李莉娜　畢志彬　王金勝

(長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室， 長(zhǎng)治046000)

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TNFAIP8與胃癌耐藥關(guān)系的初步研究①

李莉娜畢志彬②王金勝

(長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室， 長(zhǎng)治046000)

[摘要]目的：探討TNFAIP8與胃癌耐藥性的關(guān)系。方法：選取47例進(jìn)行新輔助化療患者手術(shù)前后的標(biāo)本，免疫組化檢測(cè)TNFAIP8蛋白的表達(dá)；Western blot檢測(cè)胃癌細(xì)胞株SGC-7901及其順鉑耐藥細(xì)胞株SGC7901/DDP中TNFAIP8蛋白表達(dá)差異，利用RNA干擾技術(shù)降低順鉑耐藥細(xì)胞株中TNFAIP8的蛋白表達(dá)后，MTT檢測(cè)其對(duì)順鉑的敏感性有無(wú)變化。結(jié)果：TNFAIP8在新輔助化療前后的表達(dá)差異不大，在新輔助化療無(wú)效組中的表達(dá)較有效組高(P<0.05)；SGC7901/DDP細(xì)胞中TNFAIP8蛋白的表達(dá)高于SGC7901細(xì)胞，siRNA-TNFAIP8質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SGC7901/DDP細(xì)胞后蛋白表達(dá)顯著下降，MTT結(jié)果顯示降低TNFAIP8蛋白表達(dá)，細(xì)胞對(duì)順鉑的IC50較SGC7901/DDP顯著下降(P<0.05)，敏感性提高。結(jié)論：TNFAIP8參與了胃癌的化療耐藥性。

[關(guān)鍵詞]胃癌；TNFAIP8；耐藥

腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白8(TNFAIP8)，或稱為SCC-S2、GG2-1、NDED，最先是在比較頭頸部鱗癌細(xì)胞株和其對(duì)應(yīng)的高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株中的差異蛋白里被確認(rèn)的，TNF-α的刺激和NF-κB的活化可誘導(dǎo)其表達(dá)[1]。TNFAIP8通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡來(lái)參與免疫過(guò)程、促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移[2]。由于TNFAIP8具有調(diào)控細(xì)胞凋亡的功能，我們分析其也可能影響腫瘤的臨床治療：放療和化療療效，有研究顯示在食管鱗狀細(xì)胞癌中沉默TNFAIP8的表達(dá)后，可提高腫瘤細(xì)胞對(duì)鉑類藥物的敏感性[3]。有關(guān)TNFAIP8與胃癌化療藥物的耐藥性研究報(bào)道較少，故我們通過(guò)檢測(cè)了胃癌耐藥細(xì)胞株中TNFAIP8的表達(dá)及利用RNA干擾技術(shù)，比較臨床病例對(duì)胃癌新輔助化療不同療效組的TNFAIP8的表達(dá)來(lái)研究TNFAIP8與胃癌耐藥性的關(guān)系。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1一般資料與細(xì)胞系收集2012年1月～2014年12月47例長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院附屬和平及附屬和濟(jì)醫(yī)院病理科確診為進(jìn)展期胃癌患者的術(shù)前胃鏡活檢及術(shù)后標(biāo)本蠟塊?；颊呔m合進(jìn)行術(shù)前新輔助化療。男40例，女7例；年齡41～67歲，平均年齡60歲；高中分化26例，低分化21例；均發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；臨床分期：均為Ⅲ期。患者進(jìn)行奧沙利鉑聯(lián)合氟尿嘧啶(Folfox方案)新輔助化療2～3療程后，根據(jù)化療前后腹部CT增強(qiáng)掃描下瘤體大小及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的大小數(shù)目等分為新輔助化療有效組和新輔助化療無(wú)效組，有效組(術(shù)前化療后完全緩解者2例或部分緩解者19例)21例，無(wú)效組(術(shù)前化療后病情穩(wěn)定者19例和病情進(jìn)展者7例)26例[4]。人胃癌細(xì)胞株SGC7901同順鉑耐藥細(xì)胞株SGC7901/DDP均購(gòu)買于凱基生物公司。

1.1.2主要試劑胎牛血清、RPMI1640、0.25%胰酶均購(gòu)自BI公司，MTT、RIPA購(gòu)自康為世紀(jì)，順鉑購(gòu)自Sigma公司，siRNA-TNFAIP8(序列1:CTGCGTGCGTTTCAGTGTTTAA，序列2:CGGTCTTGATATTGAGATAATA)及其陰性對(duì)照由上海吉?jiǎng)P基因有限公司構(gòu)建合成。Lipofectmaine2000購(gòu)自Invitrogen公司。TNFAIP8(15790-1-AP)、Tublin(10094-1-AP)購(gòu)自Proteintech，免疫組化試劑盒PV-9000、DAB顯色液購(gòu)于北京中杉金橋。

1.2方法

1.2.1免疫組化手術(shù)前后的標(biāo)本蠟塊均進(jìn)行4 μm切片，按照PV-9000試劑盒說(shuō)明書操作，一抗TNFAIP8稀釋濃度1∶100，枸櫞酸高壓修復(fù)3 min，操作過(guò)程中設(shè)立陰、陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果判定[5]：陽(yáng)性表現(xiàn)為細(xì)胞胞漿有著色，淡黃色1分，棕黃色2分，褐色3分；著色的范圍，<25%為1分，>75%為3分，介于兩者之間為2分，染色的強(qiáng)度和著色范圍兩分相加：<3分為弱表達(dá)，≥3為強(qiáng)表達(dá)。同張切片染色不均勻時(shí)，分區(qū)域計(jì)分平均。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)胃癌SGC7901細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，SGC7901/DDP細(xì)胞需培養(yǎng)基另加1 mg/L的順鉑維持耐藥性，均置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，常規(guī)換液、傳代。

1.2.3細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的SGC7901/DDP細(xì)胞種6孔板，第2天觀察匯合度，轉(zhuǎn)染步驟按照l(shuí)ipofectmaine2000說(shuō)明書進(jìn)行，siRNA-TNFAIP8質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒用量各為5 μl，lipofectmaine2000取7 μl，6 h后換液。24 h后觀察轉(zhuǎn)染效果。

1.2.4Western blot檢測(cè)TNFAIP8蛋白的表達(dá)取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的SGC7901及SGC7901/DDP細(xì)胞PBS洗滌后加RIPA冰上裂解約40 min，4℃ 12 000 r/min 離心30 min后取上清液，與5×上樣緩沖液混合變性，12%SDS-PAGE電泳，每孔上樣約10 μl，100 V穩(wěn)定電壓轉(zhuǎn)膜80 min，5%BSA封閉1 h，1∶1 000稀釋TNFAIP8抗體孵育，1∶5 000 Tublin 4℃過(guò)夜，1∶8 000二抗室溫?fù)u床孵育1 h，TBST洗后ECL發(fā)光檢測(cè)，經(jīng)凝膠分析軟件Alphaview SA分析，取TNFAIP8和Tublin表達(dá)條帶的灰度值之比反映TNFAIP8的表達(dá)變化。順鉑耐藥細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后同上方法處理細(xì)胞，提取蛋白，觀察干擾效果。

1.2.5MTT法檢測(cè)順鉑對(duì)耐藥細(xì)胞及轉(zhuǎn)染后細(xì)胞生長(zhǎng)的影響取各組細(xì)胞104個(gè)到96 孔板，每組各重復(fù)5孔，設(shè)立調(diào)零和對(duì)照孔。細(xì)胞貼壁后，加入梯度濃度的順鉑，之后依照MTT操作步驟進(jìn)行，于酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)490 nm處檢測(cè)吸光度(OD)值。計(jì)算抑制率、生存率和IC50值。

2結(jié)果

2.1新輔助化療與胃癌組織中TNFAIP8蛋白的關(guān)系TNFAIP8蛋白主要位于癌細(xì)胞胞漿內(nèi)，術(shù)后切除組織較術(shù)前的胃鏡組織表達(dá)升高，但差異不明顯(χ2=0.69，P=0.41)，且無(wú)論是新輔助化療之前還是之后，化療有效組即對(duì)藥物敏感組中TNFAIP8的表達(dá)明顯低于化療無(wú)效組即對(duì)藥物耐藥組中的表達(dá)(圖1，表1)。

圖1　TNFAIP8蛋白在胃癌組織中的表達(dá)(免疫組化PV-9000，×200)Fig.1　Expression of TNFAIP8 in gastric carcinoma tissues(Immunohistochemistry PV-9000,×200)Note: A.High expression in chemotherapy invalid tissues；B.Low expression in chemotherapy effective tissues.

表1TNFAIP8蛋白的表達(dá)與新輔助化療療效的關(guān)系

Tab.1Relationship between expressions of TNFAIP8 and neoadjuvant chemotherapy effect

NeoadjuvantchemotherapyEffectCasesTNFAIP8expressionlevelHighLowχ2PBeforeValid217144.780.03Invalid26179AfterValid219124.410.04Invalid26197

2.2胃癌耐藥細(xì)胞中TNFAIP8蛋白的表達(dá)兩株細(xì)胞經(jīng)MTT驗(yàn)證順鉑對(duì)其的細(xì)胞毒作用，SGC7901的IC50值為(2.39±0.26)mg/L，SGC7901/DDP 的IC50為(9.39±0.33)mg/L，Western blot結(jié)果顯示胃癌耐藥細(xì)胞株SGC7901/DDP中TNFAIP8蛋白表達(dá)明顯高于其對(duì)照細(xì)胞株SGC7901?；叶戎捣謩e為 0.47±0.33、 0.74±0.35(圖2)。

2.3轉(zhuǎn)染結(jié)果Western blot檢測(cè)顯示在耐藥細(xì)胞組、陰性對(duì)照組及TNFAIP8 siRNA 組的灰度值比分別為0.72±0.45、0.71±0.34、0.30±0.27，siRNA組較耐藥組TNFAIP8蛋白下降明顯(P<0.05)，陰性對(duì)照組和耐藥組比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，表明利用siRNA技術(shù)降低了順鉑耐藥細(xì)胞中的TNFAIP8蛋白的表達(dá)(圖3)。

圖2　WB顯示兩株胃癌細(xì)胞系中TNFAIP8蛋白的表達(dá)Fig.2　Western blot showed expression of TNFAIP8 in SGC7901 cell and SGC7901-DDP cell Note: A.The expression of TNFAIP8 in SGC7901 cell and SGC7901-DPP cell;1.SGC7901 cell;2.SGC7901-DDP cell;B.WB corresponding gray analysis diagram.

圖3　WB顯示轉(zhuǎn)染后TNFAIP8蛋白表達(dá)情況Fig.3　Western blot showed expression of TNFAIP8 after transfection Note: A.The expression of TNFAIP8 after transfection,1.SGC7901-DDP group;2.Control group;3.siRNA group; B.WB corresponding gray analysis diagram.

圖4　siRNA干擾TNFAIP8蛋白表達(dá)后SGC7901-DDP細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性增加Fig.4　Susceptibility of SGC7901-DDP cell to cisplatin increased after siRNA

2.4不同濃度順鉑顯示siRNA-TNFAIP8組對(duì)藥物敏感性增強(qiáng)(圖4)。耐藥細(xì)胞、陰性對(duì)照組及siRNA組對(duì)順鉑的IC50值分別為(9.39±0.33)mg/L、(8.86±0.67)mg/L、(5.77 ±0.36)mg/L，與順鉑耐藥細(xì)胞組比較，siRNA組IC50降低，細(xì)胞生存率顯著下降(P<0.05)。說(shuō)明在SGC7901/DDP細(xì)胞中干擾TNFAIP8的表達(dá)后可提高細(xì)胞對(duì)順鉑的藥物敏感性。

3討論

進(jìn)展期胃癌的預(yù)后不好，其中對(duì)化療藥物耐藥是困擾治療的難題，篩選與耐藥有關(guān)的基因有可能為治療帶來(lái)一定的療效。新輔助化療技術(shù)是根據(jù)患者的臨床分期，術(shù)前選擇化療藥物進(jìn)行治療，經(jīng)過(guò)新輔助化療后一部分患者可降期手術(shù)，效果較好；另外新輔助化療的效果也可對(duì)術(shù)后的藥物化療做一定的療效指導(dǎo)。為此我們選擇了根據(jù)需要術(shù)前進(jìn)行化療即新輔助化療的一些病例來(lái)判斷TNFAIP8是否與化療耐藥有關(guān)。結(jié)果顯示TNFAIP8術(shù)后的表達(dá)較術(shù)前高，但差異不明顯，但其在新輔助化療無(wú)效組即對(duì)化療耐藥組的表達(dá)明顯高于化療有效組即對(duì)藥物敏感組(P<0.05)，提示TNFAIP8有可能參與了胃癌化療耐受。術(shù)前的新輔助化療療效對(duì)術(shù)后的常規(guī)化療藥物選擇有提示作用，故我們認(rèn)為TNFAIP8蛋白的表達(dá)水平也對(duì)化療療效有提示。接下來(lái)我們又驗(yàn)證了在胃癌順鉑耐藥細(xì)胞株中其的表達(dá)明顯高于順鉑敏感細(xì)胞，利用RNA干擾技術(shù)降低耐藥細(xì)胞中其表達(dá)后，對(duì)順鉑的敏感性顯著提高，由此我們判斷TNFAIP8在胃癌的化療耐藥中是起了一定作用的，這和Hadisaputri等[3]在食管癌細(xì)胞中的結(jié)論一樣。Liu等在卵巢上皮癌的臨床病例中也發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的TNFAIP8對(duì)鉑類藥物的治療抵抗[6]。

TNFAIP8是由TNF-α和轉(zhuǎn)錄因子NF-κB誘導(dǎo)，定位于胞漿內(nèi)的蛋白，分子量為21 kD，F(xiàn)LIP家族成員[7]。因其結(jié)構(gòu)上也含有死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域，故能抑制Caspase介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。TNF-α誘導(dǎo)的TNFAIP8表達(dá)可被NF-κB的抑制劑IKB逆轉(zhuǎn)，TNFAIP8的表達(dá)可抑制TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB表達(dá)缺失的細(xì)胞凋亡，但TNFAIP8的相互作用蛋白和信號(hào)通路目前尚不清楚。之前在胃癌、乳腺癌、肺癌中和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[8-10]；Zhang等[11]發(fā)現(xiàn)在多種高侵襲腫瘤細(xì)胞中TNFAIP8的表達(dá)沉默可引起與促進(jìn)血管生長(zhǎng)及侵襲相關(guān)的VEGFR-2、MMP的表達(dá)下調(diào)；TNFAIP8在腫瘤治療中的意義尚不明確，在前列腺癌細(xì)胞中，研究者發(fā)現(xiàn)雄激素可誘導(dǎo)TNFAIP8的表達(dá)，利用裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)沉默TNFAIP8的表達(dá)后可增強(qiáng)放療的敏感性及激素治療效果[12]。

我們結(jié)果顯示TNFAIP8能介導(dǎo)胃癌的耐藥性，其是否影響了耐藥相關(guān)蛋白、其的下游蛋白或信號(hào)通路是否參與對(duì)放療的抵抗還需要繼續(xù)研究。

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[收稿2015-10-11修回2015-11-17]

(編輯倪鵬)

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.07.006

作者簡(jiǎn)介：李莉娜(1981年-)，女，碩士，講師，主要從事消化道腫瘤研究，E-mail:lilina9825@163.com。 通訊作者及指導(dǎo)教師：王金勝(1976年-)，男，博士，教授，主要從事消化道腫瘤研究，E-mail:tigergv@163.com。

中圖分類號(hào)R735.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-484X(2016)07-0962-04

Preliminary research in relationship between TNFAIP8 and gastric cancer drug resistance

LI Li-Na,BI Zhi-Bin,WANG Jin-Sheng.

Department of Pathology,Changzhi Medical College,Changzhi 046000,China

[Abstract]Objective:To explore if there was a correlation between TNFAIP8 and gastric tumor drug resistance.Methods: We collected 47 cases of neoadjuvant chemotherapy,and detected the expression of TNFAIP8 in their tissues before and after surgery by immunohistochemistry.Compared the expression of TNFAIP8 between SGC7901 cell and its cisplatin resistance cell SGC7901-DDP by Western blot,and then we used siRNA technology to decreased its expression,continued to test the susceptibility to cisplatin through MTT.Results: The expression of TNFAIP8 between pre-neoadjuvant and after-neoadjuvant had no difference,but the expression of chemotherapy effectiveness was lower than chemotherapy invalidness(P<0.05);the expression of SGC7901-DDP cell was also higher than SGC7901 cell; the expression of TNFAIP8 decreased apparently through plasmid transfection of SGC7901-DDP cell,MTT test showed the fewer expression of TNFAIP8 could increase the susceptibility to cisplatin(P<0.05).Conclusion: TNFAIP8 was involved in chemotherapy resistance of gastric carcinoma.

[Key words]Gastric carcinoma;TNFAIP8;Drug resistance

①本文為山西省衛(wèi)生計(jì)生委科研課題(2014140)和長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(CX201407)。

②長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院附屬和濟(jì)醫(yī)院普外科，長(zhǎng)治046000。