蘇孝瓊　陳智鴻　王向東

(溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院呼吸科，溫州325000)

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比較兩種白細胞介素27預防給藥對哮喘小鼠氣道炎癥和STAT1磷酸化損傷的改善①

蘇孝瓊陳智鴻②王向東

(溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院呼吸科，溫州325000)

[摘要]目的：探索預防性IL-27滴鼻給藥治療哮喘小鼠氣道炎癥的最佳干預方式，并直接從組織蛋白水平進行相關研究。方法：將96只雌性C57/6J小鼠隨機分成對照組、哮喘組、IL-27滴鼻預防組Ⅰ和IL-27滴鼻預防組Ⅱ。在卵白蛋白(OVA)腹腔注射致敏與滴鼻激發(fā)誘導的小鼠哮喘模型基礎上，加用IL-27干預，一種為“致敏前IL-27小劑量、多次預防模型”，一種為“致敏后激發(fā)前IL-27小劑量、多次預防模型”。取半數小鼠激發(fā)后處死，做氣道炎癥水平評估；取半數小鼠，激發(fā)前一天處死進行肺組織信號轉導與轉錄激活子1(STAT1)和STAT1磷酸化水平的Western blot檢測。結果：致敏前IL-27小劑量、多次預防給藥，可以明顯降低哮喘小鼠BAL中IL-5和IL-13的水平(P<0.05)，抑制支氣管及血管周圍的炎癥細胞浸潤,炎癥評分明顯低于哮喘組(P<0.05)，而激發(fā)前致敏后給藥則無明顯的統計學意義(P>0.05)。哮喘小鼠體內STAT1的磷酸化在激發(fā)前就已明顯受損，致敏前的IL-27給藥能扭轉這種損傷，而激發(fā)前致敏后給藥則不能。結論：致敏前IL-27小劑量、多次預防給藥通過逆轉哮喘小鼠體內STAT1磷酸化的受損能明顯改善哮喘小鼠的氣道炎癥，而致敏后激發(fā)前的小鼠則由于在致敏階段STAT1磷酸化就已受損而對IL-27的作用產生耐受，這種耐受可能是由于致敏后小鼠氣道的CD4+T細胞就已大部分轉化為Th2細胞。

[關鍵詞]白細胞介素27；Th2分化；信號轉導與轉錄激活子1

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是一種以氣道高反應、氣道炎癥和氣道重塑為特征的常見慢性呼吸系統疾病之一，其發(fā)病率和病死率在全世界范圍內仍然呈上升的趨勢，據全球哮喘防治創(chuàng)議(GINA)預計，2025年全球哮喘患者將增加至4億[1]。近20年來，Th2細胞反應過度造成的Th1/Th2細胞失衡被公認為是哮喘發(fā)病的免疫學基礎。初始的CD4+T細胞能分化為多種Th細胞亞群，如Th1、Th2及Th17等。雖然激活的Th細胞在不同的環(huán)境下表現出一定的可塑性，比如感染，但是已經向某一亞型分化的Th細胞具有下調其向其他亞型分化潛力的趨勢。大量研究證實Th1細胞分泌的γ-干擾素(IFN-γ)能抑制Th2細胞的分化和功能；Th2細胞分泌的IL-4能抑制Th1細胞的分化和功能。Th1細胞特異性的T-box轉錄因子(T-bet)能與Th2細胞特異性的GATA-3轉錄因子(GATA-3)結合，阻止GATA-3與Th2細胞因子基因結合，抑制GATA-3的作用從而抑制Th2反應。反之，增加的GATA-3通過抑制信號轉導與轉錄激活子4(STAT4)抑制Th1細胞因子產生，從而抑制Th1反應[2-9]。這些研究結果均表明了Th1和Th2細胞既為重要的效應細胞，同時又相互抑制，促進Th1細胞分化的相關因子可以抑制Th2細胞的分化。

IL-27是2006年發(fā)現的細胞因子，為白細胞介素12(IL-12)家族的成員之一，主要由活化的樹突狀細胞和巨噬細胞分泌。大量的體外實驗表明IL-27可以通過STAT1通路促進Th1細胞的分化，從而抑制Th2細胞的分化[10，11]；外源性轉入IL-27基因可抑制利氏曼原蟲感染誘導的Th2反應[12]。但近期報道顯示IL-27不能抑制已分化的Th17細胞的再分化過程[13]。我們的前期實驗已證明在體外的CD4+T細胞的分化培養(yǎng)中，高濃度的IL-4環(huán)境會損傷STAT1蛋白的磷酸化而使細胞產生對IL-27抑制作用的耐受，對已激發(fā)的哮喘小鼠給予IL-27治療并不能改善小鼠的氣道炎癥，而對致敏前的小鼠給予IL-27滴鼻干預能明顯削弱哮喘小鼠的氣道炎癥[14，15]。為進一步探索IL-27預防給藥的最佳方式，我們構建了兩種IL-27滴鼻給藥干預哮喘小鼠模型：致敏前IL-27給藥和致敏后激發(fā)前IL-27給藥，并進一步從活體水平研究IL-27減輕氣道過敏性炎癥的機制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物清潔級C57小鼠，雌性，體重20～25 g，6～8周齡，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供。實驗前1周飼養(yǎng)于復旦大學附屬中山醫(yī)院動物房，清潔級恒溫(25℃)環(huán)境，標準飼料，自由取水，12 h晝夜。

1.1.2主要試劑卵清蛋白(OVA)干粉(GradeV，美國Sigma公司),Alum(美國Thermo Pierce公司)，鼠IL-27、鼠IL-5、IL-13(美國R&D公司)， p-STAT1抗體、STAT1抗體，GAPDH抗體(美國Cell Signaling公司)，HE染色套裝(南京建成生物制品研究所)。

1.2實驗方法

1.2.1實驗分組及干預方案(1)致敏前IL-27小劑量、多次滴鼻給藥預防組(即IL-27預防組Ⅰ)：①哮喘組(OVA組)：于實驗開始第0天和第7天給予腹腔注射100 μl致敏液(OVA 100 μg，Alum 2 mg)。第14～18天為激發(fā)階段，麻醉狀態(tài)下鼻腔滴入1%OVA溶液50 μl，每日1次，連續(xù)5 d。末次激發(fā)后24 h處死小鼠。②IL-27 50 ng滴鼻預防組(OVA+IL-27 50 ng組)：在實驗開始前即第一次致敏前第7天，小鼠在麻醉狀態(tài)下(異氟烷吸入性麻醉)鼻腔滴入25 ng IL-27溶液，每天2次，共50 ng，連續(xù)14 d，其余方法同哮喘組。③IL-27 100 ng滴鼻預防組(OVA+IL-27 100 ng組)：在實驗開始前至實驗開始第7天，小鼠在麻醉狀態(tài)下鼻腔滴入 50 ng IL-27溶液，每天2次，共100 ng，連續(xù)14 d，其余方法同哮喘組。④對照組(PBS組)：致敏液和激發(fā)液均為PBS,操作時間點同哮喘組。半數小鼠于激發(fā)前24 h處死，取肺組織-80℃保存，檢測STAT1磷酸化水平；半數小鼠于末次給藥后24 h處死小鼠，肺組織用4%多聚甲醛固定并石蠟包埋。每組12只小鼠，共48只小鼠。

(2)致敏后激發(fā)前IL-27小劑量、多次滴鼻給藥預防組(即IL-27預防組Ⅱ)：①哮喘組(OVA組)：同上。②IL-27 50 ng滴鼻預防組(OVA+IL-27 50 ng組)：在第二次致敏后(包括第二次致敏當天)，小鼠在麻醉狀態(tài)下(異氟烷吸入性麻醉)鼻腔滴入25 ng IL-27溶液，每天2次，共50 ng，連續(xù)7 d即到激發(fā)前一天，其余方法同哮喘組。③IL-27 100 ng滴鼻預防組(OVA+IL-27 100 ng組)：在第二次致敏后(包括第二次致敏當天)，小鼠在麻醉狀態(tài)下鼻腔滴入 50 ng IL-27溶液，每天2次，共100 ng，連續(xù)7 d，其余方法同哮喘組。④對照組(PBS組)：致敏液和激發(fā)液均為PBS,操作時間點同哮喘組。半數小鼠于激發(fā)前24 h處死，取肺組織-80℃保存，檢測STAT1磷酸化水平；半數小鼠于末次給藥后24 h處死小鼠，肺組織用4%多聚甲醛固定并石蠟包埋。每組12只小鼠，共48只小鼠。

1.2.2肺組織形態(tài)觀察及炎癥病理評分肺組織切片分別行HE染色，×200光鏡下觀察肺組織病理學改變。根據Jeffrey等[16]提出的小鼠肺組織炎癥病理評分，對總炎癥、血管周圍炎癥和支氣管周圍炎癥進行評分。

1.2.3ELISA檢測BAL中IL-5和IL-13濃度頸椎脫臼處死小鼠，行支氣管肺泡灌洗(每次注入含5%FBS+0.01 nmol/L EDTA 的PBS 0.3 ml立即回收，共3次，回收率80%～90%)，置于1.5 ml EP管中，4℃，2 000 r/min，離心5 min，取上清置于-80℃保存。用含有抗IL-5或IL-13抗體的包被緩沖液，4℃過夜包被酶標板。每孔加入200 μl檢測稀釋液以中和非特異性抗體，沖洗后每孔分別加入IL-5或IL-13標準液或樣本各100 μl，孵育2 h，清洗后每孔加入100 μl含有檢測抗體的檢測液，孵育1 h。最后分別加入底物液和終止液。用450nm的酶標板讀取光密度值。

1.2.4Western blot檢測各組肺組織p-STAT1和總STAT1水平肺組織加細胞裂解液[每0.01 g組織+100 μl細胞裂解液+1 μl 苯甲基磺酰氟(PMSF)]機器勻漿后離心取上清測蛋白濃度。10% SDS PAGE分離總蛋白并電轉移至硝酸纖維素膜上，1∶1 000稀釋的抗p-STAT1、STAT1抗體分別進行蛋白印記分析，ECL化學發(fā)光試劑盒顯像，凝膠圖像分析系統分析各蛋白條帶灰度值，并以GAPDH為內參標化各樣品。

2結果

2.1IL-27預防組Ⅰ中小鼠氣道炎癥明顯減弱結果顯示預防性致敏前小劑量多次氣道局部IL-27給藥可明顯降低哮喘小鼠BAL中IL-5和IL-13的水平(P<0.05)，且小劑量的IL-27即能達到明顯效果(見圖1)；同時抑制支氣管周圍炎癥細胞的浸潤，抑制氣道上皮細胞的增殖肥厚，杯狀細胞增生和基質層的增生。同時也可輕度抑制血管周圍炎癥細胞的浸潤。采用Jeffrey等[16]提出的小鼠肺部炎癥病理評分法，對血管周圍和支氣管周圍的炎癥評分發(fā)現OVA+IL-27 50 ng組、OVA+IL-27 100 ng組與OVA組比較，炎癥評分顯著降低(P<0.05)，而且小劑量的IL-27即顯示明顯的效果。結果見圖1～3。

圖1　IL-27預防組Ⅰ各組小鼠BAL 中IL-5和IL-13 水平Fig.1　Level of IL-5 and IL-13 in BAL of mice in IL-27 prevention groupⅠNote: A.Concentration of IL-5 in each group；B.Concentration of IL-13 in each group.***.P<0.001.

圖2　IL-27預防組Ⅰ各組小鼠肺組織HE染色(×200)Fig.2　Representative photomicrographs of lung sections stained with H&E and examined of mice in IL-27 prevention group Ⅰ(×200)Note: A,B,C,D.Represents the group of PBS,OVA,OVA+IL-27 50 ng and OVA+IL-27 100 ng respectively.

圖3　IL-27預防組Ⅰ各組小鼠氣道炎癥的病理評分Fig.3　Airway inflammation scores of peribronchial and perivascular inflammation cells of mice in IL-27 prevention group ⅠNote: A.Total inflammation score；B.Peribronchial inflammation score；C.Perivascular inflammation score.***.P<0.001.

2.2IL-27預防組Ⅱ中小鼠氣道炎癥無明顯改善結果顯示在致敏后激發(fā)前IL-27小劑量、多次給藥，對哮喘小鼠BAL中IL-5和IL-13的水平無明顯降低(P>0.05)；對支氣管周圍和血管周圍炎癥細胞的浸潤雖有輕微抑制作用，但是采用Jeffrey等[16]1991年提出的小鼠肺部炎癥病理評分法，對血管周圍和支氣管周圍的炎癥評分發(fā)現OVA+IL-27 50 ng、組OVA+IL-27 100 ng組與OVA組比較，炎癥評分無顯著降低(P>0.05)。結果見圖4～6。

圖4　IL-27預防組Ⅱ各組小鼠BAL 中IL-5和IL-13 水平Fig.4　Level of IL-5 and IL-13 in BAL of mice in IL-27 prevention group ⅡNote: A.Concentration of IL-5 in each group；B.Concentration of IL-13 in each group.***.P<0.001.

圖5　IL-27預防組Ⅱ各組小鼠肺組織HE染色(×200)Fig.5　Representative photomicrographs of lung sections stained with H&E and examined of mice in IL-27 prevention group Ⅱ(×200)Note: A,B,C,D.Represents the group of PBS,OVA,OVA+IL-27 50 ng and OVA+IL-27 100 ng respectively.

圖6　IL-27預防組Ⅱ各組小鼠氣道炎癥的病理評分Fig.6　Inflammation scores of peribronchial and perivascular inflammation cells of mice in IL-27 prevention group ⅡNote: A.Total inflammation score；B.Peribronchial inflammation score；C.Perivascular inflammation score;***.P<0.001.

2.3致敏前IL-27小劑量、多次滴鼻給藥扭轉激發(fā)前受損的哮喘小鼠STAT1蛋白的磷酸化我們前期實驗結果表明IL-27之所以無法抑制Th2細胞的再分化，是由于CD4+T細胞在第一輪分化為Th2細胞過程中損傷了STAT1蛋白的磷酸化，致使在第二輪的Th2環(huán)境培養(yǎng)中即再分化的過程中對IL-27的抑制作用產生耐受[14]，我們后期的動物實驗也表明在哮喘激發(fā)后期給予IL-27治療無法改善哮喘氣道炎癥[15]。于是我們推測IL-27預防給藥之所以能改善哮喘氣道炎癥，可能是由于在哮喘激發(fā)前扭轉了STAT1的磷酸化，提前為氣道局部提供了一個Th1環(huán)境，從而削弱了哮喘的發(fā)作。鑒于這一推斷，我們在每組小鼠激發(fā)前24 h處死小鼠，取其肺組織進行STAT1蛋白的Western blot檢測。結果表明哮喘小鼠在激發(fā)前STAT1蛋白的磷酸化就已受損，而致敏前IL-27小劑量、多次給藥能扭轉這一損傷，結果見圖7。

圖7　致敏前IL-27小劑量、多次給藥扭轉激發(fā)前受損的哮喘小鼠STAT1蛋白的磷酸化Fig.7　Low-dose-multiple preventive administration of IL-27 before OVA sensitization reversed impairment of phosphorylation of STAT1 in asthma miceNote: A，B.Level of the phosphorylation of STAT1 in mice of each group.*.P<0.05,**.P<0.01.

圖8　致敏后激發(fā)前IL-27小劑量、多次給藥對激發(fā)前受損的哮喘小鼠STAT1蛋白的磷酸化沒有明顯改善Fig.8　Low-dose-multiple preventive administration after OVA sensitization before OVA challenge had no significant effect on impairment of phosphorylation of STAT1 in asthma miceNote: A，B.Level of the phosphorylation of STAT1 in mice of each group.***.P<0.001.

2.4致敏后激發(fā)前IL-27給藥對小鼠哮喘無明顯改善致敏后激發(fā)前IL-27小劑量、多次滴鼻給藥對激發(fā)前受損的哮喘小鼠STAT1蛋白的磷酸化無明顯改善，無法逆轉哮喘小鼠STAT1磷酸化的損傷，結果見圖8。

3討論

IL-27能在細胞水平通過STAT1通路促進Th1的分化從而抑制Th2的分化，但IL-27是否能在動物水平抑制OVA誘導的氣道過敏性炎癥？目前很少有人報道。我們前期研究制造了兩種IL-27干預哮喘小鼠模型：一種是致敏前IL-27預防給藥，另一種是激發(fā)時IL-27治療給藥。結果發(fā)現Il-27預防給藥確實能改善哮喘小鼠的氣道炎癥，而IL-27治療給藥卻無統計學意義。通過提取小鼠脾臟的CD4+T細胞進行分化培養(yǎng)，我們進一步發(fā)現IL-27能抑制初始CD4+T淋巴細胞的Th2分化，但無法抑制已分化的Th2細胞的再分化，其原因在于高濃度的IL-4環(huán)境損傷了CD4+T淋巴細胞上STAT1的磷酸化從而產生了對IL-27抑制作用的耐受[14,15]。然而在小鼠哮喘造模的過程中，到底從哪個階段開始氣道局部處于高濃度IL-4環(huán)境？顯然，在哮喘激發(fā)階段，小鼠氣道局部必然處于高濃度IL-4環(huán)境，IL-27的治療無效也證明了這一點；那么致敏后激發(fā)前這段時間氣道局部是否處于高濃度IL-4環(huán)境？如果在這個階段給予IL-27的預防治療是否能改善激發(fā)后的氣道炎癥？如果能改善，和致敏前IL-27給藥的效果相比如何？預防性IL-27給藥到底是如何改善哮喘小鼠的氣道炎癥的？

因此，我們設計了兩種IL-27干預的動物模型，一種為“致敏前IL-27小劑量、多次預防干預”，另一種為“致敏后激發(fā)前IL-27小劑量、多次預防干預”。研究結果顯示雖然致敏后激發(fā)前IL-27給藥能輕度抑制支氣管及血管周圍的炎癥細胞浸潤，但與OVA組相比，尚無統計學差異。而致敏前IL-27小劑量、多次預防給藥組，可以明顯抑制支氣管及血管周圍的炎癥細胞浸潤，與OVA組相比，差異顯著。

這個結果提示我們正常小鼠在哮喘致敏后，氣道局部可能就已經處于一種高濃度IL-4環(huán)境，從而損傷了肺組織的STAT1磷酸化，使IL-27的干預無效。為了驗證這一假設，我們于激發(fā)前一天處死兩組小鼠，提取對應組肺組織的STAT1蛋白，進行磷酸化水平的檢測。結果發(fā)現在哮喘造模的過程中，小鼠在致敏后氣道局部確實已處于高濃度IL-4環(huán)境，損傷了肺組織的STAT1磷酸化，而此時的IL-27干預無法逆轉這一損傷，相反的致敏前的IL-27連續(xù)干預卻能明顯改善STAT1磷酸化。STATs家族有1～6個亞型，其中STAT1介導了IFN-γ的產生，從而促進了Th1細胞分化[17]。而磷酸化是STAT1入核前的活化步驟，未磷酸化的STAT1不發(fā)揮信號傳遞功能。而致敏前IL-27預防給藥之所以能改善哮喘小鼠的氣道炎癥，其中一個原因正是因為它提高了哮喘小鼠激發(fā)前肺組織的STAT1磷酸化水平，為激發(fā)前的氣道局部提供了一個相對較高的Th1環(huán)境，從而削弱了哮喘的發(fā)作。

當然，哮喘的氣道環(huán)境是一個相當復雜的炎癥環(huán)境，包括各種炎癥因子和細胞的相互作用，同時IL-27是一個多效性的細胞因子，它猶如一把雙刃劍，既能促進Th1分化，又可以抑制Th2及Th17的分化[18,19]，對調節(jié)性T細胞也有相當復雜的調節(jié)作用[20]。我們的研究表明哮喘小鼠在致敏后，其氣道就已經處于一種高濃度IL-4環(huán)境，這種高濃度足以損傷肺組織STAT1的磷酸化從而導致IL-27的干預無效。而致敏前IL-27干預之所以能改善哮喘小鼠的氣道炎癥，其中一個原因是因為它提高了哮喘小鼠激發(fā)前肺組織的STAT1磷酸化水平，至于是否還存在其他調節(jié)途徑，還需要我們進一步探索。

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[收稿2016-01-04修回2016-01-18]

(編輯倪鵬)

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.07.020

作者簡介：蘇孝瓊(1990年-)，男，在讀碩士，主要從事哮喘方面研究，同時就職于復旦大學附屬中山醫(yī)院呼吸科，E-mail:1017154047@qq.com。 通訊作者及指導教師：陳智鴻(1976年-)，女，博士，副主任醫(yī)師，主要從事哮喘方面的研究，E-mail:15381431455@163.com。 王向東(1958年-)，男，博士，教授，主任，主要從事肺癌方面的研究，E-mail:fudanczh@163.com。

中圖分類號R392.8

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)07-1022-06

Comparison of improvement of two kinds of preventative administration of interleukin-27 on airway inflammation and impaired phosphorylation of STAT1 in asthma mice

SU Xiao-Qiong,CHEN Zhi-Hong,WANG Xiang-Dong.

Department of Pulmonary Medicine,The First Affiliated Hospital,Wenzhou Medical University,Wenzhou 325000,China

[Abstract]Objective:Animal models were set up to explore the best preventative intra-nasal administration of interleukin 27(IL-27)to diminish allergic airway inflammation of asthma and the related molecular mechanisms.Methods: Ninety-six female C57/6J mice were randomly divided into four groups,a group of the control group,a group of asthma group,and two groups of the prevention group.Based on being sensitizing and challenging with Ovalbumin(OVA) in the asthma model,two kinds of IL-27 administration asthma animal models were set up,one of which was low-dose-multiple preventive administration before OVA sensitization,one was low-dose-multiple preventive administration after OVA sensitization but before OVA challenge.Sacrificed the mice after challenging and analyzed the IL-5 and IL-13 levels in supernatant of Broncho alveolar lavage fluid(BAL) using ELISA;and HE stain and inflammation score were done for the lungs.Sacrificed the mice before challenging and used the lungs to analyze the level of total signal transducer and activator of transcription-1(STAT1) protein and phos-STAT1 based on the method of Western blot.Results: In low-dose-multiple administration before sensitization preventions group,IL-27 inhibits the secretion of IL-5 and IL-13(P<0.05) and inflammation around bronchial and vascular obviously，and the inflammation score was lower than asthma group(P<0.05),while another group has no significant effects(P>0.05).The phosphorylation of STAT1 was impaired in mice after OVA sensitization,and preventative administration of IL-27 before sensitization could reverse the impairment of STAT1,whereas another group had no obviously changes.Conclusion: Preventative administration of IL-27 before sensitization can attenuate the airway inflammation in the mouse asthma model via reversing the phosphorylation of STAT1,while the mice which has been sensitized resisting the inhibition of IL-27 due to the impairment of the phosphorylation of STAT1 and already committed Th2-CD4+T cells existed in sensitization-mice airway might be the reason for such IL-27 resistance.

[Key words]Interleukin-27；Th2 development；Signal transducer and activator of transcription-1

①本文受國家自然科學基金(No.81270078和No.81470211)項目資助。

②復旦大學附屬中山醫(yī)院呼吸科，上海200032。