周旭春　孫曉寧　楊　波　黃白麗　鄧桃枝　何周桃　韓向陽(yáng)　Deming Sun　藍(lán)　程

(海南省人民醫(yī)院消化內(nèi)科,?？?70311)

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PI-IBS小鼠腸黏膜γδT 細(xì)胞表型和功能變化的實(shí)驗(yàn)研究①

周旭春②孫曉寧楊波②黃白麗鄧桃枝何周桃韓向陽(yáng)Deming Sun③藍(lán)程

(海南省人民醫(yī)院消化內(nèi)科,?？?70311)

[摘要]目的：探討PI-IBS小鼠γδT 細(xì)胞的表型和功能及其在PI-IBS發(fā)病中的作用。方法：旋毛蟲感染小鼠,觀察腸道炎癥、腹壁撤退反射(內(nèi)臟高敏感性)和結(jié)腸傳輸時(shí)間(腸道動(dòng)力)。分別在感染后第2周和第8周處死動(dòng)物，取末端回腸和近端結(jié)腸組織，免疫熒光組化，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察腸黏膜γδT 細(xì)胞的分布和數(shù)量變化。收集PI-IBS小鼠腸道淋巴結(jié)和脾臟的淋巴細(xì)胞，單克隆抗體免疫磁珠分選法分離和純化 γδT 細(xì)胞，3HTdR法檢測(cè)其增殖情況，F(xiàn)ACS檢測(cè)其表面分子CD69、CD62L，ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ及IL-17的表達(dá)。結(jié)果：感染后第2周，PI-IBS小鼠腸道炎癥明顯，腸黏膜γδT細(xì)胞數(shù)量明顯增加，明顯增殖和活化，產(chǎn)生IL-17明顯增加(P<0.01)。感染后第8周，PI-IBS小鼠腸道炎癥基本消退，動(dòng)物的腹壁撤退反射和結(jié)腸傳輸試驗(yàn)明顯異常。腸黏膜γδT細(xì)胞數(shù)量仍然明顯高于對(duì)照組小鼠，仍然有明顯增殖、活化和產(chǎn)生IL-17(P<0.01)。結(jié)論：腸道γδT細(xì)胞增殖、活化及分泌IL-17可能參與PI-IBS的發(fā)病。

[關(guān)鍵詞]感染后腸易激綜合征；γδT細(xì)胞；炎癥；表型；功能

感染后腸易激綜合征(Post-infectious irritable bowel syndrome，PI-IBS)的發(fā)病可能與感染和炎癥誘導(dǎo)的腸道免疫紊亂有關(guān)，但其具體機(jī)制并不完全清楚[1-3]。γδT細(xì)胞是一類表型和功能獨(dú)特的T淋巴細(xì)胞亞群，占全身T細(xì)胞總數(shù)的0.5%～5%。作為連接天然免疫和固有免疫的橋梁,γδT細(xì)胞決定機(jī)體特異性免疫應(yīng)答的類型，對(duì)維持黏膜免疫穩(wěn)態(tài)具有重要作用[4,5]。目前關(guān)于γδT細(xì)胞在PI-IBS中的作用報(bào)道不多，本研究擬探討PI-IBS時(shí)γδT細(xì)胞的表型和功能變化，為深入研究PI-IBS的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料無(wú)病原環(huán)境出生的雌性C57BL/6(B6)小鼠(4～6周齡，體重13～15 g)購(gòu)自中科院昆明動(dòng)物所。旋毛蟲購(gòu)自蘭州獸醫(yī)研究所。重組小鼠 IL-2、IL-23購(gòu)自美國(guó)R&D公司。旋毛蟲ES抗原購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。所有抗體均來(lái)自美國(guó)BD Bioscience公司?？剐∈骉CR-δ單克隆抗體(GL3)由美國(guó)科羅拉多大學(xué)免疫系Willi Born博士惠贈(zèng)。DU530分光光度計(jì)為美國(guó)Beckman公司產(chǎn)品，流式細(xì)胞儀(FACS)為美國(guó)BD Bioscience公司產(chǎn)品,磁性細(xì)胞分選儀(MACS)為德國(guó)Miltenyi Biotec公司產(chǎn)品。共聚焦激光掃描熒光顯微鏡為日本Nikon公司產(chǎn)品。小鼠細(xì)胞因子ELISA試劑盒為美國(guó)R&D公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1PI-IBS小鼠模型的建立

1.2.1.1旋毛蟲感染采用旋毛蟲感染法[6,7]制作PI-IBS小鼠模型。旋毛蟲包囊感染60 d的Sprague-Dawley大鼠以胃蛋白酶人工消化法分離肌幼蟲，懸于2%瓊脂中。每只小鼠飼服0.2 ml含300個(gè)幼蟲的瓊脂。造模成功的標(biāo)準(zhǔn)：感染后第8周，小鼠腸道組織無(wú)明顯炎癥，但腹壁撤退反射(Abdominal withdrawal reflex,AWR)評(píng)分明顯高于對(duì)照組，結(jié)腸傳輸功能實(shí)驗(yàn)(Colon transportation test,CTT)明顯異常，表現(xiàn)為首次排便時(shí)間縮短，糞便Bristol評(píng)分增加。

1.2.1.2組織病理在旋毛蟲感染后的第2周和第8周處死部分動(dòng)物，取末端回腸組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，顯微鏡下觀察各段腸黏膜組織炎癥情況。

1.2.1.3內(nèi)臟高敏感性采用AWR評(píng)分觀測(cè)小鼠內(nèi)臟高敏感性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前24 h禁食不禁水，2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，帶氣囊的導(dǎo)尿管經(jīng)肛門插入，以容量0.35/0.5 ml×15 min擴(kuò)張3次,每次間隔30 s。AWR評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為0、1、2、3、4分：結(jié)直腸擴(kuò)張刺激時(shí)情緒基本穩(wěn)定0分；刺激時(shí)不穩(wěn)定,偶爾扭動(dòng)頭部1分；腹背部肌肉輕微收縮但腹部未抬離地面2分；腹背部肌肉較強(qiáng)烈收縮并把腹部抬離地面3分；腹部肌肉強(qiáng)烈收縮,腹部呈弓形并把腹部﹑會(huì)陰部抬離地面4分[8]。

1.2.1.4腸道動(dòng)力采用CTT檢測(cè)小鼠腸道動(dòng)力改變。活性炭懸液推進(jìn)試驗(yàn)：每只小鼠予0.4 ml活性炭懸液灌胃后開始記錄首次排黑便時(shí)間，連續(xù)采集8 h，記錄每只小鼠的糞便總粒數(shù)、總濕重并進(jìn)行Bristol評(píng)分[9,10]。

1.2.2腸道黏膜γδT細(xì)胞觀察第2周及第8周處死部分動(dòng)物，取末端回腸組織，腸組織超薄冰凍切片，免疫熒光組化染色(直接法)，抗體為異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的大鼠抗小鼠γδTCR抗體(GL3克隆)。激光掃描共聚焦顯微鏡觀察腸黏膜γδT 細(xì)胞的分布和數(shù)量變化。

1.2.3總T細(xì)胞的制備和γδT細(xì)胞的分離純化采用筆者先前報(bào)道的方法[11]。取小鼠脾臟和腸系膜淋巴結(jié)研磨后，過尼龍毛柱，去除混雜的B細(xì)胞，F(xiàn)icoll不連續(xù)梯度離心獲得總T細(xì)胞群，完全培養(yǎng)基及IL-2、IL-23繼續(xù)培養(yǎng)72 h?？俆細(xì)胞用FITC-抗δTCR單克隆抗體染色(每1×108細(xì)胞加100 μl抗體，4℃孵育30 min)，加帶有微小磁珠的抗FITC單克隆抗體孵育(每1×108細(xì)胞加100 μl抗體，4℃孵育30 min)，MACS分選收集陽(yáng)性細(xì)胞。

1.2.5γδT 細(xì)胞表面活化分子鑒定γδT 細(xì)胞分別加入IL-23和TLR-4配體10 pg/ml,37℃ 5%CO2孵育1 h，再以PE交聯(lián)的抗CD62L及抗CD69抗體單染，每1×108細(xì)胞加100 μl抗體，4℃孵育30 min，流式細(xì)胞儀分析。

1.2.6細(xì)胞因子表達(dá)γδT 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的IL-17和IFN-γ濃度用相應(yīng)的小鼠IL-17、IFN-γ ELISA試劑盒測(cè)定，按說明書操作。

2結(jié)果

2.1成功建立PI-IBS模型

2.1.1腸道病理腸組織HE染色病理切片顯示，見圖1。與對(duì)照組相比，PI-IBS小鼠的末段結(jié)腸從第2周起出現(xiàn)明顯的炎癥，表現(xiàn)為大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和間質(zhì)充血水腫，炎癥于第8周時(shí)基本消退(放大倍數(shù)×200)。

2.1.2內(nèi)臟高敏感性感染后第8周時(shí)PI-IBS小鼠結(jié)腸充氣擴(kuò)張的AWR評(píng)分顯示(圖2)，在擴(kuò)張氣量為0.35～0.5 ml時(shí)，PI-IBS小鼠的AWR評(píng)分明顯高于對(duì)照組(P< 0.01)。

2.1.3腸道動(dòng)力改變與對(duì)照組相比，感染后第8周時(shí)PI-IBS小鼠的結(jié)腸傳輸時(shí)間(首次排便時(shí)間)明顯縮短，糞便Bristol評(píng)分則明顯增加(P< 0.01),見表1。

2.2腸道黏膜γδT 細(xì)胞數(shù)量及分布末段回腸和結(jié)腸黏膜γδT細(xì)胞主要位于上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞中。與對(duì)照組比較，PI+IBS組第2周時(shí)γδT細(xì)胞明顯增加，第8周時(shí)γδT細(xì)胞數(shù)量有所下降，但仍明顯高于對(duì)照組(圖3)。陰性對(duì)照組在免疫熒光染色時(shí)只加生理鹽水而未加FITC標(biāo)記的大鼠抗小鼠γδTCR抗體。

2.3γδT 細(xì)胞分離純化經(jīng)過兩步法分離純化的γδT細(xì)胞純度可達(dá)99%以上。

2.4γδT 細(xì)胞活性

2.4.1γδT 細(xì)胞分泌細(xì)胞因子在IL-23和TLR4的刺激下，活化的PI-IBS小鼠腸道γδT 細(xì)胞主要分泌IL-17而不是IFN-γ(P<0.01)。第2周和第8周均明顯高于對(duì)照組，第2周和第8周無(wú)明顯差異(圖5)。

2.4.2γδT 細(xì)胞活化感染后第2周分離純化得到的PI-IBS小鼠腸道γδT細(xì)胞在IL-2+IL-23的刺激下，CD62L的表達(dá)明顯降低而CD69的表達(dá)明顯升高，而感染后第8周腸道γδT細(xì)胞仍然存在明顯的活化，第2周和第8周無(wú)明顯差異(圖6)。

圖1　PI-IBS小鼠腸道組織病理變化Fig.1　Pathological changes of intestine in PI-IBS mouseNote: In PI-IBS mouse,significant neutrophil granulocytes infiltration and interstitial edema were observed in the terminal ileum from 2nd week,abated from 8th week.

表1PI-IBS小鼠腸道動(dòng)力變化

Tab.1Changes of intestine mobility in PI-IBS mouse

GroupsIntestinetransportationtime(minute)BristolscoreControl(n=13)109.85±9.811.02±0.19PI-IBS(n=13)87.68±9.321)2.08±0.301)

Note：Compared with the control group,1)P<0.01.

圖2　PI-IBs小鼠內(nèi)臟高敏感性變化Fig.2　Changes of visceral hypersensitivity in PI-IBs mouseNote: Compared with the control group,*.P<0.01.

2.4.3γδT 細(xì)胞增殖反應(yīng)感染后第2周PI-IBS小鼠的腸道γδT細(xì)胞體外增殖反應(yīng)的cpm值明顯高于對(duì)照組，P< 0.01。感染后第8周，PI-IBS小鼠的腸道γδT細(xì)胞體外增殖反應(yīng)仍明顯高于對(duì)照組，第2周和第8周無(wú)明顯差異。

圖4　PI-IBS小鼠γδT細(xì)胞分離純化結(jié)果Fig.4　Isolation and purification of γδT cell′s from PI-IBS mouseNote: The γδT cell′s purity was upto more than 99%.

圖5　PI-IBS小鼠γδT細(xì)胞分泌細(xì)胞因子變化Fig.5　Production of cytokines by γδT cells from PI-IBS mouseNote: Compared with the control group,*.P<0.01；compared with the PI-IBS1 group，**.P>0.05.

圖6　PI-IBS小鼠γδT細(xì)胞增殖反應(yīng)Fig.6　Proliferation of γδT cells from PI-IBS mouseNote: Compared with the control group,*.P<0.01.

3討論

IBS是由胃腸動(dòng)力異常、內(nèi)臟敏感性增高、局部炎癥免疫反應(yīng)、心理社會(huì)因素等多種因素共同作用的結(jié)果。感染后腸道低度炎癥和持續(xù)免疫激活機(jī)制可能是IBS的重要發(fā)病機(jī)制。γδT細(xì)胞在腸道可占全部T細(xì)胞的50%，提示其在腸道炎癥和免疫的生理、病理過程中具有重要作用。關(guān)于γδT細(xì)胞在IBS中的作用的實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道較少。Remes-Troche等[12]報(bào)道腹瀉型IBS患者十二指腸黏膜上皮間γδT細(xì)胞數(shù)量不像乳糜瀉和小腸細(xì)菌過生長(zhǎng)患者那樣明顯增加，但未對(duì)其功能作進(jìn)一步研究，這可能與γδT細(xì)胞分離純化和培養(yǎng)困難有關(guān)。

旋毛蟲抗原按照其來(lái)源部位的不同,即根據(jù)旋毛蟲解剖部位,將其分為表面抗原(SA)、排泄分泌抗原(ES抗原)和蟲體可溶性抗原(BSA)。目前研究較多的主要有蟲體可溶性抗原和排泄分泌抗原。由于旋毛蟲肌幼蟲較成蟲和新生幼蟲容易獲得,所以研究最多的是肌幼蟲抗原。旋毛蟲感染過程中肌幼蟲ES抗原直接暴露于宿主的免疫系統(tǒng),是誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫反應(yīng)的主要靶抗原[13,14]。因此，在體外實(shí)驗(yàn)中，我們使用旋毛蟲ES抗原來(lái)刺激γδT細(xì)胞的增殖。

未經(jīng)旋毛蟲感染的小鼠的腸系膜淋巴結(jié)和脾臟中的γδT細(xì)胞數(shù)量較少，其原因可能是γδT細(xì)胞需要炎癥免疫刺激以增殖活化。旋毛蟲感染后第2周，小鼠腸黏膜γδT細(xì)胞數(shù)量明顯增加，同時(shí)腸道出現(xiàn)明顯炎癥。旋毛蟲感染后第8周，小鼠腸道炎癥基本消退，此時(shí)腸粘膜γδT細(xì)胞數(shù)量雖較第2周時(shí)有所減少，但仍明顯高于未感染小鼠。PI-IBS時(shí)腸道γδT細(xì)胞數(shù)量增加這一現(xiàn)象是PI-IBS時(shí)腸道免疫紊亂的原因或結(jié)果還不清楚，可能二者互為因果，共同促進(jìn)IBS的發(fā)生發(fā)展。

另一方面，細(xì)胞數(shù)量的增加并不一定意味著其功能的變化。筆者以前的研究建立了小鼠γδT細(xì)胞分離純化和培養(yǎng)方法[15]，通過分離和純化，我們獲得了純度達(dá)到99%以上的γδT細(xì)胞，這有助于在體外進(jìn)一步研究其功能。體外實(shí)驗(yàn)顯示，PI-IBS小鼠的γδT細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)，這可以解釋其腸黏膜局部γδT細(xì)胞數(shù)量的增加。分離純化的γδT細(xì)胞在IL-23、TLR配體的刺激下，CD62L下調(diào)而CD69上調(diào)，提示明顯活化。細(xì)胞因子分泌實(shí)驗(yàn)顯示，活化的γδT細(xì)胞產(chǎn)生IL-17的能力明顯提高。IL-17是γδT細(xì)胞合成和分泌的主要細(xì)胞因子，在炎癥和免疫反應(yīng)中起重要的調(diào)控作用[16,17]。從時(shí)間關(guān)系上看，PI-IBS小鼠感染旋毛蟲后第2周和第8周時(shí)，γδT細(xì)胞均處于功能活躍狀態(tài)。這提示在感染初期，γδT細(xì)胞的表型和功能變化可能是促進(jìn)炎癥進(jìn)展的因素，而在炎癥消退期，其表型和功能變化可能并非腸道炎癥的直接結(jié)果而是維持低度炎癥以至內(nèi)臟高敏感性和腸道動(dòng)力異常的因素。

然而，關(guān)于γδT細(xì)胞在各種炎癥和免疫性疾病中的作用仍存在爭(zhēng)議，很可能γδT細(xì)胞在不同病理狀態(tài)下扮演著不同的角色，或者同時(shí)扮演著雙面角色，這體現(xiàn)了免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性[18-21]。其次，γδT細(xì)胞是通過什么具體途徑和機(jī)制在PI-IBS發(fā)生發(fā)展中起作用還不得而知，這些都有待進(jìn)一步研究。

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[收稿2015-10-05修回2015-10-22]

(編輯倪鵬)

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.07.005

作者簡(jiǎn)介：周旭春(1967年-)，女，博士，副教授，副主任醫(yī)師，主要從事胰腺和胃腸免疫性疾病研究。

通訊作者及指導(dǎo)教師：藍(lán)程(1971年-)，男，博士，科副主任，教授，主任醫(yī)師，主要從事胃腸道黏膜免疫方面研究。

中圖分類號(hào)R392.12

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-484X(2016)07-0957-05

Study on phenotype and function of intestinal gamma delta T lymphocytes in mice with post-infectious irritable bowel syndrome

ZHOU Xu-Chun,SUN Xiao-Ning,YANG Bo,HUANG Bai-Li,DENG Tao-Zhi,HE Zhou-Tao,HAN Xiang-Yang,Deming Sun,LAN Cheng.

Department of Gastroenterology,Hainan Provincial General Hospital,Haikou 570311,China

[Abstract]Objective:To investigate the phenotype and function of the intestinal γδT lymphocytes in post-infectious irritable bowel syndrome mouse model.Methods: The mouse model for post-infectious irritable bowel syndrome was established by the infection with trichinella spiralis.The intestinal inflammation,abdominal withdrawal reflex(AWR) and colon transportation test were observed.2 and 8 weeks later,the animals were sacrificed and the lymphocytes in the intestinal lymph nodes and spleen were collected,from which the γδT lymphocytes were isolated and purified by monoclonal antibody-immuno-microbeads method.The functions of the purified γδT lymphocytes were evaluated,including proliferation by3HTdR；CD69，CD62L molecule staining by flow cytometry.Furthermore,the concentration of cytokine IL-17 and IFN-γ in the supernatant of the cultured γδT lymphocytes were detected by ELISA.Results: At 2nd weeks after infection,significant intestinal inflammation was observed,with increasing γδT lymphocytes,proliferating and activating with increasing production of IL-17.At 8th weeks after infection,the intestinal inflammation disappeared,whereas the number of γδT lymphocytes remained increasing,also with proliferating and activating with increasing production of IL-17.Meanwhile,the mice show higher AWR score and Bristol score.Conclusion: γδT lymphocytes could participate in the pathogenesis of PI-IBS via their proliferation,activation and production of IL-17.

[Key words]Post-infectious irritable bowel syndrome;γδT cells;Inflammation;Phenotype;Function

①本文為國(guó)家自然科學(xué)基金(No.81160057)和海南省國(guó)際科技合作專項(xiàng)基金(No.KJHZ2013-14)。

②重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，重慶400016。

③Doheny Eye Institute,University of California,Los Angeles,CA90033,USA。