趙娟熊峰鮑美華張玉茜周少鴻曾杰李廣意李建明

論著

酒精對(duì)幼鼠海馬神經(jīng)組織發(fā)育及Kainate受體的影響☆

趙娟*熊峰*鮑美華*張玉茜*周少鴻*曾杰*李廣意*李建明*

目的探討酒精對(duì)幼鼠神經(jīng)組織發(fā)育及紅藻氨酸（kainate，KA）受體表達(dá)的影響。方法從小鼠P7齡開始，用20%酒精皮下注射法建立胎兒酒精系列紊亂（fetal alcohol spectrum disorder，F(xiàn)ASD）模型并以生理鹽水注射的幼鼠為對(duì)照組（酒精實(shí)驗(yàn)組80只，對(duì)照組40只），兩組各每天測(cè)量體重，并觀察一般生物學(xué)特性，建模完成后進(jìn)行Morrirs水迷宮行為學(xué)檢測(cè)。另取P7小鼠30只（酒精實(shí)驗(yàn)組15只，對(duì)照組15只），皮下注射酒精和生理鹽水24h后取腦組織進(jìn)行FJB染色。免疫熒光法檢測(cè)KA受體亞型KA1、KA2、GluR-6及GFAP的表達(dá)情況。結(jié)果注射3周后，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠體重增長(zhǎng)速度明顯降低（對(duì)照組21.13g±1.72g，實(shí)驗(yàn)組13.96g±2.98g，P＜0.05）；Morrirs水迷宮實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組逃避潛伏期時(shí)間明顯延長(zhǎng)（對(duì)照組21.05s±5.31s，實(shí)驗(yàn)組34.15s±3.26s，P＜0.05），穿越平臺(tái)次數(shù)也明顯減少（對(duì)照組2.70次±1.25次，實(shí)驗(yàn)組0.93次±0.80次，F(xiàn)=2.505，P＜0.05）；GFAP熒光結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組小鼠從酒精注射7 d開始星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育發(fā)生異常；FJB結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組皮質(zhì)、海馬、丘腦都有神經(jīng)元細(xì)胞大量死亡；實(shí)驗(yàn)組小鼠P14齡GluR-6和KA2亞型在海馬CA區(qū)表達(dá)有上調(diào)。結(jié)論海馬CA區(qū)KA受體GluR-6和KA2亞型可能與酒精影響的幼鼠海馬神經(jīng)組織發(fā)育有關(guān)。

酒精神經(jīng)細(xì)胞星形膠質(zhì)細(xì)胞KA受體

ZHAO Juan，XIONG Feng，BAO Meihua，ZHANG Yuqian，ZHOU Shaohong，ZENG Jie，LI Guangyi，LI Jianming.De?partment of Anatomy，Histology and Embryology，ChangshaMedical University，Changsha 410219.Tel：0731-88498021.

【Abstract】Objectives To investigate the effects of ethanol on neural development and kainate receptor expression in young mice.Methods Fetal alcohol spectrum disorder model was established by administration of 20%ethanol solu?tion to 7-day-old Kunming mice and control animals received physiological saline（The number of treatment and control were 80 and 40，respectively）.Body weight and general biological features were observed every day.Morris water maze was used to test learning and memory ability.Fluoro-Jade B was used to examine neural cells 24 hours after treatment in additional thirty 7-day-old Kunming mice which were further divided into two groups：a treatment group receiving 20% ethanol solution（n=15）and a control group receiving physiological saline（n=15）.The development of neural cells and expression levels of kainite receptors were examined by using immunofluorescence staining.Results The body weight was significantly lighter in treatment group than in control group（control：21.13±1.72g，treatment：13.96±2.98g，P＜0.05）.Morris test showed that model group had longer latency than control group to find hidden platform（control：21.05± 5.31s，treatment：34.15±3.26s，P＜0.05）.Spatial probe test revealed that the number of passing through the platform were significantly smaller in model group than in control group（control：2.70±1.25 times，treatment：0.93±0.80 times，P＜0.05）.Astrocyte development anomaly was evident after ethanol treatment for 7 days.The expression levels of kainite re?ceptor GluR-6 and KA2 were up-regulated in the CA region of the hippocampus after ethanol treatment for 7 days.Conclusion Kainite receptor GluR-6 and KA2 in CA region of the hippocampus may contribute to ethanol-induced hippo?campal neural development anomaly.

【Key Words】Ethanol Nerve cells Astroglia cells Kainate receptor

胎兒酒精系列紊亂（fetal alcohol spectrum dis?order，F(xiàn)ASD）是指酒精相關(guān)性胎兒發(fā)育障礙，如酒精相關(guān)性疾病、酒精相關(guān)性生理缺陷、酒精相關(guān)性神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙等，包含胎兒和嬰幼兒酒精暴露所致的發(fā)育、生理、心理、行為和學(xué)習(xí)等方面的問(wèn)題［1，2］。紅藻氨酸（kainate，KA）受體家族由5種不同亞基組成，分別是GluR5、GluR6、GluR7及親和力更高的KA1和KA2，這5種亞基分別由Grik1-5基因表達(dá)形成［3］。KA受體家族在神經(jīng)系統(tǒng)中有著廣泛分布，GluR5主要存在于背根節(jié)細(xì)胞、大腦扣帶皮質(zhì)及小腦的Purkinje細(xì)胞中；GluR6主要分布在海馬的齒狀回以及CA1區(qū)、CA3區(qū)、小腦顆粒細(xì)胞、紋狀體中，在大腦腦回神經(jīng)元的樹突等位置也有分布；GluR7在全腦都呈低水平表達(dá)；KA1幾乎只分布在海馬的CA3區(qū)；KA2則廣泛分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中［4］。KA受體是脊椎動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一類興奮性神經(jīng)遞質(zhì)受體，參與突觸傳遞過(guò)程［5］。另外，KA受體在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中也有著重要的作用［6］。有報(bào)道表明，KA受體在動(dòng)物發(fā)育時(shí)期對(duì)樹突的生長(zhǎng)有調(diào)節(jié)作用［7］。目前KA受體在神經(jīng)細(xì)胞興奮性中毒機(jī)制、神經(jīng)退行性疾病及精神疾病中有所研究［8］，但KA受體是否參與酒精影響的神經(jīng)發(fā)育中目前尚不明確。本文意在建立小鼠FASD模型，研究KA受體在小鼠神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中的變化，并初步研究酒精對(duì)幼鼠神經(jīng)發(fā)育的影響及機(jī)制。

1材料與方法

1.1研究對(duì)象清潔級(jí)昆明小鼠（湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供）置于12 h晝夜循環(huán)的恒溫（24℃）濕度（50%±5%）動(dòng)物房?jī)?nèi)喂養(yǎng)，按雌、雄鼠3：1合籠，每日8時(shí)檢查雌鼠是否有陰道栓確定受孕日期，定為妊娠開始，妊娠5d小鼠20只隨機(jī)平均分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。小鼠出生第1天稱為P0 （P=days postnatal，P0=the first 24hours after birth），在小鼠P7齡時(shí)，參照Ikonomidou C的方法建模［9］。

1.2動(dòng)物模型制備先將56°紅星二鍋頭用生理鹽水稀釋成含20%酒精的溶液［10］，輕取P7齡小鼠稱量體重，用75%的酒精溶液擦拭小鼠背部，實(shí)驗(yàn)組用二鍋頭稀釋成的含20%酒精的溶液按2.5g/kg傾斜15°在幼鼠背處皮下注射，分兩次進(jìn)行，兩次間隔2h；對(duì)照組則用生理鹽水代替按相同的方法處理［9］。

1.3一般情況檢查［11］每天測(cè)量小鼠體重變化情況，觀察其毛發(fā)、進(jìn)食量、排尿量、排便量等一般營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)，并觀察是夠合并有腦血管意外等神經(jīng)系統(tǒng)損傷的表現(xiàn)，如：偏側(cè)肢體癱瘓、抽搐發(fā)作等。

1.4 Morris水迷宮檢測(cè)小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力酒精皮下注射21 d，即小鼠P28齡后，參照賴紅［12］的方法進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過(guò)連續(xù)4d的訓(xùn)練后，撤掉隱藏的平臺(tái)，通過(guò)檢測(cè)記錄并分析小鼠的定位航行能力與空間探索能力（定位航行實(shí)驗(yàn)的考察指標(biāo)為逃避潛伏期所用的時(shí)間，空間探索實(shí)驗(yàn)檢測(cè)檢測(cè)指標(biāo)為小鼠60s內(nèi)穿越有效區(qū)域次數(shù)），用來(lái)判斷小鼠的學(xué)習(xí)能力和空間記憶能力［13］。

1.5取材取兩組小鼠，2.5%三溴乙醇（16mL/kg）腹腔注射麻醉，經(jīng)左心室灌注生理鹽水再灌注濃度為4%甲醛，取全腦放入4%多聚甲醛中后固定，置于4℃的冰箱固定過(guò)夜，次日置于30%蔗糖PBS溶液48 h，至腦沉底。將全腦在-30℃冷凍切片機(jī)切片，厚度為15μm。將切片保存在用多聚賴氨酸處理過(guò)的玻片上，為后續(xù)的熒光染色備用。

1.6 FJB染色檢測(cè)小鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞死亡情況

另取P7齡小鼠30只，背部酒精皮下注射24h后，取腦冷凍切片，常規(guī)Fluoro-Jade B（FJB）染色［14］先用含1% NaOH的80%乙醇溶液浸泡2min，再放入0.06%高錳酸鉀溶液，恒溫?fù)u床20 min，最后使用0.000 4%FJB染色20 min。通過(guò)熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.7免疫熒光檢測(cè)KA受體的表達(dá)和星形膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育將含KA1、KA2、GluR-5、GluR-6、GluR-7和GFAP的體積分?jǐn)?shù)為5%的小牛血清和0.3%Tri?ton-100的PBS溶液滴加在切片上，置于4℃中反應(yīng)過(guò)夜，次日經(jīng)PBS浸洗后，切片在相應(yīng)的熒光二抗里孵育2 h，然后在熒光顯微鏡下觀察檢測(cè)［15］。

2結(jié)果

2.1一般情況兩組共110只小鼠，經(jīng)過(guò)3周造模后共死亡28只.其中，實(shí)驗(yàn)組幼鼠80只死亡25只（31.25%），無(wú)操作不當(dāng)導(dǎo)致死亡；對(duì)照組小鼠40只死亡3只（7.5%），無(wú)操作不當(dāng)導(dǎo)致死亡。實(shí)驗(yàn)組由于酒精刺激作用，一直存在著注射困難，并于P21齡后出現(xiàn)毛發(fā)雜亂、無(wú)光澤、干枯等情況。P28齡后實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)脫毛、倦怠、消瘦、精神萎靡不振（造模小鼠55只中有50只出現(xiàn)這類情況，占總數(shù)的91%）。經(jīng)重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)資料的方差分析，不同處理時(shí)相之間小鼠體重存在差別（F= 391.628，P＜0.01）；不同處理的小鼠體重之間也存在差別（F=21.490，P＜0.01）；處理時(shí)相和不同處理之間也存在交互作用（F=24.204，P＜0.01）。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組P14、P21、P28齡小鼠的體重明顯較輕（對(duì)照組：7.61g±1.29g，12.20g±2.14g，21.13g±1.72g；實(shí)驗(yàn)組：6.21g±0.93g，8.41g±1.22g，13.96g±2.98g），兩組有顯著差異（P＜0.05），見表1。

2.2Morris水迷宮檢測(cè)記憶及學(xué)習(xí)能力在定位航行試驗(yàn)中，經(jīng)重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)資料的方差分析，不同處理時(shí)相之間小鼠尋找平臺(tái)所需潛伏期存在差別（F=13.734，P＜0.01）；不同處理的小鼠尋找平臺(tái)所需潛伏期之間也存在差別（F=11.726，P＜0.01）；但處理時(shí)相和不同處理之間不存在交互作用（F= 1.708，P＞0.05）。兩組小鼠尋找平臺(tái)所需潛伏期均有隨著訓(xùn)練進(jìn)程而下降的趨勢(shì)，但除了Day1（訓(xùn)練第一天）外，實(shí)驗(yàn)組的潛伏期都要長(zhǎng)于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比具有顯著差異（P＜0.05）（Day2、Day3、Day4對(duì)照組的逃避潛伏期為：34.68s±8.89s、28.40s±4.54s、21.05s±5.31s；實(shí)驗(yàn)組為49.15s±9.81s、42.75s±10.08s、34.15±3.26s），見表2。在空間探索實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組小鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡大多集中在有效區(qū)域象限，并停留搜索時(shí)間較長(zhǎng)，跨越有效區(qū)域象限位置次數(shù)較多。而實(shí)驗(yàn)組多沿池壁運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)軌跡隨機(jī)分布。實(shí)驗(yàn)組小鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)少于對(duì)照組小鼠（對(duì)照組：2.70次±1.25次；實(shí)驗(yàn)組：0.93次± 0.80次），兩者有顯著差異（F=2.505，P＜0.05）。

2.3 FJB檢測(cè)細(xì)胞死亡FJB可與變性死亡的神經(jīng)元結(jié)合而產(chǎn)生綠色熒光。實(shí)驗(yàn)組小鼠皮下注射酒精24h后，進(jìn)行FJB染色，結(jié)果顯示在小鼠的整個(gè)腦區(qū)有大面積的神經(jīng)元細(xì)胞死亡，以皮質(zhì)、海馬和丘腦下部尤為顯著，而對(duì)照組中僅有個(gè)別細(xì)胞發(fā)生死亡，應(yīng)為自然死亡（見圖1）。

2.4免疫熒光檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量及形態(tài)星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記物膠原纖維酸性蛋白（gli?al fibral acidic protein，GFAP）免疫熒光結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組小鼠酒精皮下注射7 d后開始出現(xiàn)胞體瘦小，突起變細(xì)變短的現(xiàn)象，到皮下注射21 d后，實(shí)驗(yàn)組小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯少于對(duì)照組，且細(xì)胞體積較小，突觸數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于對(duì)照組（見圖2）。

表1　兩組小鼠體重（g）的變化比較

表2　Morris水迷宮測(cè)試各組小鼠逃避潛伏期（s）

2.5免疫熒光KA受體的表達(dá)差異KA受體幾種亞型KA1、KA2、GluR-6的免疫熒光（紅色）分析結(jié)果顯示：在連續(xù)注射生理鹽水7 d后的小鼠中，KA2的表達(dá)海馬在CA2和CA3區(qū)都有微量的表達(dá)（見圖3，N），GluR-6主要在CA3區(qū)有低表達(dá)（見圖3，V）。實(shí)驗(yàn)組小鼠連續(xù)酒精注射7 d后，KA2 在CA2、CA3的表達(dá)明顯上升，而GluR-6在CA1、CA2、CA3區(qū)域都有明顯的表達(dá)增加。而KA1亞型則在實(shí)驗(yàn)驗(yàn)組和對(duì)照組都幾乎沒有表達(dá)。當(dāng)鼠齡至21 d后，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組在海馬區(qū)域，KA1、KA2、GluR-6均無(wú)表達(dá)。

3討論

圖1　皮下注射24h后，細(xì)胞凋亡情況。實(shí)驗(yàn)組小鼠的皮質(zhì)、海馬和丘腦下部都出現(xiàn)了神經(jīng)元死亡的現(xiàn)象

圖2　星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)變化。與對(duì)照組小鼠相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠的星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量、突觸數(shù)量明顯較少

嬰幼兒時(shí)期酒精暴露會(huì)引起FASD，導(dǎo)致嬰幼兒發(fā)育異常。酒精對(duì)發(fā)育中的神經(jīng)損傷表現(xiàn)的尤為突出，而在大腦中，以海馬、皮質(zhì)區(qū)域?qū)凭拿舾行宰罡撸?6］，在本實(shí)驗(yàn)中，P7小鼠皮下酒精注射24 h后，其海馬、皮質(zhì)及丘腦下部都出現(xiàn)了明顯的神經(jīng)元死亡，這說(shuō)明海馬、皮質(zhì)及丘腦下部對(duì)酒精具有很高的敏感性。

星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最主要的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞之一，對(duì)神經(jīng)元具有營(yíng)養(yǎng)支持作用，并能引導(dǎo)神經(jīng)元的定向遷移和分化成熟，既可以通過(guò)自興奮性及突觸傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)釋放化學(xué)遞質(zhì)與神經(jīng)元形成突觸聯(lián)系，也可以增加成熟突觸的數(shù)目和功能［17］。在本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組小鼠的星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育正常，胞體大小正常，數(shù)量隨生長(zhǎng)而大量增加，突觸也正常發(fā)育；而實(shí)驗(yàn)組中從皮下注射7d后開始，GFAP表達(dá)降低，胞體瘦小、突起變細(xì)變短，這與于海艷［18］的結(jié)果相似。星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目和突觸減少，會(huì)導(dǎo)致其連接支持神經(jīng)元功能降低，干擾神經(jīng)元分化成熟，導(dǎo)致神經(jīng)元功能發(fā)育異常。在水迷宮實(shí)驗(yàn)中，模型組小鼠的學(xué)習(xí)和空間記憶能力明顯差于對(duì)照組，這可能是與酒精引發(fā)星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育異常，間接影響海馬神經(jīng)元異常有關(guān)。因此，F(xiàn)ASD產(chǎn)生的原因之一可能是酒精導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育異常。

圖3　連續(xù)注射7d、14d、21d后KA受體表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)組小鼠在注射酒精7d后KA受體KA2亞型在海馬CA2、CA3表達(dá)上調(diào)，GluR-6亞型在海馬CA1、CA2、CA3區(qū)域表達(dá)明顯上調(diào)。KA1亞型在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均無(wú)表達(dá)

在本實(shí)驗(yàn)中，新生小鼠在注射酒精的過(guò)程中出現(xiàn)了KA2、GluR6表達(dá)的上調(diào)的現(xiàn)象，這說(shuō)明酒精對(duì)KA受體有調(diào)節(jié)作用。實(shí)驗(yàn)證明GluR6是神經(jīng)系統(tǒng)中不可缺少的受體，它參與神經(jīng)元的可塑性，對(duì)學(xué)習(xí)和記憶有著重要的作用，同時(shí)還有調(diào)節(jié)突觸活動(dòng)的功能［19-20］。酒精影響的神經(jīng)發(fā)育的其中一個(gè)機(jī)制是真核細(xì)胞翻譯起始因子-2α（eukary?otic initiation factor-2α，eIF2α）被磷酸化，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成停止［21］，本實(shí)驗(yàn)室早前的研究發(fā)現(xiàn)，KA受體表達(dá)上調(diào)與P-eIF2α（磷酸化的eIF2α）上調(diào)有顯著相關(guān)性［22］。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，在連續(xù)皮下注射酒精7 d后，KA受體亞型KA2、GluR-6的表達(dá)明顯上升，同時(shí)海馬區(qū)域的星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體開始變小，突觸變細(xì)變小，這提示我們KA受體的表達(dá)短時(shí)間增高，同時(shí)激發(fā)了下游信號(hào)通路，從而影響了突觸的形成，抑制了神經(jīng)元的發(fā)育。KA受體在酒精處理過(guò)程中出現(xiàn)增高表達(dá)的現(xiàn)象也可能是KA受體參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，使得從而使小鼠神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育也受到影響?？傊?，海馬CA3區(qū)KA受體GluR-6和KA2亞型在酒精影響小鼠神經(jīng)組織發(fā)育中發(fā)揮了一定的作用，但是具體的作用機(jī)制，還需要進(jìn)一步的研究才能揭示。

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（責(zé)任編輯：甘章平）

The effects of ethanol on the hippocampal neural tissue development and kainite receptor expression in young

R651

Amouse.

10.3969/j.issn.1002-0152.2016.05.001

☆湖南省高等學(xué)校“十二五”重點(diǎn)建設(shè)學(xué)科專項(xiàng)建設(shè)項(xiàng)目（編號(hào)：湘教發(fā)［2011］76號(hào)）；湖南省自然科學(xué)基金（編號(hào)：2013JJ6010）；湖南省教育廳科研項(xiàng)目（編號(hào)：15C0152、15C0146）

*長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎教研室（長(zhǎng)沙410219）

（E-mail：ljming0901@sina.com）

2015-04-21）