黃紅顏　譚金祥　任國勝

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌乳腺外科,重慶400016)

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·生物治療·

基質(zhì)金屬蛋白酶-11協(xié)同14促進(jìn)乳腺癌發(fā)展①

黃紅顏②譚金祥任國勝②

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌乳腺外科,重慶400016)

[摘要]目的：檢測基質(zhì)金屬蛋白酶-11和14(MMP-11和MMP-14)在乳腺癌中的表達(dá)，探討MMP-11對乳腺癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響。 方法：檢測MMP-11和MMP-14在161例浸潤性乳腺癌和10例正常乳腺組織中的表達(dá)；運(yùn)用小干擾RNA(siRNA)將高表達(dá)MMP-11的MB-231細(xì)胞抑制MMP-11，運(yùn)用Transwell小室測定其遷移和侵襲力。 結(jié)果：MMP-11和MMP-14在161例乳腺癌組織中高表達(dá)(分別為122/161及149/161)，兩者均與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)，并且MMP-11與MMP-14呈正相關(guān)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MMP-11被成功干擾后，MB-231細(xì)胞中MMP-11和MMP-14表達(dá)同時降低，并且細(xì)胞遷移、侵襲能力明顯減弱，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論：MMP-11和MMP-14均與乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)，并且MMP-11被抑制后，能下調(diào)MMP-14從而抑制乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力，它們可能成為判斷乳腺癌預(yù)后的分子標(biāo)志物及臨床治療靶點(diǎn)之一。

[關(guān)鍵詞]基質(zhì)金屬蛋白酶11/14；乳腺癌；遷移；侵襲

癌癥的發(fā)病率和死亡率位居人類疾病前列[1]，而乳腺癌又是廣大婦女常見的惡性腫瘤之一[2]?；|(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metallo proteinases,MMPs)是降解細(xì)胞外基質(zhì)諸多酶類中較為關(guān)鍵的成員之一，越來越多的研究證實(shí)MMPs與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如MMP-2、3、9、11和14等[3-5]，其中MMP-11和MMP-14表達(dá)失衡及二者之間的關(guān)系是乳腺癌轉(zhuǎn)移的重要因素之一[6]。本研究旨在檢測MMP-11和MMP-14在乳腺癌中的表達(dá)，探討對乳腺癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響及二者之間的相關(guān)性，為臨床醫(yī)生判斷乳腺癌生物學(xué)行為提供參考指標(biāo)之一。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料收集重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌乳腺外科2012年1月至2015年5月經(jīng)手術(shù)切除但未行新輔助化療的161例浸潤性乳腺癌標(biāo)本和10例正常乳腺組織標(biāo)本，均經(jīng)病理檢查證實(shí)。組織標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片。所有患者均為女性，乳腺癌患者年齡為27～79歲，平均年齡為52.6歲。人乳腺癌細(xì)胞株MB-231由實(shí)驗(yàn)室購自美國ATCC細(xì)胞庫。

1.1.2主要試劑兔抗人MMP-11和MMP-14單克隆抗體購自Abcam公司，免疫組織化學(xué)SP系列試劑盒(過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素檢測試劑盒)、PBS磷酸鹽緩沖液(pH7.2～7.4)和檸檬酸鈉緩沖液、鼠抗人單克隆抗β肌動蛋白(β-actin)抗體、羊抗兔和兔抗鼠二抗均購自北京中山金橋，MMP-11的特異性siRNA和非特異性siRNA(Negative control，NC)購自廣州銳博，脂質(zhì)體購自Invitrogen，Transwell小室、6孔板和24孔板均購自美國Corning。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1免疫組織化學(xué)染色檢測MMP-11和MMP-14蛋白的表達(dá)：參照SP三步法系列試劑盒說明書操作：組織切片于60℃孵箱2 h，放入二甲苯、酒精常規(guī)梯度脫蠟、水化后，置于檸檬酸鈉緩沖液中微波爐高火抗原修復(fù)20 min，用3%H2O2去離子水常溫孵育10 min去除內(nèi)源性過氧化物酶，用山羊血清室溫孵育15 min以封閉，然后分別滴加MMP-11和MMP-14一抗(稀釋比例均為1∶100)，4℃過夜，PBS洗去一抗后分別滴加生物素化二抗工作液及辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，分別室溫孵育15 min，PBS洗去二抗，再用DAB顯微鏡下觀察顯色，蘇木素染核。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)以PBS代替一抗的陰性對照。

1.2.2MMP-11-siRNA干擾按照脂質(zhì)體Lip-2000說明書的步驟，將NC、MMP-11-siRNA1、MMP-11-siRNA2及MMP-11-siRNA3瞬時轉(zhuǎn)染至MMP-11高表達(dá)的人乳腺癌細(xì)胞株MB-231中，選取干擾效果最好的MMP-11-siRNA1進(jìn)行MMP-14蛋白表達(dá)及細(xì)胞功能檢測。

1.2.3Western blot檢測MB-231轉(zhuǎn)染NC和MMP-11-siRNA1后，MMP-11和MMP-14的表達(dá)：向6孔板內(nèi)加入適量蛋白裂解緩沖液提取總蛋白，Bradford法測定蛋白濃度，使用微量加樣針將4 μg樣本加在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)中，采用100 V電壓電泳跑膠，90 V電壓轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后在室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h，MMP-11和MMP-14單克隆抗體(1∶1 000)為目的，β-actin(1∶1 000)為內(nèi)參過夜孵育，復(fù)溫洗滌后在室溫下用含辣根過氧化物標(biāo)記的二抗孵育1 h，用化學(xué)發(fā)光試劑盒Thermo進(jìn)行Western成像儀曝光成像。

1.2.4Transwell小室實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞遷移和侵襲能力：遷移實(shí)驗(yàn)：MB-231轉(zhuǎn)染NC和MMP-11-siRNA1后，用PBS和無血清培養(yǎng)基先后洗滌兩次，用無血清培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整密度為1×105ml-1，在下室(24孔板底部)加入600～800 μl含血清的培養(yǎng)基，上室加入200 μl細(xì)胞懸液，放置孵箱培養(yǎng)24 h；用鑷子取出小室，移到4%多聚甲醛室溫固定30 min；移到Giemsa染色液室溫染色10 min；取出小室，輕輕用清水浸泡數(shù)次，用棉簽小心擦拭上室底部內(nèi)側(cè)膜表面上的細(xì)胞；在顯微鏡下取3個隨機(jī)視野照相計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果。侵襲實(shí)驗(yàn)：Matrigel在4℃過夜融化，用4℃預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel(1∶8)，冰上操作；在小室上室底部中央垂直加入100 μl稀釋后的Matrigel，37℃溫育4～5 h使其成為膠凍狀，后續(xù)步驟同遷移實(shí)驗(yàn)(孵箱培養(yǎng)時間延長至40 h)。

1.2.5切片染色結(jié)果判讀選擇背景清晰、陽性定位準(zhǔn)確及無非特異性染色的區(qū)域進(jìn)行判讀，判讀標(biāo)準(zhǔn)如下：①陽性細(xì)胞百分率(≤5%：0分；5%～25%：1分；25%～50%：2分；>50%：3分)；②細(xì)胞染色程度(無：0分；淺黃色：1分；黃褐色：2分；棕黃色：3分)，兩項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)相加：0分為陰性(-)；1～2分為弱陽性(+)；3～4分為中等陽性(++)；5～6分為強(qiáng)陽性(+++)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用GraphPad Prim5軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，兩組間的相關(guān)性采用Pearman相關(guān)系數(shù)分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1MMP-11和MMP-14在乳腺癌組織中的表達(dá)MMP-11和MMP-14在乳腺癌細(xì)胞膜及胞質(zhì)內(nèi)呈強(qiáng)陽性表達(dá)，其陽性表達(dá)率分別為75.8%和92.5%，在正常乳腺組織中呈弱陽性甚至不表達(dá)，在癌組織及正常組織表達(dá)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1)。MMP-11和MMP-14表達(dá)均與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)(P分別為 0.04、 0.00、 0.01和0.00)，在出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度差、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及分期晚的乳腺癌中，MMP-11和MMP-14表達(dá)量較高(表1)。MMP-11和MMP-14兩者在乳腺癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)為0.17，P<0.05，表2)。

2.2轉(zhuǎn)染NC、MMP-11-siRNA1后，MB-231中MMP-11和MMP-14的表達(dá)轉(zhuǎn)染NC、MMP-11-siRNA1后，MMP-11-siRNA1組MB-231中的MMP-11和MMP-14蛋白表達(dá)量比NC組明顯減少(圖2)。

2.3轉(zhuǎn)染NC、MMP-11-siRNA1后，MB-231遷移和侵襲能力的變化通過Transwell小室測定MB-231遷移和侵襲能力。與NC組細(xì)胞相比，MMP-11-siRNA1組的MB-231遷移和侵襲能力明顯下降(P<0.01，圖3、4)。

圖1　MMP-11和MMP-14在人乳腺癌組織中的表達(dá)Fig.1　Expression of MMP-11 and MMP-14 in breast cancer tissuesNote: A.Normal breast tissue;B.High positive of MMP-11;C.High positive of MMP-14;D.Negative control.

表2MMP-11和MMP-14表達(dá)之間的相關(guān)性

Tab.2Correlation of MMP-11 and MMP-14

MMP-11-+n-6612MMP-14+33116149n39122P<0.05

Note：P<0.05 is statistically significant.

圖2　MB-231轉(zhuǎn)染NC、MMP-11-siRNA1后MMP-11和MMP-14蛋白表達(dá)Fig.2　After silence of MMP-11 in MB-231 cell,expression of MMP-11 and MMP-14Note: 1.NC;2.MMP-11-siRNA1.

圖3　轉(zhuǎn)染NC、MMP-11-siRNA1后，MB-231遷移能力Fig.3　After silence of MMP-11 in MB-231 cell,migration of MB-231Note: A.NC;B.MMP-11-siRNA1.

表1MMP-11和MMP-14的表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系

Tab.1Correlation of MMP-11 and MMP-14 protein expression with clinicopathological characteristics in breast cancer

CharacteristicsnMMP-11-++++++χ2PMMP-14-++++++χ2PMenopause8.950.032.090.55Premenopausal78162227135101251Postmenopausal832392922761060Tumorsize6.440.091.840.61≤3cm622111219471140>3cm9918203526891171Lymphnodemetastasis8.590.03518.440.0004Yes91192026262102069No702011309106252Histologicalgrade4.500.219.060.0286Ⅰ6819162310681539Ⅱ/Ⅲ932015332568772TNMstage12.340.00623.580.0001Ⅰ6016519209121029Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ10123263715341282

Note：P<0.05 is statistically significant.

圖4　轉(zhuǎn)染NC、MMP-11-siRNA1后，MB-231侵襲能力Fig.4　After silence of MMP-11 in MB-231 cell,invasion of MB-231Note: A.NC;B.MMP-11-siRNA1.

3討論

目前在人類發(fā)現(xiàn)有23種MMPs(Degradome database;http://degradome.uniovi.es)家族成員，近年來，眾多學(xué)者發(fā)現(xiàn)有多種MMPs成員與腫瘤惡性行為密切相關(guān)，其中較為顯著的為MMP-11和MMP-14，二者在腫瘤發(fā)展中的作用越來越受到廣大學(xué)者重視[3,7]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)：MMP-11不僅在乳腺形態(tài)發(fā)生和分化中扮演重要角色，還通過誘導(dǎo)一系列分子過程而調(diào)控上皮細(xì)胞的生物學(xué)行為[8]。有研究顯示：MMP-11在乳腺癌的表達(dá)與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)和TNM分期有關(guān)，并促進(jìn)三陰性乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[9，10]。MMP-14及其抑制劑在乳腺腫瘤血管生成中起著關(guān)鍵性作用[11]，一篇meta分析顯示：MMP-11和MMP-14在乳腺癌中高表達(dá)與患者不良預(yù)后相關(guān)[12]。

我們研究發(fā)現(xiàn)MMP-11和MMP-14在乳腺癌中呈普遍高表達(dá)，同時與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)及TNM分期相關(guān)，而且在乳腺癌組織中兩者之間存在正相關(guān)。在干擾MMP-11后，乳腺癌細(xì)胞株MB-231的遷移及侵襲明顯降低，同時MMP-14表達(dá)也明顯降低，由此我們認(rèn)為：在乳腺癌細(xì)胞中抑制MMP-11后，MMP-14的表達(dá)亦被抑制，從而大大減弱了乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲；相反，MMP-11自身促進(jìn)乳腺癌遷移侵襲的同時，或許協(xié)同MMP-14促進(jìn)乳腺癌的發(fā)展。而有研究報道顯示：MMP-11作為MMP-14的作用底物被剪切成許多小的片段游離于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，MMP-14對MMP-11進(jìn)行負(fù)向調(diào)控而使其喪失活性[13]。由此我們推測：MMPs家族成員之間也許相互影響而促進(jìn)乳腺癌的生物學(xué)進(jìn)程，而它們之間詳細(xì)的作用機(jī)制有待廣大科研工作者進(jìn)一步揭示。

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[收稿2016-02-22修回2016-04-25]

(編輯張曉舟)

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.07.014

作者簡介：黃紅顏(1990年-)，女，在讀碩士，主要從事乳腺癌發(fā)展機(jī)制的研究，E-mail:huangyrc320@163.com。 通訊作者及指導(dǎo)教師：譚金祥(1976年-)，男，博士，副教授，主要從事乳腺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究，E-mail:tjx1202@163.com。 任國勝(1958年-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事乳腺癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究，E-mail:rgs726@163.com。

中圖分類號R73

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1000-484X(2016)07-0996-04

Matrix metalloproteinases-11 collabrotive matrix metalloproteinases-14 promote development of breast carcinoma

HUANG Hong-Yan,TAN Jin-Xiang,REN Guo-Sheng.

Department of Endocrine and Breast Surgery,Chongqing Key Laboratory of Molecular Oncology and Epigenetics,the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China

[Abstract]Objective:To investigate the expression pattern of MMP-11 and MMP-14 in breast carcinoma,and the effect of MMP-11 on breast carcinoma cell migration and invasion.Methods: MMP-11 and MMP-14 expression were examined in 161 invasive breast carcinoma tissue samples and 10 normal breast tissue samples.siRNA was used to knockout MMP-11 in breast carcinoma cell line MB-231 and Transwells were used to evaluate changes in migration ability and invasion ability.Results: Both MMP-11 and MMP-14 were highly expressed in breast carcinoma samples,122 and 149 samples out of 161,respectively.The expression of both proteins were correlated with lymph node metastasis and TNM staging.After knockout of MMP-11,the expression of both proteins decreased in MB-231 cell line and experiments show that the cell′s migration and invasion abilities were significantly weakened.Conclusion: MMP-11 and MMP-14 could promote invasion and metastasis of breast carcinoma.Knockout of MMP-11 results in the downregulated expression of MMP-14,and the inhibition of breast carcinoma cell′s migration and invasion.They could be potential prognostic markers and treatment targets for of breast carcinoma.

[Key words]Matrix metalloproteinase-11 and 14; Breast carcinoma;Migration;Invasion

①本文受國家自然科學(xué)基金(81102008)資助。

②同時供職于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院分子腫瘤及表觀遺傳學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400016。