米旭光　李首慶　劉　多　魏海峰　江顯卓　方艷秋

(吉林省人民醫(yī)院腫瘤綜合治療科，長春130021)

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miR-126在乳腺癌中與VEGF表達(dá)關(guān)系及其抗腫瘤效果①

米旭光李首慶劉多魏海峰江顯卓方艷秋

(吉林省人民醫(yī)院腫瘤綜合治療科，長春130021)

[摘要]目的：探討miR-126與VEGF在乳腺癌中的表達(dá)情況，及miR-126發(fā)揮的抗腫瘤效果。 方法：以qRT-PCR檢測和Western blot分析miR-126與VEGF在乳腺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)情況；以miR-126 mimics轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231，檢測miR-126對VEGF的表達(dá)影響，MTT法和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-126對腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力的影響。 結(jié)果：miR-126在乳腺癌組織和細(xì)胞中呈低表達(dá)，VEGF表達(dá)與其呈負(fù)相關(guān)，上調(diào)miR-126可以降低VEGF的表達(dá)，抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移能力。 結(jié)論：miR-126可以通過下調(diào)VEGF表達(dá)來實(shí)現(xiàn)降低乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，從而發(fā)揮抗腫瘤效果。

[關(guān)鍵詞]miR-126；VEGF；乳腺癌

乳腺癌是中國女性最常見的癌癥，是第六大中國女性癌癥的死亡原因。尋找特異性的治療靶點(diǎn)和有效的治療方法一直是克服乳腺癌的研究方向。microRNA是長約22個(gè)核苷酸的非編碼RNA，可以使靶基因mRNA降解或抑制其翻譯來影響靶基因的表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞的分化、增殖和凋亡，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、侵襲、復(fù)發(fā)和預(yù)后都有著重要的關(guān)系[1]。血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)可以促進(jìn)腫瘤血管生成，增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[2]。VEGF受到多種microRNA的直接或間接調(diào)控，調(diào)節(jié)某些特異性的microRNA的表達(dá)可能成為抗VEGF治療腫瘤的新手段。抑癌基因miR-126被證實(shí)與乳腺癌腫瘤血管形成密切相關(guān)，本研究將探討miR-126在乳腺癌細(xì)胞中對VEGF基因表達(dá)的影響及由此發(fā)揮的抗腫瘤效果。

1材料與方法

1.1細(xì)胞株與試劑人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、MCF-7、HCC1806、CAL-120、JIMT-1為本實(shí)驗(yàn)室凍存；胎牛血清、RPMI medium 1640、DMEM培養(yǎng)基(Gibco，美國)；Trizol 、LipofectamineTM2000(Life Technologies，美國)；Has-miR-126 mimics及陰性對照Cel-miR-67 mimics(上海百奧邁科，中國)；miR-126、U6、VEGF和GAPDH引物(上海生工，中國)；RT-PCR試劑盒(Promega，美國)；SYBR Green Master(Roche，瑞士)；鼠抗人VEGFA抗體(Abcam，美國)；馬抗鼠IgG(CST，美國)；GAPDH抗體(Santa，美國)；其他常規(guī)試劑產(chǎn)自北京化工。

1.2標(biāo)本采集留取2013年3月至2014年3月吉林省人民醫(yī)院乳腺癌手術(shù)標(biāo)本5例，包括癌組織5例和正常組織塊2例(距離癌灶>3 cm且病理證實(shí)無癌細(xì)胞殘留)。組織樣本取出后剪碎盡快放入液氮速凍，之后放入-80℃冰箱凍存。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231使用含10% FBS，100 μg/ml鏈霉素及100 U/ml青霉素的DMEM(高糖)培養(yǎng)基培養(yǎng)；CAL-120細(xì)胞使用含20%FBS的雙抗DMEM培養(yǎng)基；MCF-7、HCC1806、JIMT-1細(xì)胞株使用含雙抗的RPMI medium 1640培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)條件為37℃，5% CO2和100%飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱。用于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染前1 d細(xì)胞生長豐度達(dá)到70%～80%時(shí)，胰酶消化轉(zhuǎn)至細(xì)胞培養(yǎng)板中，以2×105個(gè)/孔接種細(xì)胞(以MDA-MB-231細(xì)胞，6孔細(xì)胞培養(yǎng)板為例)。轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞豐度可達(dá)60%～70%。每孔轉(zhuǎn)染miR-126 mimics 5 μl(終濃度為50 nmol/L)，具體操作步驟如LipofectamineTM2000說明書。轉(zhuǎn)染后48 h，提取RNA或蛋白用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2總RNA提取和qRT-PCR檢測用Trizol法提取乳腺癌組織、癌旁正常組織和乳腺癌細(xì)胞株總RNA。紫外分光光度計(jì)測量純度和濃度。按逆轉(zhuǎn)錄說明書將1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。得到的cDNA 5倍稀釋用于熒光定量反應(yīng)。使用2×SYBR Green Master在ABI7500熒光定量PCR儀上測定。miR-126表達(dá)以U6作為內(nèi)參，VEGF表達(dá)以GAPDH為內(nèi)參。結(jié)果以2-△△Ct表示mRNA拷貝數(shù)比值。

Hsa-miR-126:頸環(huán)引物5′-GTCGTA TCCAG TGCAG GGTCC GAGGT ATTCG CACTG GATAC GACCG CATT-3′；miR-126-3p forward primer:5′-GTCTC GTACC GTGAG TAAT-3′；miRNA Universal reverse primer:5′-GTGCA GGGTC CGAGGT-3′；U6 forward primer:5′-CTCGC TTCGG CAGCA CA-3′，reverse primer:5′-AACGC TTCAC GAATT TGCGT-3′；VEGF forward primer:5′-CGAAG TGGTG AAGTT CATGG-3′,reverse primer:5′-GTACT CGATC TCATC AGGGT-3′；GAPDH forward primer:5′-CAATG ACCCC TTCAT TGACC-3′，reverse primer:5′-GACAA GCTTC CCGTT CTCAG-3′。

1.3.3蛋白樣本制備和免疫印跡分析取100 mg組織標(biāo)本加入500 μl組織蛋白裂解液勻漿后，4℃，12 000 r/min離心10 min，取上清。乳腺癌細(xì)胞每孔加入80 μl細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞，4℃，12 000 r/min離心10 min，取上清。核酸蛋白分析儀測定蛋白濃度后，加入5×上樣緩沖液混勻，煮沸10 min，離心取上清。聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)膜，封閉液中封閉2 h，VEGF和GAPDH一抗4℃過夜，酶標(biāo)二抗室溫2 h，顯色，拍照。

1.3.4細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(MTT法)將處于生長對數(shù)期的乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231以7.5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。次日，板中待轉(zhuǎn)染細(xì)胞豐度達(dá)50%～60%，轉(zhuǎn)染miR-126 mimics 及陰性對照(NC)，每孔0.25 μl(終濃度為50 nmol/L)，設(shè)5復(fù)孔。轉(zhuǎn)染5 h后換完全培養(yǎng)液，分別于轉(zhuǎn)染換液后0、24、48、72 h每孔加入20 μl MTT溶液(MTT濃度為5 μg/ml的PBS溶液)，37℃避光培養(yǎng)4 h后，移除培養(yǎng)液，每孔加入100 μl DMSO，水平振蕩10 min，放入酶標(biāo)儀中檢測轉(zhuǎn)染組與對照組波長490nm處的光吸收值。

1.3.5細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)6孔板培養(yǎng)MDA-MB-231細(xì)胞，次日細(xì)胞豐度達(dá)60%～70%時(shí)轉(zhuǎn)染miR-126 mimics 及陰性對照(NC)，每孔5 μl(終濃度為50 nmol/L)，轉(zhuǎn)染5 h后細(xì)胞培養(yǎng)孔以細(xì)槍頭十字劃痕，輕晃培養(yǎng)板，換液后拍攝轉(zhuǎn)染0 h細(xì)胞劃痕圖像，24 h、48 h后同樣拍攝。

2結(jié)果

2.1miR-126在乳腺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)2例正常乳腺組織和5例乳腺癌組織提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄后qRT-PCR檢測miR-126在正常乳腺組織和乳腺癌組織中的表達(dá)情況(U6作為內(nèi)參)。如圖1A，與正常乳腺組織相比，乳腺癌組織miR-126表達(dá)明顯降低(P<0.05)。

圖1　miR-126在乳腺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)差異Fig.1　Expression of miR-126 in breast cancer tissues and cellsNote: A.qRT-PCR analysis of miR-126 expression in five human breast cancer tissues(T1-T5) vs.the distant non-tumor tissues(N1-N2)；B.qRT-PCR analysis of miR-126 expression in five human breast cancer cell lines.

乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、MCF-7、HCC1806、CAL-120、JIMT-1分別提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄后qRT-PCR檢測miR-126在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況。以表達(dá)miR-126最高的HCC1806細(xì)胞株為參照，各細(xì)胞株miR-126的相對表達(dá)情況如圖1B。

2.2乳腺癌細(xì)胞中VEGF的表達(dá)乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、MCF-7、HCC1806、CAL-120、JIMT-1分別提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄后qRT-PCR檢測VEGF在乳腺癌細(xì)胞中的mRNA表達(dá)水平。以表達(dá)VEGF最高的MDA-MB-231細(xì)胞株為參照，各細(xì)胞株VEGF表達(dá)情況如圖2。

結(jié)果顯示，在幾種乳腺癌細(xì)胞株中， VEGF mRNA 的表達(dá)與miR-126呈負(fù)相關(guān)。其中，miR-126表達(dá)最高的HCC1806細(xì)胞株，VEGF mRNA 表達(dá)水平最低；而miR-126表達(dá)最低的高侵襲性的MDA-MB-231細(xì)胞株，VEGF mRNA 表達(dá)水平最高。

圖2　VEGF在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)差異Fig.2　Expression of VEGF in breast cancer cells

圖3　miR-126對MDA-MB-231細(xì)胞株中VEGF表達(dá)影響Fig.3　Effect of miR-126 on VEGF in MDA-MB-231 cellsNote: A.miR-126 expression after miR-126 mimics transfected;B.VEGF mRNA expression after miR-126 mimics transfected;C.VEGF protein expression after miR-126 mimics transfected.

2.3miR-126對VEGF表達(dá)的影響miR-126 mimics 50nm轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞株48 h后，提取細(xì)胞RNA和細(xì)胞蛋白，進(jìn)行qRT-PCR檢測和Western blot分析。結(jié)果顯示，miR-126 mimics轉(zhuǎn)染后，miR-126表達(dá)顯著升高(P<0.01)(圖3A)，而VEGF mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)(圖3B)。蛋白印跡分析顯示，miR-126表達(dá)升高的情況下，VEGF蛋白表達(dá)明顯下降(圖3C)。

2.4miR-126對乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響MTT增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-126 mimics 50nm 48 h后，細(xì)胞增殖能力明顯低于對照(NC)組(P<0.05)，轉(zhuǎn)染72 h差別顯著(P<0.01)(圖4)。VEGF可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，miR-126表達(dá)增高時(shí)VEGF表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞增殖能力下降。

2.5miR-126對乳腺癌細(xì)胞遷移能力的影響劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-126 mimics 50nm 24 h后，細(xì)胞遷移能力明顯低于對照(NC)組(P<0.05)，轉(zhuǎn)染48 h差別顯著(P<0.01)(圖5)。VEGF可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，miR-126表達(dá)增高時(shí)VEGF表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞遷移能力下降。

圖4　miR-126對MDA-MB-231細(xì)胞增殖影響Fig.4　Effect of miR-126 on MDA-MB-231 cell proliferation

圖5　miR-126對MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力影響Fig.5　Effect of miR-126 on MDA-MB-231 cell migration

3討論

miRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到癌基因或抑癌基因的作用[3，4]。有抑癌基因作用的miR-126在大部分腫瘤組織中呈低表達(dá)，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與其表達(dá)的降低和缺失相關(guān)，其在腫瘤的診斷、治療及預(yù)后判斷等方面均具有潛在價(jià)值。研究發(fā)現(xiàn)[5-13]，miR-126 可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長；抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖；抑制胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移；且其表達(dá)水平與肝癌復(fù)發(fā)后生存率呈正相關(guān)； miR-126 是乳腺癌轉(zhuǎn)移的抑制因子，可抑制乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程，其缺失易導(dǎo)致預(yù)后不良和腫瘤復(fù)發(fā)。由此說明，miR-126在多種腫瘤中發(fā)揮著抑癌作用，miR-126表達(dá)增高可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，降低復(fù)發(fā)率和提高生存率。

本研究中顯示，乳腺癌組織中miR-126的表達(dá)明顯低于正常乳腺組織的表達(dá)(P<0.05)，與同類研究結(jié)果相同。在本研究中不同侵襲力的乳腺癌細(xì)胞株miR-126的表達(dá)也顯示出差異，即侵襲力強(qiáng)的乳腺癌細(xì)胞株miR-126表達(dá)明顯降低，如MDA-MB-231細(xì)胞株。侵襲和轉(zhuǎn)移能力是衡量腫瘤惡性程度的一個(gè)重要標(biāo)準(zhǔn)，所以與乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的miRNA也得到重視。本文研究的miR-126可以抑制腫瘤細(xì)胞生長和侵襲，但其作用的靶點(diǎn)和機(jī)制在現(xiàn)有研究基礎(chǔ)上仍需要深入研究。

腫瘤血管的形成是腫瘤可以生長、侵襲和轉(zhuǎn)移的必備條件之一，VEGF是腫瘤血管生成過程中作用最強(qiáng)、特異性最高的促血管生長因子，在肺癌、宮頸癌等多種人類惡性腫瘤中都有較高水平的表達(dá)。Liu等[14]發(fā)現(xiàn)編碼VEGF-A mRNA3′的非編碼區(qū)有miR-126 的結(jié)合位點(diǎn)，本研究顯示，miR-126表達(dá)最高的HCC1806細(xì)胞株，其VEGF mRNA的表達(dá)也是最低的。且在人為的調(diào)高M(jìn)DA-MB-231細(xì)胞株中miR-126表達(dá)后，VEGF mRNA和蛋白水平上的表達(dá)均降低，且乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲水平也明顯降低。我們由此推論，轉(zhuǎn)染miR-126模擬物使乳腺癌細(xì)胞中miR-126表達(dá)上調(diào)，使得VEGF表達(dá)水平明顯降低，miR-126抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲的作用可能是通過下調(diào)VEGF表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，miR-126可作為乳腺癌的一個(gè)重要抑癌基因，其表達(dá)上調(diào)可使增強(qiáng)腫瘤微血管形成相關(guān)的VEGF基因表達(dá)降低，進(jìn)而發(fā)揮抑制乳腺癌發(fā)展和轉(zhuǎn)移的功能，即miR-126可成為乳腺癌診斷、治療及復(fù)發(fā)預(yù)后等的重要參考指標(biāo)。

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[收稿2015-11-09修回2015-11-30]

(編輯倪鵬)

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.07.015

作者簡介：米旭光(1983年-)，男，博士，助理研究員，主要從事腫瘤靶向治療研究，E-mail:mixg699@163.com。 通訊作者及指導(dǎo)教師：方艷秋(1968年-)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤綜合治療的科研及臨床工作，E-mail:yq.fang@163.com。

中圖分類號R735.7

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1000-484X(2016)07-1000-04

MiR-126 expression relationship with VEGF in breast cancer and its anti-tumor effect

MI Xu-Guang,LI Shou-Qing,LIU Duo,WEI Hai-Feng，JIANG Xian-Zhuo,FANG Yan-Qiu.

Tumor Comprehensive Treatment Department,Jilin Province People′s Hospital,Changchun 130021,China

[Abstract]Objective:To probe the expression of miR-126 and VEGF in breast cancer,and the anti-tumor effect of miR-126.Methods: The expression of miR-126 and VEGF in breast cancer tissues and cells were detected by qRT-PCR and Western blot;after transfection with miR-126 mimics into MDA-MB-231,expression of VEGF was detected again,MTT assay and cell scratch test were used to verify the influence of miR-126 on proliferation and migration of tumor cells.Results: The expression of miR-126 was lower in the breast cancer tissues and cells,the expression of VEGF was negative correlation with it,increasing the expression of miR-126 may decrease the expression of VEGF and inhibit the proliferation and migration of breast cancer cells.Conclusion: miR-126 can reduce the proliferation and migration of breast cancer cells by inhibiting the expression of VEGF,which play an anti-tumor effect.

[Key words]miR-126; VEGF;Breast cancer

①本文由吉林省衛(wèi)生廳科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.2012Z080；2014Z012)、長春市社會發(fā)展科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.2012129-12SF57)和吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(No.20140519018JH；20122113)資助。