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        離子交換色譜法測定利塞膦酸鈉片中的磷酸鹽和亞磷酸鹽

        2016-08-09 02:08:57殷勤紅劉小龍
        中國合理用藥探索 2016年6期
        關(guān)鍵詞:磷酸鹽色譜法酸鈉

        殷勤紅劉小龍

        (1昆明積大制藥股份有限公司,云南 昆明 650106;2昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,650224)

        離子交換色譜法測定利塞膦酸鈉片中的磷酸鹽和亞磷酸鹽

        殷勤紅1,2劉小龍1

        (1昆明積大制藥股份有限公司,云南 昆明 650106;2昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,650224)

        目的:在陰離子型交換柱上以鄰苯二甲酸氫鉀緩沖鹽為流動相可同時(shí)測定利塞膦酸鈉片中的磷酸鹽和亞磷酸鹽。方法:采用高效液相色譜法,Waters IC-Pak柱(4.6 mm×50 mm,5 μm),流動相為鄰苯二甲酸氫鉀緩沖鹽;柱溫30℃;進(jìn)樣量10 μL;流速0.6 mL/min;檢測波長290 nm。結(jié)果:磷酸鹽和亞磷酸鹽的保留時(shí)間分別為7.8 min和9.8 min,該方法線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999,精密度和準(zhǔn)確度高,平均回收率分別為97.7% 和100.8%。結(jié)論:本方法操作簡便,準(zhǔn)確可靠,專屬性強(qiáng),重現(xiàn)性好。適用于利塞膦酸鈉片中磷酸鹽和亞磷酸鹽的檢測。

        利塞膦酸鈉片;磷酸鹽;亞磷酸鹽;離子交換色譜法

        利塞膦酸鈉[1-2]是第三代雙膦酸鹽類藥物,用于婦女絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥和長期糖皮質(zhì)激素治療導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松癥的防治,利塞膦酸鈉能緊密地吸附在骨質(zhì)主要成分羥磷灰石的表面,抑制破骨細(xì)胞對骨質(zhì)的吸收,同時(shí)也通過干擾破骨細(xì)胞附著,誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的調(diào)亡。由于在利塞膦酸鈉原料合成過程中使用了亞磷酸,且其水解產(chǎn)物為亞磷酸鹽,經(jīng)空氣氧化成為磷酸鹽;同時(shí)作為利塞膦酸鈉合成過程中產(chǎn)生的磷酸鹽和亞磷酸鹽,極易引起胃腸道等不良反應(yīng),為此在生產(chǎn)利塞膦酸鈉片的過程中需要控制這兩種磷酸鹽的含量。為了嚴(yán)格控制本品的質(zhì)量,本文采用IC-Pak為色譜柱的分析方法來檢測磷酸鹽和亞磷酸鹽,為該藥提供了一種新的可靠的分析手段。

        1儀器與藥品

        SHIMADZU LC-20AT高效液相色譜儀(LC-20AT型泵,SPD-20A型紫外檢測器,SPD-M20A型二極管陣列檢測器,SIL-20AC型自動進(jìn)樣器,CTO-20AC柱溫箱,CBM-20Avlite系統(tǒng)控制器,LC solution色譜工作軟件)。鄰苯二甲酸氫鉀(天津市化學(xué)試劑研究所,批號:20080506)、一水磷酸二氫鈉(Sigma-Aldrich Co.LLC,批號:S9638-25)、五水亞磷酸鈉(Meryer Chemical Technology Co.,Ltd.,批號:68927403)。利塞膦酸鈉片(昆明積大制藥股份有限公司,規(guī)格35 mg,批號:080101,100105,101002)。

        2方法與結(jié)果

        2.1色譜條件

        參考美國藥典(USP38-NF33)中Foscarnet Sodium[3]質(zhì)控項(xiàng)目“Limit of phosphate and phosphite”的色譜條件,本方法選擇的色譜條件為:色譜柱為Waters IC-Pak(4.6 mm×50 mm,5 μm),流動相為鄰苯二甲酸氫鉀緩沖鹽(稱取0.1 g鄰苯二甲酸氫鉀,用水溶解,再加入2.5 mL的1 mol/L硝酸,并用水稀釋至1 000 mL),流速0.6 mL/min;進(jìn)樣量10 μL;柱溫30℃;檢測波長290 nm。

        2.2溶液的配制

        2.2.1對照品溶液的配制精密稱取一水磷酸二氫鈉適量,用水溶解并制成每1 mL含0.28 mg的磷酸二氫鈉儲備液。精密稱取五水亞磷酸鈉適量,用水溶解并制成每1 mL含0.43 mg的亞磷酸鈉儲備液。分別移取1 mL的磷酸二氫鈉儲備液和亞磷酸鈉儲備液至 25 mL量瓶中,用水稀釋至刻度。

        2.2.2供試品溶液的配制取10片,研細(xì),精密稱取適量,用水溶解并配制成每1 mL含2.4 mg的溶液(以利塞膦酸鈉計(jì))。

        2.3專屬性

        分別取空白溶劑、輔料、對照溶液、供試品溶液、供試品加標(biāo)溶液各10 μL進(jìn)樣,記錄色譜圖。結(jié)果表明,空白溶劑和輔料均不干擾測定,對照品溶液、供試品加標(biāo)溶液中磷酸鹽和亞磷酸鹽的分離度均不小于2.0,專屬性符合要求。見圖1。

        2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線

        精密量取磷酸二氫鈉儲備液0.2,1.0,1.6,2.0,

        2.4,3.0 mL,分別置50 mL容量瓶中,對應(yīng)加入亞磷酸鈉儲備液 0.2,1.0,1.6,2.0,2.4,3.0 mL,加水稀釋至刻度,搖勻即得10%,50%,80%,100%,120%,150%的線性溶液,照上述測定方法,精密量取上述線性溶液各10 μL,分別注入液相色譜儀,記錄色譜圖。以磷酸鹽、亞磷酸鹽的峰面積對其濃度進(jìn)行線性回歸,計(jì)算線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)r,并繪出線性圖,見圖2和圖3。磷酸鹽的典型回歸曲線方程為:

        A空白溶液;B空白輔料;C對照品;D供試品(101002);E加標(biāo)供試品;1磷酸鹽;2亞磷酸鹽圖 1 磷酸鹽和亞磷酸鹽專屬性HPLC圖

        Y=-1 824.2X+105.7(r=0.999 7),

        亞磷酸鹽的典型回歸曲線方程為:

        Y=-1 160.7X+44.6(r=0.999 1)。

        結(jié)果顯示,磷酸鹽在1.14~17.08 μg/mL濃度內(nèi)線性關(guān)系良好,亞磷酸鹽在1.77~ 24.49 μg/mL濃度內(nèi)線性關(guān)系良好。

        圖2 磷酸鹽線性關(guān)系

        圖3 亞磷酸鹽線性關(guān)系

        2.5準(zhǔn)確度

        精密稱取含量測定項(xiàng)下粉末250 mg,分別用50%,100%,150%的線性溶液溶解并制成每1 mL中約含2.4 mg的溶液,即得標(biāo)示量分別為50%, 100%,150%的供試品加標(biāo)溶液,照磷酸鹽和亞磷酸鹽測定方法,分別測定樣品中磷酸鹽和亞磷酸鹽的含量,并計(jì)算出回收率。

        磷酸鹽和亞磷酸鹽的準(zhǔn)確度見表1和表2。磷酸鹽和亞磷酸鹽的平均回收率分別為97.7%和100.8%。

        表1 磷酸鹽回收率結(jié)果

        表2 亞磷酸鹽回收率結(jié)果

        2.6穩(wěn)定性

        取對照溶液,分別于配制后室溫放置0,2,4,8,16 h取樣檢測,測定磷酸鹽、亞磷酸鹽峰面積和RSD。磷酸鹽和亞磷酸鹽在室溫放置16 h后,溶液中磷酸鹽、亞磷酸鹽峰面積RSD分別為0.30%,1.41%,說明溶液在室溫放置16 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

        2.7定量限和檢測限

        取對照溶液進(jìn)行逐級稀釋,照磷酸鹽和亞磷酸鹽檢測方法進(jìn)行測定,記錄磷酸鹽峰和亞磷酸鹽峰信噪比約為10∶1和3∶1時(shí)的色譜圖,此時(shí)所對應(yīng)的濃度即為磷酸鹽和亞磷酸鹽的定量限和檢測限。磷酸鹽、亞磷酸鹽的定量限分別為0.031%,0.031%,磷酸鹽、亞磷酸鹽的檢測限分別為0.015%,0.015%。

        2.8精密度

        按照準(zhǔn)確度試驗(yàn)中100%的供試品加標(biāo)溶液,配制6份樣品,精密量取上述溶液各10 μL,分別注入液相色譜儀,記錄色譜圖。6份供試品加標(biāo)溶液的磷酸鹽和亞磷酸鹽的RSD分別為1.7%和2.3%,表明本方法的精密度良好,符合定量分析要求。

        2.9樣品測定

        取3批樣品,照上述方法測定樣品中磷酸鹽和亞磷酸鹽的含量,測定結(jié)果見表3。

        表3 樣品測定結(jié)果

        3討論

        過去常用的磷酸鹽測定方法,如比色法[4]、薄層色譜法[5],需要選擇合適的展開劑,還需要加顯色劑,方法重現(xiàn)性差,難以用作定量分析;同時(shí)也有高效液相色譜測定方法[6-7],但需利用特殊類型的電導(dǎo)檢測器。

        對流動相離子強(qiáng)度進(jìn)行了篩選,發(fā)現(xiàn)鄰苯二甲酸氫鉀的量在0.92~ 1.07 g范圍內(nèi),磷酸鹽和亞磷酸鹽峰峰形良好,分離度滿足定量測定要求;倘若鄰苯二甲酸氫鉀的用量超出1.07 g,磷酸鹽和亞磷酸鹽峰將與其他陰離子色譜峰出現(xiàn)共淋洗現(xiàn)象并導(dǎo)致色譜峰重疊;倘若鄰苯二甲酸氫鉀的用量低于0.92 g,磷酸鹽和亞磷酸鹽峰之間又無法有效洗脫和分離。隨著流動相中離子強(qiáng)度的增強(qiáng)或減弱,陰離子在色譜柱固定相中洗脫能力和洗脫速率也將得以增強(qiáng)或減弱。

        采用二極管陣列檢測器(PDA)對對照品溶液中的磷酸鹽和亞磷酸鹽進(jìn)行檢測并提取磷酸鹽和亞磷酸鹽色譜峰在200~ 400 nm波長掃描圖,表明磷酸鹽和亞磷酸鹽色譜峰在247 nm和278 nm波長處有最大負(fù)吸收值;同時(shí)對比研究288,290,292 nm不同檢測波長條件下的對照品溶液,發(fā)現(xiàn)磷酸鹽和亞磷酸鹽峰面積RSD均小于2.0%,表明 290 nm可作為磷酸鹽和亞磷酸鹽定量測定的檢測波長。

        本實(shí)驗(yàn)方法測定利塞膦酸鈉片中的磷酸鹽和亞磷酸,僅需常規(guī)的紫外檢測器,具有分離效果好、檢測靈敏等優(yōu)點(diǎn),方法簡便、快速,可用于利塞膦酸鈉片中的磷酸鹽和亞磷酸鹽的測定。

        [1]黃海英.利塞膦酸鈉臨床研究進(jìn)展[J].中國新藥雜志,2002,11 (4):281-284.

        [2]伍鳳莉,吳宜勇,史紅巖.利塞膦酸鈉防治絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松癥的對照試驗(yàn)[J].中國新藥雜志,2006,15(8):630-633.

        [3]The U.S.Pharmacopeial Convention.The United States Pharmacopeia 38-The National Formulary 33[S].Baltimore,MD:United Book Press,Inc.,2015.

        [4] Barnabè N,Butler M.The effect of glucose and glutamine on the intracellular nucleotide pool and oxygen uptake rate of a murine hybridoma[J].Cytotechnology,2000,34(1-2):47-57.

        [5] Paredes C,Sanfeliu A,Cardenas F,et al.Estimation of the intracellular fluxes for a hybridoma cell line by material balances [J].Enzyme and Microbial Technology,1998,23(3-4):187-198.

        [6]馬仕珉,石松安,季晶晶,等.高效液相色譜法測定唑來膦酸中的磷酸鹽和亞磷酸鹽[J].淮海工學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2010,19(4):40-42.

        [7] 何擁軍,謝敏浩,羅世能,等.離子交換色譜法測定因卡膦酸二鈉膠囊中的磷酸鹽和亞磷酸鹽[J].華東理工大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2005,31(6):772-774.

        Determination of Phosphate and Phophite in Risedronate Sodium Tablets by IE-HPLC

        Yin Qinhong1,2,Liu Xiaolong1(1 Kunming Jida Pharmaceutical Co.,Ltd.,Yunnan Kunming 650106,China;2 Faculty of Life Science and Technology,Kunming University of Science and Technology,650224)

        Objective:To determine phosphate and phophite in risedronate sodium tablets simultaneously by anion exchange column chromatography using potassium hydrogen phthalate buffer saline as a mobile phase.Methods:Samples were determined by HPLC on the Waters IC-Pak column(4.6 mm×50 mm,5 μm)using potassium hydrogen phthalate buffer saline as a mobile phase.The column temperature was at 30℃ and the sample loading was 10 μL.The flow rate was 0.6 mL/min,while the UV detection wavelength was 290 nm.Results:The resolution time of phosphate and phophite were 7.8 and 9.8 min,while the mean recovery rates were 97.7%and 100.8%,respectively.The linear correlation coefficient of the method was more than 0.999,while precision and accuracy were high.Conclusion:The method is simple,accurate and reliable,with high specificity and reproducibility,which is suitable for the determination of phosphte and phosphite in risedronate sodium tablets.

        Risedronate Sodium Tablets;Phosphte;Phosphite;IE-HPLC

        10.3969/j.issn.1672-5433.2016.06.004

        殷勤紅,男,工程師。主要從事新藥開發(fā)工作。通訊作者E-mail:hawkyin2008@126.com

        2016-02-16)

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