戴　俊，康　振，張琳培，陳　堅(jiān)，堵國(guó)成*

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122）

煙草節(jié)桿菌肌酸酶的高效異源表達(dá)與應(yīng)用分析

戴俊1，2，康振1，2，張琳培1，2，陳堅(jiān)1，2，堵國(guó)成1，2*

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122）

肌酸酶（CRE）是臨床檢測(cè)血液和尿液中肌酐的關(guān)鍵酶之一。作者成功地從煙草節(jié)桿菌23710（Arthrobacter nicotianae 23710）中克隆了CRE基因，并實(shí)現(xiàn)了CRE在Escherichia coli BL21（DE3）中的表達(dá)。經(jīng)過(guò)硫酸銨分級(jí)沉淀、陰離子交換色譜、分子篩后得到了較純的重組CRE，比酶活達(dá)到了20.25 U/mg。重組CRE對(duì)于螯合劑EDTA、表面活性劑（Tween20，和Triton X-100）以及常用的防腐劑NaN3有很好的耐受性。

肌酸酶；煙草節(jié)桿菌；重組酶表達(dá)；應(yīng)用分析

肌酐是人體中重要的代謝產(chǎn)物，血液中肌酐含量一般維持在35～150滋mol/L，多余的肌酐將通過(guò)腎臟系統(tǒng)排到體外［1］。一旦人體腎臟功能出現(xiàn)問(wèn)題，肌酐無(wú)法隨尿液排出，血液中的肌酐含量就會(huì)隨之升高，測(cè)定血液和尿液中肌酐的含量就可以出反應(yīng)腎臟功能［2］。目前臨床使用酶法對(duì)肌酐進(jìn)行檢測(cè)，酶法主要由3個(gè)酶促反應(yīng)組成，其中的3種關(guān)鍵酶分別為肌酐酶（Creatininase，EC 3.5.2.10）、肌酸酶（Creatinase，簡(jiǎn)稱為CRE，EC 3.5.3.3）以及肌氨酸氧化酶（Sarcosine oxidase，EC 1.5.3.1）［3］。

CRE作為酶法測(cè)定肌酐中的關(guān)鍵酶，可以將肌酸分解為肌氨酸和尿素［4］。在自然界中，很多種類的菌株可以在誘導(dǎo)條件下產(chǎn)生CRE，這些菌株包括：芽孢桿菌屬（Bacillus）［5］、黃桿菌屬（Flavobacterium）［3］、假 單 胞 菌 屬（Pseudomonas）［6］、節(jié) 桿 菌 屬（Arthrobacter）［2］、產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes）［7］、副球菌屬（Paracoccus）［8］、梭菌屬（Clostridium）［9］等。相應(yīng)地，針對(duì)野生菌產(chǎn)生的CRE也有純化、性質(zhì)分析以及評(píng)估等相關(guān)的研究［10］。智強(qiáng)等人成功地從篩選的A.nicotianae 02181中純化出CRE，并進(jìn)行了性質(zhì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該CRE具有良好的酶學(xué)性質(zhì)，然而野生菌的CRE產(chǎn)量很低［11］，不適合應(yīng)用工業(yè)進(jìn)行大規(guī)模的生產(chǎn)。因此，通過(guò)構(gòu)建細(xì)胞工廠來(lái)生產(chǎn)出具有良好性質(zhì)的CRE是必需的。

在本研究中，作者成功克隆了來(lái)源于A.nicotianae 23710和Pseudomonas putida KT2440 的CRE基因，隨后分別構(gòu)建重組菌實(shí)現(xiàn)了CRE的異源表達(dá)，并分析了兩種重組菌的表達(dá)情況。最后對(duì)來(lái)源于A.nicotianae 23710的重組CRE進(jìn)行了應(yīng)用性質(zhì)分析。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1菌株和質(zhì)粒A.nicotianae 23710：購(gòu)自于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心 （CICC）；菌株E. coli JM109、E.coli BL21（DE3）、Lactobacillus reuteri CICC6124、P.putidaKT2440和 質(zhì) 粒pMD19、pET20b：均為作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2主要試劑Primer Star DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、Solution I DNA連接酶、瓊脂糖、感受態(tài)制備試劑盒、膠回收試劑盒：TaKaRa公司（大連）；氨芐青霉素、異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、質(zhì)粒提取試劑盒、細(xì)菌基因組提取試劑盒：上海生工生物有限公司；蛋白胨、酵母粉：Oxoid公司；標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)分子質(zhì)量蛋白質(zhì)、上樣蛋白質(zhì)緩沖液、SDS-PAGE預(yù)制膠：LifeTechnologies公司；其它試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)。

1.1.3主要溶液的配制

1）對(duì)-二甲氨基苯甲醛溶液：稱取2 g對(duì)-二甲氨基苯甲醛，溶于100mL二甲亞砜，加入15mL鹽酸。

2）肌酸溶液：稱取1.492 g肌酸，溶于90 mL PBS緩沖液中并定容至100 mL，要求在使用前配置。

3）PBS緩沖液（50 mmol/L）：分別配制0.2 mol/L 的NaH2PO4和0.2 mol/L Na2HPO4母液以備用，取95mL0.2mol/LNaH2PO4，155mL0.2mol/L Na2HPO4，加入去離子水并定容至1 000 mL。

1.1.4培養(yǎng)基

1）LB培養(yǎng)基（g/L）：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl10。

2）TB培養(yǎng)基（g/L）：酵母粉24，蛋白胨12，甘油4，K2HPO416.43，KH2PO42.32。

3）檢測(cè)培養(yǎng)基（g/L）：酵母粉 0.1，蛋白胨 1，葡萄糖1，NaCl 5，KH2PO42，肌酸1，酚紅0.012。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1重組質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢到其它來(lái)源的CRE基因序列，設(shè)計(jì)引物ACRE-F、ACRE-R、PCRE-F、PCRE-R，引物序列見(jiàn)表1。以ACRE-F、ACRE-R為引物，A.nicotianae 23710基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；以PCRE-F、PCRE-R為引物，P.putida KT2440基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將得到的CRE基因分別連接pMD19-T，得到質(zhì)粒pMD19-T/Acre和pMD19-T/Pcre，進(jìn)行測(cè)序。用 NdeI和 XhoI分別雙酶切 pMD19-T/Acre和pMD19-T/Pcre，與同樣進(jìn)行雙酶切的pET-20（b）進(jìn)行連接，連接液轉(zhuǎn)入E.coli JM109后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證。

表1　　引物序列Table 1　Primer sequence

1.2.2CRE的誘導(dǎo)表達(dá)將驗(yàn)證正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli BL21（DE3）中，挑取單菌落接入20 mL LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12 h，轉(zhuǎn)速為220 r/min。將生長(zhǎng)好的種子液以體積分?jǐn)?shù)5%接種至TB發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃進(jìn)行培養(yǎng)。待OD600達(dá)到0.6時(shí)，接入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，并把溫度降至30℃誘導(dǎo)10 h。

1.2.3CRE的平板檢測(cè)預(yù)先在LB平板上將L.reuteri CICC6124指示菌和需要檢測(cè)的菌株分別劃線，待劃線菌落長(zhǎng)到一定大小，挑取指示菌單菌落于檢測(cè)平板上，并將待檢測(cè)菌株接種于指示菌的附近，將平板放置于30℃培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，觀察平板上顏色變化［11］。

1.2.4CRE的活性測(cè)定在試管中加入900滋L肌酸溶液，在室溫中平衡5 min后加入100滋L待測(cè)酶液，在37℃反應(yīng)10 min，然后向反應(yīng)體系中加入2 mL對(duì)-二甲氨基苯甲醛溶液終止反應(yīng)，并置于25℃溫育20 min，在435 nm處測(cè)定吸光度值，以水調(diào)零。空白管是在肌酸溶液中先加入對(duì)-二甲氨基苯甲醛，后加入待測(cè)酶液，其它步驟與測(cè)定管一致。

單位酶活定義：1 min內(nèi)將肌酸水解產(chǎn)生 1 滋mol尿素所需要的酶量。

1.2.5CRE的純化方法將發(fā)酵液12 000 r/min離心10 min，除去上清液，用純水將菌體洗滌兩次后加入適量的PBS緩沖液懸浮細(xì)胞。在冰浴條件下利用超聲破碎儀對(duì)重組大腸桿菌進(jìn)行破碎。對(duì)破碎后的懸浮液進(jìn)行硫酸銨分級(jí)沉淀，取飽和度為60%～80%的沉淀部分，以PBS緩沖液溶解沉淀并透析過(guò)夜。透析后，利用微孔濾膜（0.25滋m）去除酶液中的雜質(zhì)，利用AKTA蛋白純化儀進(jìn)行純化，使用的柱子為陰離子交換柱（HiPrep 16/10 Q_XL）。上樣緩沖液（A液）為50 mmol/L的PBS緩沖液，而洗脫緩沖液（B液）為加有1 mol/L NaCl的50 mmol/L的PBS緩沖液。以A液進(jìn)行上樣并平衡30 min，之后以B液進(jìn)行線性洗脫，收集洗脫蛋白質(zhì)。將有酶活的收集液用凝膠柱（HiLoad 16/60 superdex 200）進(jìn)一步純化，緩沖液為50 mmol/L的PBS緩沖液。

1.2.6化學(xué)物質(zhì)對(duì)CRE影響的分析在酶液中添加一定濃度的化學(xué)物質(zhì)，在0℃保持30 min，測(cè)定酶活，并與不添加任何化學(xué)物質(zhì)的酶液酶活進(jìn)行比較。

2結(jié)果與討論

2.1CRE重組菌的構(gòu)建

以A.nicotianae 23710和P.putida KT2440基因組為模板分別擴(kuò)增cre基因，凝膠電泳見(jiàn)圖1。在1.2 kb處都有一條DNA條帶，與預(yù)期相符。對(duì)來(lái)源于A.nicotianae 23710和P.putida KT2440的CRE基因進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖2。將測(cè)序結(jié)果與之前報(bào)道的肌酸酶序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)A.nicotianae 23710與A.nicotianae 02181來(lái)源的CRE基因同源性為91.7%，P.putida KT2440與P.putida GB-1來(lái)源的CRE基因同源性為93.3%，而不同屬來(lái)源的CRE同源性較低，A.nicotianae 23710和P.putida KT2440來(lái)源的CRE基因同源性僅為65.1%。

圖1CRE基因瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1　Agarose gel electrophoresis of CRE gene

對(duì)pMD19-T/Acre和pMD19-T/Pcre雙酶切，回收片段后連接到表達(dá)載體 pET20b上，并轉(zhuǎn)入E.coli JM109中。經(jīng)過(guò)菌落PCR初步驗(yàn)證得到陽(yáng)性重組子，接種過(guò)夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，酶切成功說(shuō)明重組質(zhì)粒pET20b-Acre與pET20b-Pcre構(gòu)建成功。將驗(yàn)證正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli BL21 （DE3）得到重組表達(dá)菌株E.coli BL21A和E.coli BL21P。

在設(shè)計(jì)引物時(shí)，在下游引物中加入了TAA終止密碼子。在pET20b質(zhì)粒上，Xho I酶切位點(diǎn)后有His-tag，如果不加入終止密碼子，表達(dá)的蛋白質(zhì)C-端會(huì)帶有幾個(gè)組氨酸。之前為了方便后續(xù)的CRE純化，沒(méi)有加終止密碼子，將CRE與His-tag融合表達(dá)。雖然外源蛋白質(zhì)在重組菌中表達(dá)了出來(lái)，但均沒(méi)有CRE活性。這可能是因?yàn)镃RE的活性位點(diǎn)位于肽鏈的C-端附近，加入了His-tag可能會(huì)影響蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致表達(dá)的蛋白質(zhì)沒(méi)有CRE酶活。

2.2重組菌的表達(dá)

2.2.1平板檢測(cè)檢測(cè)平板中含有肌酸，如果待檢測(cè)菌產(chǎn)CRE，可以分解肌酸得到尿素。而L.reuteri CICC6124可以將尿素分解產(chǎn)生氨，使周圍培養(yǎng)基pH升高，從而使培養(yǎng)基中的pH指示劑酚紅改變顏色。在檢測(cè)平板上分別接種如下菌株：指示菌L.reuteri CICC6124、陰性對(duì)照菌E.coli BL21（pET20）、待檢測(cè)菌E.coli BL21A、E.coli BL21P，觀察生長(zhǎng)情況。平板檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3?？梢园l(fā)現(xiàn)，在E.coli BL21A、E.coli BL21P周圍均有紅色，且E.coli BL21A周圍的顯色反應(yīng)比E.coli BL21P還要強(qiáng)烈，而E.coli BL21（pET20）周圍卻沒(méi)有明顯紅色，說(shuō)明重組菌E.coli BL21A和E.coli BL21P可以產(chǎn)CRE。

2.2.2SDS-PAGE分析和酶活檢測(cè)將搖瓶發(fā)酵液1 000 r/min離心10 min，去除上清液，以PBS緩沖液懸浮細(xì)胞。在0℃下破碎細(xì)胞，破碎完全后離心，取上清液分別進(jìn)行SDS-PAGE分析和酶活檢測(cè)。SDS-PAGE分析結(jié)果見(jiàn)圖4。在相應(yīng)大小處重組菌上清液均有明顯條帶，而E.coli BL21（pET20）沒(méi)有明顯條帶，說(shuō)明CRE在重組菌中實(shí)現(xiàn)了表達(dá)，且表達(dá)量較高。

圖2　　來(lái)源于A.nicotianae 23710和P.putida KT2440的CRE基因序列Fig.2　CRE genes from A.nicotianae 23710 and P.putida KT2440

圖3CRE酶活平板檢測(cè)Fig.3　Determination　oftheCRE　activitywith　an indicator plate

酶活檢測(cè)測(cè)得原始菌A.nicotianae 23710的酶活為190.19 U/g，P.putida KT2440酶活為54.92 U/g，而重組菌 E.coli BL21A酶活為 1 834.04 U/g，E.coli BL21P酶活為1 380.92 U/g?？梢园l(fā)現(xiàn)重組菌酶活要遠(yuǎn)高于原始菌酶活，而兩種重組菌相比之下，E.coliBL21A比E.coliBL21P的酶活高出32.8%。

圖4　　重組CRE SDS-Pisis of recombinant CRE

2.3重組CRE的純化

CRE的整個(gè)純化過(guò)程是由硫酸銨沉淀、陰離子柱純化、分子篩構(gòu)成的。由于細(xì)胞內(nèi)雜蛋白質(zhì)含量比較多，不利于目的蛋白質(zhì)與陰離子柱的結(jié)合，需要先去除一部分雜質(zhì)。硫酸銨沉淀作為一種溫和的不易使蛋白質(zhì)變性的純化方法被廣泛應(yīng)用，所以在使用陰離子柱純化之前，選擇硫酸銨沉淀以去除部分雜蛋白質(zhì)并濃縮目的蛋白質(zhì)。進(jìn)行硫酸銨分級(jí)沉淀時(shí)，發(fā)現(xiàn)重組CRE主要在硫酸銨濃度為60%～80%條件下析出。

CRE的理論等電點(diǎn)（PI）在5.0左右，在pH為7.0的條件下帶負(fù)電荷，因此可以選擇陰離子交換色譜作為純化的第二步。發(fā)現(xiàn)在15%～20%B的洗脫條件下，出現(xiàn)了一個(gè)峰形很好的洗脫峰，經(jīng)酶活檢測(cè)確實(shí)為CRE的洗脫峰。

此純化方法操作方便，且操作步驟較少，可以快速制備純化樣品（見(jiàn)圖5），以便對(duì)重組CRE的進(jìn)一步分析。

對(duì)純化的兩種重組CRE進(jìn)行比酶活測(cè)定，結(jié)果E.coli BL21A的CRE比酶活為20.25 U/mg，而E.coli BL21P的CRE比酶活為9.0 U/mg。E.coli BL21A的CRE比酶活相比之下高很多，且E.coli BL21A的產(chǎn)酶量較高，所以將E.coli BL21A作為后期的主要研究對(duì)象。

圖5重組CRE純化過(guò)程SDS-PAGE分析Fig.5　SDS-PAGE analysis of the purification process of the recombinant CRE

2.4重組CRE的應(yīng)用分析

在實(shí)際應(yīng)用中，CRE需要滿足一些條件。首先，CRE的最適溫度在35～45℃之間，最適pH在7.0～9.0之間。其次因?yàn)樵谥苽涿冈噭┖袝r(shí)，需要在其中加入一定量的NaN3作為防腐劑，所以要求CRE能夠在一定濃度的NaN3下保持酶活。最后就是CRE的純度要求，保證干擾應(yīng)用的有害雜酶——過(guò)氧化氫酶在2%以下。根據(jù)以上在實(shí)際應(yīng)用中的CRE的要求對(duì)E.coli BL21A所產(chǎn)的重組CRE進(jìn)行應(yīng)用分析。

2.4.1溫度、pH對(duì)重組CRE的影響考察了溫度、pH對(duì)重組CRE的影響，結(jié)果與來(lái)源于A.nicotianae 02181的CRE基本一致，最適反應(yīng)溫度為37℃，最適反應(yīng)pH為7.5［12］。

2.4.2化學(xué)物質(zhì)對(duì)重組CRE的影響分析了部分化學(xué)物質(zhì)對(duì)重組CRE的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。首先分析了NaN3對(duì)CRE的影響，NaN3能夠抑制細(xì)胞色素氧化酶的活力從而抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，在CRE的應(yīng)用過(guò)程中作為防腐劑存在。分別設(shè)置了3種不同濃度的NaN3進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NaN3對(duì)CRE沒(méi)有顯著影響。之后又分析了幾種工業(yè)中常用的表面活性劑和螯合劑對(duì)CRE的影響，發(fā)現(xiàn)SDS能夠使CRE完全失活，而螯合劑EDTA和其它類型的表面活性劑 （Tween20和Triton X-100）對(duì)CRE沒(méi)有抑制作用。

表2　　不同化學(xué)物質(zhì)對(duì)CRE的影響Table 2　Effect of chemicals on CRE activity

2.4.2重組CRE的純度檢測(cè)對(duì)重組CRE進(jìn)行純化后測(cè)定其中過(guò)氧化氫酶酶活，結(jié)果發(fā)現(xiàn)純化的重組CRE中檢測(cè)不到過(guò)氧化氫酶活性，滿足應(yīng)用要求。

綜上，CRE的最適溫度為37℃，最適pH為7.5，能夠耐受NaN3，且純化的CRE中不含過(guò)氧化氫酶，因此滿足實(shí)際應(yīng)用。

3結(jié)語(yǔ)

CRE作為酶法測(cè)定肌酐方法中的關(guān)鍵酶，在臨床檢測(cè)腎臟功能中起著重要作用。作者成功克隆來(lái)源于A.nicotianae 23710的CRE基因，并構(gòu)建了重組表達(dá)菌E.coli BL21A。通過(guò)對(duì)重組菌E.coli BL21A進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)重組菌酶活達(dá)到1 834.04 U/g，與原始菌的酶活190.19 U/g相比，提高了9.6倍之多。此外還對(duì)重組CRE進(jìn)行了純化和性質(zhì)分析，所采用的純化方法簡(jiǎn)單有效，可以快速得到較純CRE進(jìn)行分析。重組CRE的最適反應(yīng)溫度為37℃，最適反應(yīng)pH為7.5，在常用防腐劑NaN3的作用下也不會(huì)影響酶活。

本研究實(shí)現(xiàn)了CRE的高效表達(dá)，為降低肌酸水解酶的生產(chǎn)成本和擴(kuò)大應(yīng)用范圍奠定基礎(chǔ)。

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Expression and Application Analysis of Creatinase from Arthrobacter nicotianae

DAI Jun1，2，KANG Zhen1，2，ZHANG Linpei1，2，CHEN Jian1，2，DU Guocheng1，2*
（1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Creatine amidinohydrolase（CRE）is one of the key enzymes for clinical determination of creatinine in serum and urine.In this study，the gene encoding for CRE was successfully amplified from Arthrobacter nicotianae 23710 and functionally overexpressed in Escherichia coli BL21（DE3）. The recombinant CRE was purified through a series of operation including ammonium sulfate precipitation，anion exchange chromatography and gel filtration chromatography.The specific activity of the purified enzyme reached 20.25 U/mg.The recombinant enzyme shows excellent resistance to the chelating agent EDTA，the surfactants（Tween20 and Triton X-100）and the common preservative NaN3.

creatinase，Arthrobacter nicotianae，expression，application analysis

Q 814

A

1673—1689（2016）05—0465—06

2014-09-30

國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目（2011AA100905）；長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（IRT1135）；國(guó)家博士后基金項(xiàng)目（2013M540414）；江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（BK20141107）；江蘇省博士后基金項(xiàng)目（1301010B）。
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堵國(guó)成（1965—），男，江蘇常州人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事代謝工程、發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化與控制等領(lǐng)域的研究。E-mail：gcdu@jiangnan.edu.cn