余秀英　黎友倫　巫鳳蘋　陳亞娟

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸科，重慶400016)

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PLTP在香煙誘導(dǎo)HBECs合成IL-8中的作用①

余秀英黎友倫巫鳳蘋陳亞娟

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸科，重慶400016)

[摘要]目的：研究磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(PLTP)對(duì)香煙誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞(HBECs)合成白介素8(IL- 8)的影響。方法：Wistar大鼠連續(xù)3 d被動(dòng)吸煙，收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)，蘇木精-伊紅(HE)染色，免疫組織化學(xué)法(IHC)檢測(cè)蛋白表達(dá)；體外培養(yǎng)HBECs，不同濃度煙草提取物(CSE)刺激；PLTP siRNA干擾后，進(jìn)行CSE刺激。MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，同時(shí)檢測(cè)IL-8含量及PLTP表達(dá)。結(jié)果：煙熏組BALF白細(xì)胞計(jì)數(shù)以及分類計(jì)數(shù)較對(duì)照組均明顯升高(P<0.01)，IHC顯示煙熏組PLTP和IL-8蛋白表達(dá)高于對(duì)照組；高濃度CSE(2%、4%)抑制HBECs增殖(P<0.001)；不同濃度的CSE作用24 h后，IL-8 mRNA及蛋白表達(dá)量增加,而PLTP蛋白表達(dá)量下降，并且IL-8蛋白分泌呈現(xiàn)時(shí)間依賴性；PLTP siRNA處理后，IL-8表達(dá)量明顯升高(P<0.001)。結(jié)論：PLTP基因缺失促進(jìn)香煙誘導(dǎo)HBECs合成IL-8。

[關(guān)鍵詞]煙草煙霧提取物; 人支氣管上皮細(xì)胞; 磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白; 白介素8

吸煙可以導(dǎo)致正常肺及氣道結(jié)構(gòu)的破壞，引起肺部嚴(yán)重疾患，如肺損傷、慢性阻塞性肺病、肺癌等。氣道上皮作為抵御煙草煙霧的第一道屏障，香煙中的固有成分及在燃燒所產(chǎn)生的有毒物質(zhì)可以致其嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)[1]。Aggarwal等[2]研究證實(shí),中性粒細(xì)胞激活在肺損傷的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵性的作用。而中性粒細(xì)胞趨化因子IL-8可以趨化和激活中性粒細(xì)胞[3]。研究表明，肺上皮細(xì)胞是IL-8的重要來源[4]。

磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Phospholipid transfer protein，PLTP)廣泛表達(dá)于人和動(dòng)物的血漿和組織中，主要促進(jìn)血漿脂蛋白，脂蛋白與細(xì)胞間脂質(zhì)及相關(guān)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)與交換。近年來PLTP逐漸成為非特異性免疫反應(yīng)領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)[5-7]。文獻(xiàn)報(bào)道，正常人類和鼠的肺組織是PLTP mRNA表達(dá)最為豐富的器官[8]，Brehm等[9]研究發(fā)現(xiàn)吸煙可以上調(diào)肺組織PLTP的表達(dá)活性，我們的前期研究證實(shí)[10]，煙草提取物可以刺激大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞和A549細(xì)胞合成PLTP。因此，本文利用支氣管上皮細(xì)胞，借此研究煙草刺激支氣管上皮細(xì)胞合成PLTP蛋白的影響以及特異性基因敲除的方法研究PLTP在香煙煙霧誘導(dǎo)HBE細(xì)胞合成白介素8(interleukin-8，IL- 8)中的作用，以進(jìn)一步探討PLTP參與香煙煙霧所致肺損傷的發(fā)病機(jī)制。

1材料與方法

1.1藥物、試劑和儀器高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)于Thermo公司，SDS-PAGE 凝膠配置試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；IL-8、PLTP抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam公司，GAPDH抗體以及辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購(gòu)于Santa公司；IL-8 ELISA KIT購(gòu)自博士德公司；RNAiso Plus試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Supermix均購(gòu)自TaKaRa公司，PLTP siRNA(sense：5′-GAGCUGCAACUGAC-AUCUUTT-3′；antisense:5′-AAGAUGUCAGUUGCA-GCUCTG-3′)購(gòu)自吉瑪基因，引物：PLTP (5′- TCTGCCCTGTCCTCTACCAC-3′;5′-GGCTCCAGTTCCT-CTCAGTC-3′),IL-8(5′-TTCAGAGACAGCAGAG-CACA-3′;5′-AGCACTCCTTGGCAAAACTG-3′)購(gòu)于上海生物工程公司，其余均為國(guó)產(chǎn)試劑。宏升牌香煙購(gòu)自重慶煙草公司，每只煙含焦油11 mg，一氧化碳17 mg，尼古丁1.1 mg。CO2恒溫培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo Scientific公司；超低溫冰箱，美國(guó)Revco公司；高速臺(tái)式離心機(jī)，美國(guó)Sigma公司；純水儀，美國(guó)Milipore公司；M450酶標(biāo)儀，實(shí)時(shí)定量PCR儀，美國(guó)Bio-Rad公司； PAC3000型電泳儀、電轉(zhuǎn)儀，北京六一公司。

1.2方法

1.2.1Wistar大鼠吸煙模型的建立以及BALF白細(xì)胞計(jì)數(shù)和肺組織切片HE染色及ICH法檢測(cè)PLTP、IL-8的表達(dá)20只清潔級(jí)雄性Wistar大鼠，體重(180±10)g，購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。將20只Wistar大鼠隨機(jī)分為2組：正常對(duì)照組和煙熏組。將兩組大鼠分別放入相同大小特制的煙熏箱中，正常對(duì)照組暴露于空氣中，而煙熏組則進(jìn)行被動(dòng)吸煙，6次/d，每次持續(xù)燃燒香煙(2支/3支循環(huán)進(jìn)行)60 min，每次之間間隔至少15 min，共3 d[11]。

最后一次香煙暴露18 h后處理各組Wistar大鼠。各組大鼠采用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈放血處死大鼠，結(jié)扎左側(cè)肺門，分離出頸部氣管，采用外徑約1.8 mm的靜脈導(dǎo)管進(jìn)行氣管插管，然后注入預(yù)熱生理鹽水(37℃)3 ml,輕輕按摩右肺組織并上下顛倒大鼠后，緩慢回抽灌洗液，然后再將所得液體緩慢注回肺內(nèi)并重復(fù)4次，保證回收率75%以上。BALF加入同體積的70%乙醇，交于實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行白細(xì)胞人工計(jì)數(shù)和分類計(jì)數(shù)。留取左側(cè)肺組織，10%甲醛液固定，石蠟包埋，4 μm切片，HE染色后，光學(xué)顯微鏡觀察進(jìn)行病理學(xué)分析。采用SP法進(jìn)行IHC法檢測(cè)肺組織PLTP和IL-8的表達(dá)。

1.2.2細(xì)胞株來源、培養(yǎng)以及煙草煙霧提取物的制備人支氣管上皮細(xì)胞(Human bronchial epithelial cells,HBECs)源自重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)院實(shí)驗(yàn)室，用含10%胎牛血清的高糖DMEM完全培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2及飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，每 2～3 d傳代1次，所有實(shí)驗(yàn)均在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行。

煙草煙霧提取物制備操作步驟如下所述：點(diǎn)燃香煙，去除濾嘴，安放在抽吸裝置上。勻速地抽吸，使煙霧通過一個(gè)裝有10 ml無血清的DMEM培養(yǎng)基的玻璃瓶，此時(shí)可見煙草煙霧通過DMEM培養(yǎng)基并產(chǎn)生大小均勻的氣泡，收集瓶中出現(xiàn)大量煙霧，且保證每支香煙燃燒約4 min。當(dāng)10支香煙燃燒產(chǎn)生的煙霧通過該培養(yǎng)基后，停止抽吸。調(diào)節(jié)香煙煙霧-DMEM培養(yǎng)基混合物的pH至7.4，并用0.22 μm的過濾器除去雜質(zhì)和細(xì)菌，即為煙草煙霧提取物。使用Beckman DU 640 分光計(jì)(Fullerton,CA,USA)測(cè)定煙草煙霧提取物在320nm處的吸光度值，約為1.36±0.12，將此時(shí)對(duì)應(yīng)的CSE濃度設(shè)為100%。實(shí)驗(yàn)時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要將100%煙草煙霧提取物稀釋至所需濃度即可[10]。

1.2.3MTT法檢測(cè)CSE對(duì)HBE細(xì)胞增殖的影響將約2×103/0.2 ml細(xì)胞種植在96孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h，然后加入相應(yīng)濃度的CSE繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，吸盡孔板內(nèi)的培養(yǎng)液，用PBS清洗兩次后再在每孔加入20 μl 5 mg/ml的MTT和100 μl培養(yǎng)液混勻，在37℃、5%CO2培養(yǎng)4 h，吸干每孔內(nèi)的上清，每孔加入DMSO 150 μl震蕩使沉淀充分溶解，酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值。

1.2.4實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)IL-8 mRNA的表達(dá)取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人支氣管上皮細(xì)胞HBE以2×105ml-1的密度接種于6孔板中，分別設(shè)置對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，常規(guī)培養(yǎng)24 h后實(shí)驗(yàn)組分別加入終濃度為0.25%、0.5%、1%CSE處理24 h后收集細(xì)胞采用Trizol法分別提取各細(xì)胞內(nèi)的總RNA，經(jīng)核酸濃度測(cè)定儀(Fullerton,CA,USA)測(cè)定RNA的濃度，并且樣品A260/280比值均介于1.8～2.0。使用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒采用兩步法將樣品逆轉(zhuǎn)為cDNA，然后在PCR儀(Bio-Rad,USA)上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定IL-8 mRNA的表達(dá)量。

1.2.5蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)PLTP、GAPDH蛋白的表達(dá)取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人支氣管上皮細(xì)胞HBE以2×105ml-1的密度接種于6孔板中，分別設(shè)置對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，常規(guī)培養(yǎng)24 h后實(shí)驗(yàn)組分別加入終濃度為0.25%、0.5%、1%CSE處理24 h，收集上清液，然后將其置于離心機(jī)中4℃，3 000 r/min離心15 min后收集上層液體于-80℃冰箱中保存。收集細(xì)胞提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白含量。運(yùn)用酶標(biāo)儀測(cè)定各組蛋白質(zhì)含量并配平，使各組蛋白終濃度一致。每個(gè)點(diǎn)樣孔加樣60 μg蛋白樣品液，電泳、轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂牛奶封閉2 h，采用兔抗人PLTP (1∶3 000),兔抗人內(nèi)參GAPDH多抗(1∶1 000),4℃孵育過夜。用TBST溶液漂洗3次，每次10 min。加入二抗(1∶1 000)常溫孵育2 h。TBST溶液漂洗,用ECL試劑發(fā)光，曝光。圖像掃描后運(yùn)用圖像分析軟件Quantity One分析條帶的吸光度值，將對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的目的條帶的灰度值和內(nèi)參的吸光度值比值表示蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.6酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA)測(cè)定IL-8相對(duì)含量將收集的上清液稀釋十倍之后按每孔100 μl加入事先準(zhǔn)備好的ELISA試劑盒孔板中37℃孵育90 min，棄液后每孔加入生物素抗人IL-8抗體工作液100 μl 37℃反應(yīng)60 min，用PBS洗滌3次后每孔加入ABC工作液100 μl 37℃反應(yīng)30 min，再次用PBS洗滌5次后每孔按90 μl依次加入TMB顯色液，37℃避光反應(yīng)30 min后每孔加入100 μl TMB終止液。用酶標(biāo)儀在450 nm測(cè)定OD值。根據(jù)所測(cè)OD值作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后計(jì)算IL-8蛋白表達(dá)量。

1.2.7陽離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染siRNA取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人支氣管上皮細(xì)胞HBE以2×105ml-1的密度接種于6孔板中，分別設(shè)置陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組常規(guī)培養(yǎng)16～24 h，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)50%左右時(shí)，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染；DEPC消毒的去酶EP管中加入250 μl Opti-MEM培養(yǎng)液及5 μl RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑，混勻，室溫孵育5 min，另取DEPC消毒的去酶EP管加入250 μl Opti-MEM培養(yǎng)液及60 pmol的siRNA,混勻; 5 min之后將RNAiMAX混合試劑和siRNA混合試劑混合，混勻，室溫靜置20 min后按照分組加入事先用PBS清洗過的孔板中，再加入不含胎牛血清的培養(yǎng)基，總體積為2 ml；37℃孵育6 h后，吸取培養(yǎng)基，加入完全培養(yǎng)基孵育18～24 h后，再將HBE細(xì)胞設(shè)置為NC siRNA處理組、CSE+NC siRNA處理組、siPLTP處理組、CSE+siPLTP處理組處理24 h之后收取上清液用ELISA法測(cè)定IL-8相對(duì)含量，提取各組細(xì)胞RNA以及總蛋白，分別用RT-PCR測(cè)定PLTP、IL-8 mRNA的表達(dá)情況以及用Western blot檢測(cè)PLTP蛋白的表達(dá)量。

2結(jié)果

2.1香煙暴露后大鼠肺組織組織學(xué)觀察、IHC分析以及BALF白細(xì)胞計(jì)數(shù)情況如圖1A所示，3 d香煙暴露之后煙熏組肺組織充血水腫；如圖1B所示，HE染色顯示正常肺組織肺泡結(jié)構(gòu)完整正常，無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，煙熏組血管腔充血，肺間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔擴(kuò)大斷裂，肺泡融合；IHC結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，煙熏組肺上皮細(xì)胞PLTP(如圖1C所示)和IL-8(如圖1D所示)表達(dá)升高；如圖E所示，BALF中，煙熏組白細(xì)胞總數(shù)顯著高于對(duì)照組，并且中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞均顯著高于對(duì)照組。

圖1　香煙導(dǎo)致大鼠肺損傷Fig.1　Cigarette smoke caused lung injury in ratsNote: A.Lung was photographed to detect changes; B.HE staining was performed to detect pathological changes(HE,×400);C.Expression of PLTP was detected by IHC(IHC,×400);D.Expression of IL-8 was detected by IHC(IHC,×400).E.Total and differential white blood cell counts in BALF.**.P<0.01 vs control group；***.P<0.001 vs control group.

2.2煙草煙霧提取物對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞HBE合成IL-8的影響如圖2A所示，經(jīng)不同濃度(0.125%、0.25%、0.5%、1%、2%、4%)的煙草煙霧提取物作用于HBE細(xì)胞，采用MTT法，測(cè)煙草提取物對(duì)HBE細(xì)胞增殖情況的影響，我們發(fā)現(xiàn)0.125%、0.25%、0.5%、1%濃度的煙草提取物對(duì)HBE細(xì)胞增殖無明顯影響，而2%和4%濃度的煙草提取物可以抑制HBE細(xì)胞增殖并且促進(jìn)其死亡；如圖2B、C、D所示，經(jīng)不同濃度(0.25%、0.5%、1%)和不同時(shí)間(6、12、24 h)的煙草煙霧提取物作用于HBE細(xì)胞，IL-8表達(dá)隨著煙草濃度的增加而增加，并且在24 h分泌達(dá)到明顯升高，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明，煙草煙霧提取物能夠刺激HBE細(xì)胞合成和分泌IL-8，并且呈現(xiàn)濃度依賴性和時(shí)間依賴性。

2.3煙草煙霧提取物對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞HBE合成PLTP的影響如圖3所示，經(jīng)不同濃度的煙草煙霧提取物作用于HBE細(xì)胞24 h，PLTP的表達(dá)隨著煙草濃度升高而下降，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明，煙草煙霧提取物能夠抑制HBE細(xì)胞合成PLTP,而PLTP與IL-8是否存在內(nèi)在聯(lián)系，尚需論證。

圖2　煙草提取物對(duì)HBECs釋放IL-8的影響Fig.2　Effects of CSE on expression of IL-8 in HBECsNote: A.Effects of CSE on cell growth by MTT;B.IL-8 mRNA expression was detected by RT-PCR;C，D.Protein expression of IL-8 was detected by ELISA.*.P<0.05 vs control group;**.P<0.01 vs control group；***.P<0.001 vs control group.

2.4PLTP轉(zhuǎn)染效率以及在正常情況下和煙草煙霧刺激下其對(duì)IL-8 mRNA表達(dá)的影響如圖4所示，PLTP siRNA轉(zhuǎn)染穩(wěn)定48 h ，PLTP siRNA的基因沉默率達(dá)到70%，并且觀察到PLTP基因沉默之后，IL-8 mRNA的表達(dá)反而升高，并且PLTP siRNA沉默之后促進(jìn)煙草提取物刺激HBE細(xì)胞IL-8 mRNA的表達(dá)。

2.5PLTP基因沉默對(duì)煙草煙霧提取物誘導(dǎo)的人支氣管上皮HBE細(xì)胞PLTP以及IL-8蛋白表達(dá)的影響如圖5所示，1%的煙草提取物濃度作為工作濃度，PLTP siRNA預(yù)處理后，加入煙草提取物共培養(yǎng)24 h，PLTP基因沉默之后可以促進(jìn)煙草提取物刺激后IL-8蛋白的釋放。

圖3　WB檢測(cè)PLTP蛋白表達(dá)量Fig.3　Effect of CSE on expression of PLTP in HBECsNote: *.P<0.05 vs control group;***.P<0.001 vs control group.

圖4　RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率Fig.4　Infection efficiency detected by RT-PCRNote: A.Infection efficiency detected by RT-PCR;B.PLTP mRNA and IL-8 mRNA expression detected by RT-PCR.**.P<0.01 vs NC siRNA group；***.P<0.001 vs NC siRNA group；###.P<0.001 vs NC siRNA+CSE group.

圖5　PLTP 及IL-8 表達(dá)情況Fig.5　Protein expression of PLTP and IL-8 in each groupsNote: A.Protein expression of PLTP was detected by Western blott;B.Protein expression of IL-8 was detected by ELISA.***.P<0.001 vs NC siRNA group；##.P<0.01 vs NC siRNA+CSE group.

3討論

煙草煙霧中含有大量自由基(ROS)和有毒物質(zhì)，吸入人體可導(dǎo)致細(xì)胞癌變、氣道損傷以及肺部炎癥。有研究報(bào)道，不管是小鼠吸煙模型還是細(xì)胞離體實(shí)驗(yàn)中，IL-8表達(dá)升高幅度均比其他炎癥因子高[12,13]。并且IL-8在煙草煙霧導(dǎo)致的肺損傷中起著重要作用，它可以趨化和激活中性粒細(xì)胞，導(dǎo)致其在肺部的浸潤(rùn)。Modelska等[14]研究發(fā)現(xiàn),抗IL-8預(yù)處理可阻斷中性粒細(xì)胞的肺部浸潤(rùn),顯著降低鹽酸、內(nèi)毒素等對(duì)血管內(nèi)皮和肺泡上皮細(xì)胞的損傷。

PLTP的主要功能是參與低密度脂蛋白與高密度脂蛋白間的磷脂轉(zhuǎn)運(yùn),修飾HDL分子大小及脂質(zhì)組成。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其水平及活性與多種炎癥參與性疾病相關(guān)。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)煙草提取物刺激大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞可以引起PLTP顯著升高，因此我們此次研究的目的主要是探索吸煙引起的炎癥反應(yīng)與PLTP的關(guān)系。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠吸煙模型中，煙熏組白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞、PLTP以及IL-8蛋白表達(dá)均高于對(duì)照組(如圖1所示)，在離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，PLTP以及IL-8的表達(dá)量具有煙草濃度依賴性，隨著煙草濃度的升高，合成IL-8的量也不斷增加(如圖2B～D)，然而，PLTP卻隨著煙草濃度的增加而表達(dá)下降(如圖3)，而通過PLTP基因沉默發(fā)現(xiàn)IL-8不管是在基礎(chǔ)水平還是在煙草煙霧誘導(dǎo)情況下均顯著升高(如圖4、5所示)，我們的研究結(jié)果表明PLTP具有抗炎作用，煙草煙霧引起PLTP下降，抗炎作用減弱，加劇IL-8的合成和釋放。然而，PLTP在煙草煙霧誘導(dǎo)HBE細(xì)胞中合成減少卻與Brehm等[9]研究以及我們前期的研究[10]、煙熏大鼠模型IHC染色截然相反，這是否與細(xì)胞類型有關(guān)？是否是因?yàn)镻LTP在肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞中的作用有關(guān)？Jiang等[8]認(rèn)為PLTP可以運(yùn)輸肺泡表面活性物質(zhì)，由于吸煙引起肺泡表面的活性物質(zhì)顯著減少，肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞代償增生，這種改變刺激PLTP合成增加，以運(yùn)輸更多的表面活性物質(zhì)到達(dá)肺泡表面來緩解肺氣腫的病理改變。然而，支氣管上皮細(xì)胞沒有合成肺泡表面活性物質(zhì)的能力，HBECs合成的PLTP僅僅作為細(xì)胞的表面成分，而未參與運(yùn)輸肺泡表面活性物質(zhì)，因此在煙草刺激HBECs導(dǎo)致細(xì)胞損傷時(shí)PLTP合成減少。有研究報(bào)道，在嚴(yán)重的內(nèi)毒素血癥小鼠模型中，與野生型小鼠相比，PLTP-/-小鼠的血漿以及組織中炎癥因子水平更高[15]，將其分離得到的脾細(xì)胞在暴露于脂多糖(LPS)中，其炎癥反應(yīng)比野生型的更為劇烈，并且脾細(xì)胞死亡率也顯著升高。Brehm等[9]研究也表明，PLTP基因沉默小鼠在脂多糖誘導(dǎo)肺損傷模型中，IFN-γ、TNF-α、IL-1β、MMP-9較對(duì)照組顯著升高，而相較未處理組，PLTP處理可以抑制IFN-γ、TNF-α、IL-1β、MMP-9的釋放。這些研究結(jié)果與我們結(jié)果一致，表明PLTP有一定的抗炎作用。然而Schlitt等[16]的研究卻發(fā)現(xiàn)，在動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型中，PLTP-/-小鼠通過下調(diào)白介素6(IL-6)達(dá)到抗炎作用，這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相反，可能原因有二，其一是模型的不同，再者就是所測(cè)的炎癥因子不同，提示PLTP在調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)表達(dá)中作用機(jī)制復(fù)雜，有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，我們證實(shí)PLTP基因沉默后，香煙誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞合成和釋炎癥因子IL-8增加，表明PLTP基因具有一定的抗炎作用。通過此實(shí)驗(yàn)，可以為研究煙草煙霧所致的肺部急性炎癥疾病致病機(jī)制提供思路和參考。

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[收稿2015-10-20修回2015-11-17]

(編輯倪鵬)

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.07.004

作者簡(jiǎn)介：余秀英(1989年-)，女，在讀碩士，主要從事呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)制方面的研究，E-mail：405426832@qq.com。 通訊作者及指導(dǎo)教師：陳亞娟(1980年-)，女，博士，講師，主治醫(yī)師，主要從事呼吸系統(tǒng)小氣道疾病發(fā)病機(jī)制方面研究，E-mail:yajuanchencqmu@sina.com。

中圖分類號(hào)R563.19

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-484X(2016)07-0952-06

Effect of PLTP on CSE-induced IL-8 production in human bronchial epithelial cells

YU Xiu-Ying,LI You-Lun,WU Feng-Ping,CHEN Ya-Juan.

Department of Respiratory Medicine,First Affiliated Hospital,Chongqing Medical University，Chongqing 400016,China

[Abstract]Objective:To investigate the effect of PLTP gene on CSE-induced IL-8 production in human bronchial epithelial cell line (HBECs).Methods: Wistar rats were exposed to air or cigarette smoke for 6 hours/day on 3 consecutive days,then the lungs were sectioned and examined.The number of total white blood cell and differential white blood cells in BALF were counted.The different concentrations of CSE co-cultured with HBECs for 24 hours.Cells growth was detected by MTT assay.Expression levels of PLTP mRNA and IL-8 mRNA were examined by RT-PCR,protein of PLTP was investigated by Western blot,and production of IL-8 examined by ELISA.Results: The number of white blood cells in BALF was significantly increased compared with controls.Enhanced expression level of PLTP and IL-8 were observed in CS-exposure group.Proliferation of HBECs tends to decrease at high concentrations of CSE(2.0% CSE and 4.0% CSE).The results suggested that the production of IL-8 induced by CSE in a time- and concentration-dependent manner,while the expression of PLTP induced by CSE in a dose-dependent manner.Furthermore,expression levels of IL-8 significantly increased after silence PLTP gene. Conclusion: PLTP siRNA could increase CSE-induced IL-8 production in HBECs.

[Key words]Cigarette smoke extract;Human bronchial epithelial cells; HBECs; PLTP; IL-8

①本文為國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目(No.81200009)、國(guó)家臨床重點(diǎn)?？茖ｍ?xiàng)資助(衛(wèi)辦醫(yī)政函[2012]649號(hào))和重慶市衛(wèi)生局中醫(yī)藥研究課題(ZY20132165)。