(yàn)分析等位基因在綿羊品種中的分布[11]。

1.5連鎖不平衡(LD)和單倍型分析

使用Haploview 4.2軟件對(duì)卡方獨(dú)立性檢驗(yàn)中差異顯著的位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡分析及單倍型的構(gòu)建。

1.6SNP對(duì)TSHR基因mRNA及蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

運(yùn)用在線軟件RNAfold web server(http：//rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi)進(jìn)行mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。運(yùn)用在線軟件(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page= npsa sopm.html)進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

2結(jié)果

2.1混池測(cè)序及SNP鑒定

利用動(dòng)物血液基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，將所提取的DNA用分光光度計(jì)和含核酸染料的1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明DNA質(zhì)量符合測(cè)序標(biāo)準(zhǔn)，可用于下一步試驗(yàn)。利用所設(shè)計(jì)的12對(duì)引物，以構(gòu)建的DNA池為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)檢驗(yàn)后送公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如圖1所示。

圖1　TSHR基因結(jié)構(gòu)示意圖及6個(gè)SNPs基因型測(cè)序Fig.1　TSHR gene structure and sequencing results of the 6 SNPs

在TSHR基因外顯子上共發(fā)現(xiàn)了6個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，分別命明為SNP1～SNP6，以TSHR基因外顯子第一位為+1，6個(gè)SNPs位點(diǎn)具體信息如表2所示。

表2　TSHR基因SNPs的信息

2.2飛行時(shí)間質(zhì)譜結(jié)果

將測(cè)序后挑選出的TSHR基因上的6個(gè)SNPs位點(diǎn)利用TOF-MS法進(jìn)行分型，分型結(jié)果如圖2所示，除SNP2和SNP6兩個(gè)多態(tài)位點(diǎn)只有2種基因型以外，其余4個(gè)多態(tài)位點(diǎn)均存在3種基因型。

2.3群體遺傳學(xué)分析

以上6個(gè)位點(diǎn)在兩個(gè)測(cè)試群體的基因型頻率、等位基因頻率、PIC等遺傳參數(shù)統(tǒng)計(jì)值見(jiàn)表3。由表3可知，SNP1在湖羊群體中只存在兩種基因型，在烏珠穆沁羊中存在3種基因型；SNP2在湖羊群體中只存在兩種基因型，而在烏珠穆沁羊群體中不存在多態(tài)性；SNP6位點(diǎn)在兩個(gè)綿羊群體中均只存在兩種基因型。SNP1、SNP3、SNP4和SNP5位點(diǎn)在兩個(gè)綿羊群體中的優(yōu)勢(shì)基因型不同。SNP1位點(diǎn)在烏珠穆沁羊群體中表現(xiàn)為中度多態(tài)(0.25

χ2適合性檢驗(yàn)表明各個(gè)位點(diǎn)在兩個(gè)群體中均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)。

圖2　飛行時(shí)間質(zhì)譜結(jié)果散點(diǎn)圖Fig.2　The result of time of TOF-MS

2.4群體間的遺傳差異分析

2.4.1兩個(gè)綿羊品種中6個(gè)SNPs位點(diǎn)的基因型分布差異及遺傳分化χ2獨(dú)立性檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，SNP1、SNP3、SNP4和SNP5 4個(gè)多態(tài)位點(diǎn)各基因型的分布在兩個(gè)綿羊品種間存在極顯著差異。在這4個(gè)多態(tài)位點(diǎn)中單個(gè)SNP位點(diǎn)在兩個(gè)品種間的Fst值為0.187 4(SNP5)～0.274 8(SNP1)，普遍大于SNP2和SNP6兩個(gè)位點(diǎn)，相應(yīng)的，這4個(gè)位點(diǎn)的基因流值也比其余兩個(gè)位點(diǎn)小。

2.4.2連鎖不平衡分析將在兩個(gè)綿羊品種中分布差異極顯著的4個(gè)位點(diǎn)(SNP1、SNP3、SNP4、SNP5)進(jìn)行連鎖不平衡分析，如圖3和表5所示，TSHR基因上SNP3和SNP4兩個(gè)多態(tài)位點(diǎn)在兩個(gè)綿羊品種中相互之間的連鎖不平衡系數(shù)D′和連鎖不平衡相關(guān)系數(shù)r2均為1，即兩個(gè)位點(diǎn)完全連鎖；SNP3與SNP5、SNP4與SNP5之間存在強(qiáng)連鎖不平衡(D′>0.75，r2>0.33)。其他幾個(gè)位點(diǎn)兩兩之間存在不同程度的連鎖關(guān)系。

表3　TSHR基因SNP位點(diǎn)基因型頻率、等位基因頻率及群體遺傳特性

表4　TSHR基因SNPs位點(diǎn)基因型在兩個(gè)品種分布差異的χ2獨(dú)立性檢驗(yàn)及Fst值

**.表示差異極顯著(P<0.01)

**.Means extremely significant difference at 0.01 level

圖3　TSHR基因4個(gè)位點(diǎn)連鎖不平衡分析圖Fig.3　Linkage disequilibrium analysis in TSHR gene

表5　TSHR基因多態(tài)位點(diǎn)配對(duì)連鎖不平衡分析

對(duì)角線的上方為D′；對(duì)角線的下方為r2

D′ are above the diagonal for SNPs andr2are below the diagonal

2.4.3單倍型分析及其在不同綿羊品種中的分布運(yùn)用Haploview軟件對(duì)TSHR基因上SNP1、SNP3、SNP4和SNP5 4個(gè)多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行單倍型構(gòu)建，在烏珠穆沁羊群體中構(gòu)建6種單倍型，其中優(yōu)勢(shì)單倍型為H1(CGCC)；而在湖羊群體中構(gòu)建5種單倍型，優(yōu)勢(shì)單倍型為H4(TTTG)。單倍型H6只存在于烏珠穆沁羊群體中(表6)。

2.5生物信息學(xué)分析

2.5.1mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)利用在線軟件RNAfold web server預(yù)測(cè)TSHR基因不同單倍型mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)如圖4所示，其最小自由能為-4 155.55 kJ·mol-1～-4 144.25 kJ·mol-1，其中H2的二級(jí)結(jié)構(gòu)自由能最大，H4的最小，因此結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性H4最高，H2最低。

2.5.2蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)利用SOPM二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)方法對(duì)不同基因型的TSHR蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖可知，SNP5位點(diǎn)為錯(cuò)義突變，突變后蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使TSHR基因編碼區(qū)第655位密碼子編碼的絲氨酸變?yōu)榫彼?，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中α螺旋、β折疊、延伸鏈和自由卷曲所占比例均發(fā)生變化(表7)。

表6　兩個(gè)綿羊品種TSHR基因6個(gè)SNPs位點(diǎn)單倍型頻率分析

表7　TSHR基因SNP5位點(diǎn)突變前后蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

圖4　TSHR基因不同單倍型的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.4　mRNA secondary structure of different haplotypes of TSHR gene

A.SNP5位點(diǎn)為C時(shí)的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)；B.SNP5位點(diǎn)為G時(shí)的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)：h、t、c和e分別代表α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈A.Protein secondary structure of C of SNP5；B.Protein secondary structure of G of SNP5；h，t，c and e means alpha helix，beta turn，random coil，extended strand，respectively圖5　TSHR基因SNP5位點(diǎn)突變前后蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.5　Protein secondary structure of SNP5 of TSHR gene before and after mutation

3討論

3.1烏珠穆沁羊和湖羊的發(fā)情特點(diǎn)

根據(jù)《中國(guó)畜禽遺傳資源志·羊志》[12]中記載，湖羊和烏珠穆沁羊均由蒙古羊進(jìn)化而來(lái)，但在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，它們的繁殖性能也因分布地區(qū)的地理環(huán)境和氣候的不同而有所差異。其中，烏珠穆沁羊?yàn)榧竟?jié)性發(fā)情，多集中在9～11月份發(fā)情，發(fā)情周期為15～19 d，發(fā)情持續(xù)時(shí)間為24～72 h，年平均產(chǎn)羔率為113%。而湖羊是常年發(fā)情，發(fā)情時(shí)間主要集中在4～6月份和9～11月份，發(fā)情周期長(zhǎng)達(dá)11 d，經(jīng)產(chǎn)母羊的年平均產(chǎn)羔率高達(dá)277.4%，兩年一般能產(chǎn)3胎。本試驗(yàn)對(duì)不同繁殖周期綿羊的TSHR基因多態(tài)性進(jìn)行研究，為調(diào)控綿羊的繁殖季節(jié)性、縮短綿羊的休情期，延長(zhǎng)其發(fā)情期，提高季節(jié)性發(fā)情綿羊的生產(chǎn)性能和繁殖力提供理論依據(jù)。

3.2TSHR基因的多態(tài)性

TSHR在調(diào)控繁殖相關(guān)激素合成與分泌的信號(hào)通路中，首先結(jié)合TSH，然后與Gs蛋白進(jìn)行偶聯(lián)，激活蛋白激酶A和cAMP系統(tǒng)，進(jìn)而作用于下丘腦，完成相關(guān)激素的合成與分泌。因此，此通路中涉及到的任何相關(guān)成分的變化都有可能影響動(dòng)物的季節(jié)性繁殖活動(dòng)。研究表明，TSHR基因某些位點(diǎn)發(fā)生突變，可使相應(yīng)的氨基酸發(fā)生改變進(jìn)而導(dǎo)致cAMP通路的持續(xù)激活。例如，人TSHR第77位的天冬酰胺被谷氨酸替代后，TSHR喪失與TSH的結(jié)合能力，第113位天冬酰胺被替代后，TSHR親和力下降約10倍[13]。同時(shí)，TSHR基因的突變可直接影響甲狀腺功能的改變[14-16]。A.C.Karlsson等[17]研究發(fā)現(xiàn)，TSHR基因的突變可能會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)甲狀腺激素的血漿水平來(lái)影響雞的孵化時(shí)間、憂慮行為及攻擊行為等一些重要的性狀，這在家禽的馴養(yǎng)過(guò)程中具有重要意義。

單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphisms，SNP)是一種普遍存在于動(dòng)植物中且密度大、能穩(wěn)定遺傳的分子標(biāo)記[18]。為了探究季節(jié)性和常年性發(fā)情綿羊之間TSHR基因的多態(tài)性差異，本試驗(yàn)將發(fā)現(xiàn)的6個(gè)多態(tài)位點(diǎn)分別命名為SNP1～SNP6，其中SNP2和SNP5屬于錯(cuò)義突變，其余位點(diǎn)屬于同義突變，且除SNP1位點(diǎn)位于第3外顯子外，其余位點(diǎn)均位于第10外顯子。本試驗(yàn)在湖羊群體中SNP1位點(diǎn)處未檢測(cè)到CC基因型，說(shuō)明其是烏珠穆沁羊特有的基因型；在烏珠穆沁羊群體中SNP2位點(diǎn)處未檢測(cè)到G等位基因，同時(shí)湖羊群體中G等位基因的概率也比較低，僅為0.67%，可能是由于樣本量不足或者是該等位基因在兩個(gè)品種中均很少存在，這有待擴(kuò)大樣本進(jìn)一步驗(yàn)證；兩個(gè)綿羊群體在SNP6位點(diǎn)處均沒(méi)有檢測(cè)到TT基因型，可能是由于樣本量不足或者存在純合基因型致死現(xiàn)象。Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)表明，6個(gè)多態(tài)位點(diǎn)在兩個(gè)羊群均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)，表明上述位點(diǎn)通過(guò)長(zhǎng)期的進(jìn)化和選擇，在適應(yīng)性方面可能具有遺傳優(yōu)勢(shì)。

多態(tài)信息含量(PIC)可以衡量位點(diǎn)多態(tài)性。PIC值與群體內(nèi)基因的一致性呈反比，而與群體的變異性和選擇潛力呈正比。在本試驗(yàn)中，測(cè)試綿羊群體TSHR基因的PIC值在0～0.491 0，除SNP2和SNP5外，其余位點(diǎn)的PIC值在烏珠穆沁綿羊群體中均高于湖羊群體，其中SNP1、SNP3和SNP4位點(diǎn)在烏珠穆沁羊群體中屬于中度多態(tài)，在湖羊群體中屬于低度多態(tài)，說(shuō)明這些位點(diǎn)在兩個(gè)綿羊群體中的變異程度存在一定差異，并且在烏珠穆沁羊群體中遺傳變異較大，通過(guò)本品種選育有望獲得較大的進(jìn)展；而兩個(gè)綿羊群體中其余位點(diǎn)的PIC值比較接近，說(shuō)明這些位點(diǎn)在這兩個(gè)綿羊群體中的變異程度未存在太大的差異。獨(dú)立性χ2檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SNP1、SNP3、SNP4和SNP5 4個(gè)位點(diǎn)的基因型在烏珠穆沁羊和湖羊間的分布具有極顯著差異(P<0.01)。這4個(gè)位點(diǎn)在兩個(gè)綿羊品種群體中的分布具有共同點(diǎn)，即優(yōu)勢(shì)等位基因型不同，且純合基因型在兩個(gè)綿羊群體中的分布頻率相差較大，例如，SNP4位點(diǎn)在烏珠穆沁綿羊群體中的優(yōu)勢(shì)基因型為CC，其頻率為46.88%，而其在湖羊群體中的頻率僅為2.67%，這一結(jié)果與高磊等[19]的研究結(jié)果一致，他們發(fā)現(xiàn)TSHR基因第10外顯子481 bp處，即本研究中的SNP4位點(diǎn)發(fā)生了T-C突變，此突變雖為同義突變，但其等位基因的分布在常年發(fā)情和季節(jié)性繁殖等具有不同繁殖周期的綿羊群體中具有顯著差異(P<0.01)，等位基因頻率T/C 與繁殖特性密切相關(guān)，即該多態(tài)位點(diǎn)與季節(jié)性繁殖性狀具有較強(qiáng)的相關(guān)性。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)與其他多態(tài)位點(diǎn)相比，分布差異極顯著的這些位點(diǎn)的Fst值相對(duì)較大，說(shuō)明在這些位點(diǎn)中兩個(gè)綿羊群體之間存在一定程度的遺傳分化，因此，這些位點(diǎn)可作為后續(xù)研究的重點(diǎn)。

3.3對(duì)mRNA和蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

大多數(shù)表型性狀的改變并不是由單個(gè)位點(diǎn)突變引起的，而是由多個(gè)位點(diǎn)突變形成的單倍型相互作用的結(jié)果[20]。本研究對(duì)在兩個(gè)品種中等位基因分布差異極顯著的4個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行單倍型分析，發(fā)現(xiàn)它們?cè)跒踔槟虑哐蛉褐泄残纬?種不同單倍型，主要以H1為主；在湖羊群體中則形成5種單倍型，以H4為主。mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，6個(gè)單倍型的二級(jí)結(jié)構(gòu)和最小自由能均有不同程度的差異，其中H2單倍型的最小自由能最大，H4單倍型的最小自由能最小。因此，H4具有更加穩(wěn)定的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)SNP3、SNP4和SNP5位點(diǎn)的改變均導(dǎo)致mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，它們所引起mRNA結(jié)構(gòu)變化有可能影響細(xì)胞因子對(duì)TSHR基因的加工、轉(zhuǎn)運(yùn)等，致其表達(dá)和成熟異常，進(jìn)而與繁殖性狀變異相關(guān)。

進(jìn)一步的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，SNP5位點(diǎn)的錯(cuò)義突變導(dǎo)致了TSHR蛋白第655位的絲氨酸變成精氨酸，使得其α螺旋、β轉(zhuǎn)角、延伸鏈和自由卷曲等二級(jí)結(jié)構(gòu)的比例均發(fā)生改變。TSHR跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示此位點(diǎn)位于第6和第7跨膜區(qū)之間，即第3胞外環(huán)結(jié)構(gòu)上，胞內(nèi)環(huán)含有一個(gè)蛋白激酶C的作用位點(diǎn)。L.Alberti等[21]通過(guò)對(duì)甲狀腺功能正常和高TSH血癥患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，10位患者中有4位存在TSHR基因突變，這些突變導(dǎo)致其受體蛋白的功能發(fā)生改變。其中編碼受體蛋白的第655位氨基酸處CA堿基的缺失，使受體蛋白缺少第7跨膜片段及胞內(nèi)尾端，進(jìn)而導(dǎo)致受體蛋白功能喪失。因此，本研究中SNP5位點(diǎn)的錯(cuò)義突變是否使TSHR的功能發(fā)生改變，甚至是否是造成季節(jié)性和常年性發(fā)情綿羊發(fā)情差異的原因之一，還有待進(jìn)一步的研究。

綜上所述，綿羊TSHR基因外顯子SNP1、SNP3、SNP4和SNP5 4個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性在烏珠穆沁羊和湖羊群體中存在極顯著差異，SNP1、SNP3和SNP4位點(diǎn)雖為同義突變，但其有可能通過(guò)影響mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性或密碼子的偏好性使蛋白質(zhì)亞基的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變[22]。黃冬維[23]對(duì)山羊TSHR基因多態(tài)性的研究發(fā)現(xiàn)5個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的基因型分布在季節(jié)性品種和非季節(jié)性品種間存在顯著差異，提示著TSHB基因這5個(gè)連鎖的多態(tài)位點(diǎn)可能與山羊繁殖季節(jié)性相關(guān)。因此，本研究中兩個(gè)綿羊品種中基因型分布差異極顯著的變異位點(diǎn)很可能與綿羊的季節(jié)性繁殖相關(guān)。下一步將擴(kuò)大試驗(yàn)樣本和試驗(yàn)綿羊品種，重點(diǎn)分析這些位點(diǎn)對(duì)TSHR基因表達(dá)和功能的影響，明確其不同基因型和單倍型與繁殖性狀的相關(guān)性，為對(duì)常年發(fā)情的綿羊品種的選育和改良，提高綿羊的生產(chǎn)性能和繁殖力提供更加直接的指導(dǎo)和依據(jù)。

4結(jié)論

4.1在TSHR基因外顯子上共發(fā)現(xiàn)6個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，其中4個(gè)在兩個(gè)綿羊品種中基因型的分布差異極顯著，即具有潛在生物學(xué)功能和表型效應(yīng)的突變位點(diǎn)，它們可組成6種單倍型，烏珠穆沁羊以H1單倍型為主，湖羊以H4為主，他們可能與這兩種綿羊季節(jié)性和常年性發(fā)情有關(guān)。

4.2外顯子上的SNP5突變位點(diǎn)影響TSHR基因mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，可能是與綿羊季節(jié)性繁殖相關(guān)的重要功能位點(diǎn)。

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(編輯郭云雁)

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.07.006

收稿日期：2015-12-08

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然基金聯(lián)合基金重點(diǎn)項(xiàng)目(U1503285)；“十二五”863項(xiàng)目(2011AA100307-02)

作者簡(jiǎn)介：軒俊麗(1990-)，女，河南太康人，碩士生，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究，E-mail:xuanjunli3566@126.com *通信作者：杜立新，教授，E-mail:lxdu@263.net ；張莉，副研究員，E-mail:zhangli07@caas.cn；馬友記，教授，E-mail: yjma@gsau.edu.cn

中圖分類號(hào)：S826；S813.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)07-1342-12

Study on Exon Polymorphism of Seasonal Breeding Related GeneTSHRin Sheep

XUAN Jun-li1，2，MA Xiao-meng2，WANG Hui-hua2，3，CAO Jia-xue2，WEI Cai-hong2，ZHAO Fu-ping2，MA You-ji1*，ZHANG Li2*，DU Li-xin1，2*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou730070，China；2.InstituteofAnimalScience，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100193，China)

Abstract:The study aimed to investigate the genetic variation of thyroid stimulating hormone receptor (TSHR) gene in Ujumqin sheep and Hu sheep，which had different reproductive performance and oestrous cycle，and the distribution of different haplotypes caused by the polymorphic site and its effects on mRNA and secondary structure of protein.This study provided a theoretical basis for seeking the influence of the mutation on TSHR gene expression and phenotype.Direct sequencing was taken to study genetic variation of the TSHR gene in 172 sheep of 2 Chinese Mongolian sheep strains.6 mutant sites were found and genotyped.Chi-square test for independence was performed to find the genotypes of the 4 SNPs (SNP1，SNP3，SNP4 and SNP5) which were significantly different between the 2 sheep populations(P<0.01).The SNP5 was missense mutation，the other sites were synonymous mutations.Linkage disequilibrium analysis was used to screen the 4 sites，complete linkage happened between SNP3 and SNP4，and the other sites present different degrees of interlocking relationship.Bioinformatics analysis revealed that not only the mutations occured in the TSHR，but also different haplotypes could result in the changes of mRNA and the secondary structure of protein.These results indicate that：(1) The genotypes distribution of 4 sites in TSHR gene have significant differences between the 2 sheep populations.They form 6 haplotypes，among which H1(CGCC) is the advantage haplotype in Ujumqin sheep，and H4(TTTG) is the advantage haplotype in Hu sheep.(2) The SNP5 site affects the stability of mRNA and protein secondary structure of TSHR gene，which may be one of the important functional sites with potential phenotypic effects.

Key words:sheep；seasonal breeding；TSHR gene；polymorphism