于慧玲　麻春杰　韓雪梅　趙鵬偉　趙靈燕

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學,呼和浩特010050)

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小柴胡湯對C6膠質(zhì)瘤抑瘤作用的實驗研究①

于慧玲麻春杰韓雪梅趙鵬偉趙靈燕

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學,呼和浩特010050)

[摘要]目的：探討不同劑量小柴胡湯對體外培養(yǎng)的C6膠質(zhì)瘤細胞的抑瘤作用及其作用機理。方法：將C6膠質(zhì)瘤細胞分別接種于96孔、24孔及6孔培養(yǎng)板中，每種培養(yǎng)板均分為4組：對照組、小柴胡湯低劑量組、中劑量組和高劑量組，待細胞鋪滿培養(yǎng)板底80%～90%，開始加藥，培養(yǎng)24小時后終止培養(yǎng)。采用CCK-8、活體染色、ELISA、免疫細胞化學及流式細胞儀檢測細胞增殖活性、細胞存活率、ESM-1和VEGF的蛋白含量及蛋白陽性表達強度和細胞的早期、晚期凋亡狀況。結(jié)果：CCK-8法檢測顯示小柴胡湯低、中、高劑量組對C6膠質(zhì)瘤細胞的生長均有抑制作用； ELISA和免疫細胞化學法顯示，小柴胡湯低、中、高劑量組均能降低ESM-1和VEGF的蛋白陽性表達強度及蛋白含量水平；流式細胞儀檢測顯示小柴胡湯低、中、高劑量組均能促進細胞凋亡；倒置顯微鏡觀察可見隨劑量增加細胞排列逐漸松散、萎縮，細胞漂浮死亡數(shù)量增多；各種檢測法均顯示隨劑量增加抑制作用增強且具有劑量依賴性，組間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結(jié)論：小柴胡湯對C6膠質(zhì)瘤細胞的生長具有明顯的抑制作用，它可能通過下調(diào)ESM-1和VEGF蛋白水平、促進細胞凋亡，從而發(fā)揮抑瘤作用。

[關(guān)鍵詞]小柴胡湯；C6膠質(zhì)瘤；CCK-8；ESM-1；VEGF；流式細胞儀

小柴胡湯是經(jīng)方中的一個重要方劑，由柴胡、黃芩、人參、半夏、甘草、大棗、生姜7味藥組成，是中醫(yī)和解少陽的代表方，本方配伍嚴謹，已被古今臨床廣泛應(yīng)用[1，2]。近年來小柴胡湯在腫瘤治療方面的應(yīng)用日益引起人們的重視，已有研究證實，小柴胡湯對S180、Lewis等荷瘤鼠的體內(nèi)抑瘤作用明顯且有提高機體免疫力的作用[3，4]，但對C6膠質(zhì)瘤體內(nèi)外抑瘤效果的報道尚少見。本實驗設(shè)計系統(tǒng)的觀察了小柴胡湯對體外培養(yǎng)C6 膠質(zhì)瘤細胞的抑制作用，通過形態(tài)學和免疫學檢測對其作用機制進行深入探討。

1材料與方法

1.1材料C6膠質(zhì)瘤細胞株由吉林大學基礎(chǔ)醫(yī)學院病理解剖學教研室張海英老師饋贈。DMEM培養(yǎng)液、雙抗、0.25%胰酶、96孔培養(yǎng)板、24孔培養(yǎng)板和6孔培養(yǎng)板均為Gibco 公司產(chǎn)品。小牛血清為杭州四季青生物制品有限公司產(chǎn)品。兔抗ESM-1和VEGF抗體購自北京博奧森生物有限公司。SP9710和DAB顯色試劑盒為福州邁新生物技術(shù)有限公司提供。ESM-1和VEGF的酶聯(lián)免疫試劑盒購于南京建成生物有限公司。CCK-8、Annexin-V-PI購于北京同仁堂生物有限公司。小柴胡湯自制配成1 g/ml：柴胡15 g、黃芩10 g、人參10 g、半夏9 g、甘草10 g、大棗6 g、生姜10 g共計7味藥70 g組成，放入三角燒瓶中加300 ml蒸餾水，置于溫度磁力攪拌器上反復水煎至溶液濃縮為70 ml，即配成1 g/ml的小柴胡湯過濾除菌使用。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及實驗分組C6膠質(zhì)瘤細胞在含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，細胞為貼壁生長型細胞。收集細胞或者傳代需要用0.25%胰酶消化2 min，用含血清的營養(yǎng)液終止消化，吹打均勻后1 000 r/min 離心5 min，再用無血清營養(yǎng)液反復洗3次。實驗分為4組：對照組、小柴胡湯低劑量組(10 μg/m1)、小柴胡湯中劑量組(50 μg/m1)和小柴胡湯高劑量組(200 μg/ml)，對照組給予0.01 mol/L PBS 20 μl/孔。

1.2.2CCK-8法檢測C6膠質(zhì)瘤細胞增殖活性在96孔板中接種細胞懸液，貼壁細胞每孔至少需要接種1 000個細胞(100 μl的營養(yǎng)液)，每組6個孔，將培養(yǎng)板放在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱預培養(yǎng)，待細胞鋪滿培養(yǎng)板底80%～90%，按分組加藥，加藥培養(yǎng)24 h后終止培養(yǎng)；向每孔加入10 μl的CCK-8溶液，置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4 h，用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。

1.2.3倒置熒光顯微鏡檢測C6膠質(zhì)瘤細胞的生長狀態(tài)及存活率在24孔板中接種細胞懸液，每孔5×105ml-1，每組6個孔，將培養(yǎng)板放在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱預培養(yǎng)，待細胞鋪滿培養(yǎng)板底80%～90%，按分組加藥，加藥培養(yǎng)24 h后終止培養(yǎng)；用胎盤蘭熒光染色3 min后，在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞的生長狀態(tài)及細胞存活率。

1.2.4ELISA和免疫細胞化學法檢測C6膠質(zhì)瘤細胞ESM-1和VEGF的蛋白含量及蛋白陽性表達強度水平前者是定量檢測，后者通過染色進行定性檢測兼帶半定量。按1.2.3步驟接種培養(yǎng)，待加藥培養(yǎng)24 h終止培養(yǎng)。一部分：0.25%胰酶消化細胞2 min，用含血清的營養(yǎng)液終止消化，吹打均勻后1 000 r/min離心5 min，再用無血清營養(yǎng)液反復洗3次；接種到預先包被環(huán)磷酸腺苷(cAMP)抗體的包被微孔中10 μl，依次加入標準品、HRP標記的檢測抗體100 μl，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60 min，并徹底洗滌(洗板5 次)。用底物TMB顯色， 37℃避光孵育15 min后每孔加入終止液50 μl，15 min 內(nèi)，在450 nm 波長處測定各孔的吸光度(OD 值)，計算樣品蛋白含量水平。另一部分(板底鋪18×18的蓋玻片)：將細胞爬片放于PBS中洗5 min×3次；入1%Triton打孔15 min；嚴格按照SP試劑盒操作步驟進行，按1∶100稀釋滴加ESM-1/VEGF抗體，DAB顯色，蘇木素復染，樹膠封片；采用Motic Images Asvanced 3.2圖像分析軟件檢測樣品蛋白陽性表達強度(灰度值)。

1.2.5細胞凋亡的測定按1.2.3步驟接種培養(yǎng)細胞在6孔板中，待加藥培養(yǎng)24 h終止培養(yǎng)。一部分：0.25%胰酶消化制成單細胞懸液，約≥1×106cells/ml；用PBS洗細胞2次，1 000 r/min離心3 min，棄上清加入Annexin V FITC-PI熒光素標記的抗體制成細胞懸液，室溫下避光培養(yǎng)15 min，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

2結(jié)果

2.1小柴胡湯對C6膠質(zhì)瘤細胞生長狀態(tài)、存活率及細胞增殖活性的影響倒置熒光顯微鏡觀察可見：對照組細胞排列緊密、細胞飽滿，伸展的突起清晰可見；小柴胡湯高劑量組細胞排列明顯松散、細胞萎縮，有大量細胞漂浮死亡；小柴胡湯中劑量組細胞排列松散、還可見細胞形態(tài)，但細胞萎縮明顯，可見較多漂浮細胞；小柴胡湯低劑量組細胞排列松散、部分細胞突起可見，有少量細胞漂浮死亡，見圖1；通過細胞計數(shù)顯示，對照組及小柴胡湯低、中、高劑量組C6細胞存活率依次為99.91%±2.09%、50.68%±2.41%、20.15%±1.24%、5.62%±0.17%。CCK-8檢測細胞增殖活性：對照組、小柴胡湯低、中、高劑量組依次為3.85%±0.46%、3.12%±0.58%、2.06%±0.73%、1.93%±0.67%，可見各劑量組小柴胡湯對C6膠質(zhì)瘤細胞的生長均有抑制作用，其細胞存活率和細胞增殖活性均隨劑量的增加而降低，且具有劑量依賴性，各組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.2小柴胡湯對C6膠質(zhì)瘤細胞ESM-1和VEGF的蛋白含量水平的影響小柴胡湯低、中、高劑量組均能抑制ESM-1和VEGF的蛋白含量水平，且隨劑量增加抑制作用明顯，與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表1。

2.3小柴胡湯對C6膠質(zhì)瘤細胞ESM-1和VEGF的蛋白陽性表達強度的影響C6膠質(zhì)瘤細胞ESM-1和VEGF的免疫組化染色，陽性部位是細胞質(zhì)呈棕黃色，細胞核用蘇木精復染呈藍色。Motic Images Asvanced 3.2圖像分析結(jié)果顯示：小柴胡湯低、中、高劑量組均能降低ESM-1和VEGF的蛋白陽性表達強度，且隨劑量增加作用明顯，與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表1、圖2。

2.4小柴胡湯對C6膠質(zhì)瘤細胞凋亡的影響用綠色熒光FITC標記的 Annexin V 通過流式細胞儀及熒光顯微鏡可以檢測到細胞早期(綠色熒光)、晚期(紅色熒光)凋亡的發(fā)生。小柴胡湯低、中、高劑量組均能促進C6膠質(zhì)瘤細胞凋亡，且隨劑量增加作用明顯，與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表1、圖3、4。

GroupsnProteincontents(pg/ml)ESM-1VEGFProteinpositiveexpressionintensityESM-1VEGFcellapoptosisrate(%)EarlyLateControlgroup62.63±0.722.27±0.68105.48±5.69120.37±6.951.49±0.317.34±0.89Lowdosegroup61.48±0.491)1.01±0.321)130.93±6.071)154.58±8.721)8.45±0.861)23.95±2.661)Middledosegroup60.63±0.111)2)0.39±0.091)2)169.15±8.221)2)178.63±10.191)2)0.51±0.091)2)92.93±3.171)2)Highdosegroup60.59±0.131)2)0.35±0.071)2)173.51±8.761)2)185.34±10.321)2)0.62±0.111)2)97.58±4.421)2)

Note：Compared with control group，1)P<0.01；compared with low dose group，2)P<0.01.

圖1　各組C6膠質(zhì)瘤細胞的生長狀態(tài)(×200)Fig.1　Growth status of C6 glioma cells in each group(×200)

圖2　各組C6膠質(zhì)瘤細胞ESM-1和VEGF的蛋白陽性表達強度(×200)Fig.2　Positive expression of ESM-1 and VEGF protein in C6 cells of each group(×200)

圖3　流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡情況Fig.3　Flow cytometry to detect apoptosis in each groupNote: A.Control group;B.High dose group;C.Medium dose group;D.Low-dose group.

圖4　Annexin-V-PI熒光染色觀察各組細胞的凋亡情況Fig.4　Apoptosis of cells in each group was observed by Annexin-V-PI fluorescence stainingNote: A.Control group;B.High dose group;C.Medium dose group;D.Low-dose group.

3討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后與機體的免疫、細胞周期及細胞凋亡等調(diào)控狀態(tài)密切相關(guān)，腫瘤細胞的生長亦有賴于對其提供營養(yǎng)的ESM-1、VEGF等內(nèi)皮因子，因此新生的血管為腫瘤組織的生長繁殖提供了充足的血氣營養(yǎng)，更為腫瘤細胞的浸潤、轉(zhuǎn)移提供了便捷通道[5]。

小柴胡湯出自《傷寒論》，為中醫(yī)經(jīng)典方劑，它一直被臨床廣泛應(yīng)用，同時也受到了歷代醫(yī)家的推崇，近年來其抗腫瘤作用的研究日益普遍，成為眾多醫(yī)家的研究熱點[6]。本實驗室研究已經(jīng)證實小柴胡湯對體內(nèi)C6膠質(zhì)瘤有抑瘤作用[7，8]，為拓廣小柴胡湯的臨床應(yīng)用，本室進一步對體外培養(yǎng)的C6膠質(zhì)瘤細胞給予低、中、高劑量小柴胡湯，經(jīng)CCK-8檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各劑量組的小柴胡湯均能抑制C6膠質(zhì)瘤細胞增殖活性；活體細胞染色發(fā)現(xiàn)低、中、高劑量小柴胡湯均能抑制細胞存活率及惡化細胞生長狀態(tài)，這從生物化學和形態(tài)學手段證實了小柴胡湯對體外C6膠質(zhì)瘤細胞的抑瘤作用。

血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial grow th factor,VEGF)是重要的血管生成因子之一，它能使血管內(nèi)皮細胞變形、移動、分裂增殖，增加血管通透性促進腫瘤新生血管形成[9，10]。人內(nèi)皮細胞特異分子-1(Endothelial cell specific molecule-1，ESM-1)是一種可溶性的蛋白聚糖，它的表達受細胞因子、血管生長因子、轉(zhuǎn)錄因子等多種因素的復雜調(diào)控[11，12]。廣泛間質(zhì)微血管形成是C6膠質(zhì)瘤呈惡性侵襲性發(fā)展并生長迅速的生物學基礎(chǔ)，它在腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要核心作用，但目前其生成的機制尚不清楚，因此ESM-1、VEGF在腫瘤細胞內(nèi)的蛋白含量及蛋白表達狀況與腫瘤的形成、生長和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[13]。本研究檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)低、中、高劑量小柴胡湯均能降低ESM-1和VEGF的蛋白含量及蛋白表達水平，其機制有待于進一步探討。

細胞凋亡是程序性的細胞死亡，是體內(nèi)外某些因素觸發(fā)細胞內(nèi)預存的死亡程序而導致的細胞主動性(自殺性)死亡方式[14]。以往研究發(fā)現(xiàn)細胞凋亡調(diào)控受阻在腫瘤的發(fā)病過程中也是重要因素[15，16]，它涉及細胞的早期及晚期凋亡調(diào)控，所以能否誘導腫瘤細胞凋亡成為當今藥物治療腫瘤效果的判定標準之一[17]。本實驗研究通過流式細胞儀檢測小柴胡湯對C6膠質(zhì)瘤細胞的早期及晚期凋亡作用，發(fā)現(xiàn)低、中、高劑量小柴胡湯均能促進C6膠質(zhì)瘤細胞凋亡，差異顯著均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，且隨劑量增加作用增強呈劑量依賴性。

綜上所述，小柴胡湯的體外抑瘤實驗表明，低、中、高劑量小柴胡湯通過抑制C6膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)ESM-1和VEGF的蛋白水平，使其含量降低，阻斷了C6膠質(zhì)瘤細胞的血氣營養(yǎng)通路，從而降低細胞增殖活性和誘導細胞早期及晚期凋亡；其中小柴胡湯中、高劑量組作用效果較低劑量組顯著呈劑量依賴性；但其具體的抑瘤途徑還尚需進一步的探討。

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[收稿2015-11-11修回2015-12-21]

(編輯許四平)

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.07.012

作者簡介：于慧玲(1974年-)，女，博士，副教授，主要從事腫瘤病理學研究。

通訊作者及指導教師：麻春杰(1965年-)，女，博士，教授，博士生導師，主要從事中醫(yī)藥防治脾胃、心腦血管病癥的研究。

中圖分類號R733.4

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)07-0988-04

Experimental study of effect of Xiao Chai Hu Tang on C6 glioma

YU Hui-Ling,MA Chun-Jie,HAN Xue-Mei，ZHAO Peng-Wei，ZHAO Ling-Yan.

Inner Mongolia Medical University，Huhhot 010050，China

[Abstract]Objective:To investigate the inhibitory effect and mechanism of different doses of Xiao Chai Hu Tang on C6 glioma cells cultured in vitro.Methods: C6 glioma cells were inoculated in 96 holes,24 holes and 6 holes,each culture plate was divided into 4 groups:control group,low dose group,middle dose group and high dose group,when the cells covered the bottom of culture plate 80%-90%,began adding,cultured for 24 hours after the ter mination of training.Cell proliferation activity,cell viability,protein content and protein positive expression intensity of VEGF and ESM-1,cell apoptosis in early and late stage were detected by CCK-8,in vivo staining,ELISA,immunocytochemistry and flow cytometry.Results: CCK-8 assay showed that the growth of C6 glioma cells was inhibited by low,medium and high dose group; ELISA and immunocytochemistry showed that the expression of VEGF and ESM-1 was lower in the lower,middle and high dose groups,and the levels of protein expression and protein levels were decreased.The flow cytometry showed that the low dose of small radix,middle and high dose group could promote the cell apoptosis.Inverted microscope observation showed that with the increase of dose,the number of cells increased gradually,and the number of dead cells increased,and all kinds of detection methods showed that the inhibition effect increased with dose and dose dependence.The difference between the two groups was statistically significant(P<0.01).Conclusion: The growth of C6 glioma cells was significantly inhibited by Xiao Chai Hu Tang.It may play a role in inhibiting tumor growth by down regulating ESM-1 and VEGF protein level and promoting cell apoptosis.

[Key words]Xiao Chai Hu Tang; C6 glioma; CCK-8; ESM-1; VEGF;Flow cytometry

·中醫(yī)中藥與免疫·

①本文為內(nèi)蒙古自治區(qū)科技計劃項目(kjt14sf14)。