李改艷　陳康康　孫慧珍

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

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不同測定時間SPAD值對估測葉綠素面積質(zhì)量的影響1)

李改艷陳康康孫慧珍

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

摘要以東北東部山區(qū)蒙古櫟(Quercus mongolica)、五角槭(Acer mono)、春榆(Ulmus japonica)、水曲柳(Fraxinus mandshurica)、胡桃楸(Juglans mandshurica)、黃波欏(Phellodendron amurense)、白樺(Betula platyphylla)和紫椴(Tilia amurensis)8個闊葉樹種為研究對象，通過SPAD-502葉綠素儀分析以上樹種SPAD日變化特征，計算不同測定時間SPAD值估測葉綠素面積質(zhì)量誤差。結(jié)果表明：SPAD值日變化最大值75%出現(xiàn)在12:00—18:00，最小值近90%出現(xiàn)在04:00—06:00，變化率在2%～17%；SPAD最小值低估葉綠素面積質(zhì)量誤差達10%～20%，其他時間段誤差在±9%內(nèi)(除了蒙古櫟春季)。葉片SPAD與光量子通量密度、葉綠素面積質(zhì)量、葉面積質(zhì)量、含水率相關(guān)性因樹種和測定時期而異。建議該地區(qū)SPAD值測定時間最好在08:00—18:00。

關(guān)鍵詞SPAD日變化；葉綠素面積質(zhì)量；估計誤差

葉綠素面積質(zhì)量是森林生態(tài)學(xué)研究中極其基礎(chǔ)，也是至關(guān)重要的生理參數(shù)。該指標(biāo)不僅決定著樹木吸收太陽輻射量，直接限制其光合潛力乃至其初級生產(chǎn)量[1]，而且可敏感地指示樹木體內(nèi)營養(yǎng)狀況[2-3]、生物[4]及環(huán)境脅迫[5-6]程度。因此，實時準(zhǔn)確、快捷地獲取葉綠素面積質(zhì)量及其變化信息，不僅是提供樹木與環(huán)境之間關(guān)系的重要信息需要，而且對森林生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)功能動態(tài)管理及保護等具有重要現(xiàn)實意義。

葉綠素面積質(zhì)量常采用分光光度法測定，該方法不僅費時費力無法進行連續(xù)觀測，而且在樣品運輸、制備過程中因色素?fù)p失導(dǎo)致測定結(jié)果變異性較高[7]。近30a以來，隨著手持式葉綠素儀問世，葉綠素測定技術(shù)有了進一步的發(fā)展，葉綠素儀通過記錄葉綠素強烈吸收的650nm附近波長及940nm參考波長吸收率之差，得到無量綱數(shù)值代表葉綠素相對量。通過建立葉綠素面積質(zhì)量與無量綱數(shù)值模型確定葉綠素絕對量。該方法具有使用簡便、實時、無損等優(yōu)勢，尤其處理大量樣品時，得到廣泛應(yīng)用[8-9]。

目前葉綠素儀型號主要有SPAD-502(Soil-PlantAnalysesDevelopment,MinoltaCameraCo.Ltd.,Japan)、CCM200(Opti-Sciences,Tyngsboro,MA,USA)、CL01(Hansatech,King’sLynn,Norfolk,England)和atLEAF(FTGreenLLC,Wilmington,DE)，不同儀器吸收波長略有差異，但參考波長均為940nm，來彌補因葉片特性如葉綠素面積質(zhì)量、葉厚及含水率等因素影響[10]。但事實上葉綠素儀讀數(shù)因測定時間不同呈現(xiàn)早晚高、中午低，也有隨著時間推移而升高的趨勢，變化率在9%～23%之間[6，11-13]，有的甚至高達35%[14]。而客觀存在的葉綠素儀讀數(shù)日變化對估測葉綠素絕對值的準(zhǔn)確性還知之甚少。因此本文以東北東部山區(qū)8個闊葉樹種為研究對象，以SPAD-502葉綠素儀為例，分析不同樹種SPAD日變化特征，計算不同測定時間SPAD值估測葉綠素面積質(zhì)量誤差，為該地區(qū)合理使用SPAD-502葉綠素儀提供科學(xué)依據(jù)和實踐指導(dǎo)。

1研究地概況

研究地設(shè)在東北林業(yè)大學(xué)帽兒山森林生態(tài)系統(tǒng)定位研究站。平均海拔400m，坡度10°～15°，地帶性土壤為暗棕色森林土。氣候?qū)俅箨懶约撅L(fēng)氣候，夏季短促濕熱，冬季寒冷干燥。年均降水量629mm，主要集中在6—8月，年均蒸發(fā)量約864mm，年均氣溫3.1 ℃，1、7月平均氣溫分別為-18.5、22.0 ℃；無霜期為120～140d[15]。試驗樹種為蒙古櫟(Quercus mongolicaFisch.exTurcz.)、五角槭(Acer monoMaxim)、春榆(Ulmus japonica (Rehd.)Sarg.)、水曲柳(Fraxinus mandshuricaRupr.)、胡桃楸(Juglans mandshuricaMaxim.)、黃波欏(Phellodendron amurenseRupr.)、白樺(Betula platyphyllaSuk.)和紫椴(Tilia amurensisRupr)。

2材料與方法

2.1SPAD值及葉綠素面積質(zhì)量測定

每個樹種選取處于林緣或全光照下長勢一致、生長狀況良好的3株樣樹，分別于春季、夏季和秋季晴天標(biāo)記各樣樹樹冠中部南向外緣生長健康的5枚葉片，從04:00—18:00每2h采用SPAD-502葉綠素儀(MinoltaCameraCo.Ltd.，Osaka，Japan)，避開葉脈，在葉片不同位置均勻測定8個SPAD值，取其均值代表該葉片數(shù)值。

完成SPAD測定的葉片，采用DMSO法測定葉綠素面積質(zhì)量[16]。首先使用直徑0.8cm打孔器在測定SPAD值的大致位置上，打取4～6枚圓片放入試管。然后加入10mL二甲基亞砜，在暗處65 ℃水浴30～60min，至葉片無綠色。取上清液在722N可見光分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司，中國)測定649、665nm吸光值。葉綠素面積質(zhì)量按照Wellburnetal.[17]公式計算。

2.2葉面積質(zhì)量、含水率測定及校正公式建立

每株樣樹摘取與測定SPAD大約同一位置的5枚葉片，裝入有濕潤濾紙的編號塑封袋內(nèi)，帶回實驗室立即測定SPAD值及鮮質(zhì)量(MF)后，利用T210掃描儀掃描(方正科技集團股份有限公司，中國)，使用ImageJ軟件分析葉面積(AL)，最后將樣品置于烘箱中65 ℃烘48h至恒質(zhì)量，稱干質(zhì)量(MD)。葉面積質(zhì)量(MA，mg·cm-2)和含水率(MC，%)分別依據(jù)下列公式計算：MA=MD/AL;MC=((MF-MD)/MF)×100%。

同時，在春、夏、秋季，各樹種分別選取林下、林緣、開闊地不同生境共10株，于晴天上午08:00摘取樣樹樹冠中部南向5枚葉片并編號。通過以上方法測得SPAD及葉綠素面積質(zhì)量建立模型。

測定SPAD日變化當(dāng)天的光量子通量密度數(shù)據(jù)來自生態(tài)站自動氣象站每15min平均數(shù)據(jù)。

2.3數(shù)據(jù)分析

為了便于不同文獻對比，SPAD變化率均采用((最大值-最小值)/最小值)×100%計算。通過單因素方差分析檢驗同一樹種不同測定時間SPAD值、不同樹種不同季節(jié)葉綠素面積質(zhì)量、葉面積質(zhì)量、含水率差異，通過方差齊性檢驗數(shù)據(jù)，采用LSD進行多重比較；未通過者，采用Tamhane’sT2方法檢驗。通過曲線擬合分別建立3個時期各樹種葉綠素面積質(zhì)量與SPAD最優(yōu)方程，并計算不同時間葉綠素面積質(zhì)量估測誤差。誤差=((估測值-實測值)/實測值)×100%。通過Pearson雙變量對葉片SPAD值、單株SPAD值變化率與相應(yīng)的光量子通量密度、葉綠素面積質(zhì)量、葉面積質(zhì)量和含水率進行相關(guān)分析。數(shù)據(jù)分析由SPSS19.0完成，圖表繪制由SigmaPlot10.0實現(xiàn)。

3結(jié)果與分析

3.1不同樹種SPAD值日變化特征

SPAD最大值出現(xiàn)時間因樹種、季節(jié)而異(表1)。紫椴春季、蒙古櫟夏季、胡桃楸、水曲柳、白樺和紫椴秋季最大值出現(xiàn)在08:00—10:00時，占25%，其余最大值出現(xiàn)在12:00—18:00，占75%。但最小值近90%在04:00—06:00出現(xiàn)，偶爾出現(xiàn)在08:00，且與04:00—06:00數(shù)值無差異。8個樹種3個季節(jié)不同測定時間SPAD值約70%差異顯著(P<0.05)，變化率在9%～17%；水曲柳和紫椴春季、蒙古櫟和五角槭夏季、胡桃楸秋季及黃波欏3個季節(jié)各時間點SPAD值差異不顯著(P>0.05)，變化率2%～7%。

3.2不同測定時間SPAD值對估測葉綠素面積質(zhì)量影響

SPAD值日變化差異不顯著的樹種估測誤差在-9%～9%之間(圖1)。SPAD值日變化差異顯著，變化率在9%～16%之間的五角槭和紫椴秋季、春榆和白樺春秋季、胡桃楸春季，誤差在-8%～9%。其余季節(jié)各樹種估測誤差隨樹種和季節(jié)而異，但最大誤差均出現(xiàn)在04:00—06:00，低估葉綠素面積質(zhì)量達10%～20%，蒙古櫟秋季、胡桃楸和紫椴夏季最大誤差低估葉綠素面積質(zhì)量11%～12%；春榆和水曲柳、白樺夏季最大誤差低估葉綠素面積質(zhì)量15%～18%；蒙古櫟春季SPAD變化率最高(17%)，其誤差低估葉綠素面積質(zhì)量達20%；其他時間點誤差絕對值小于9%(除蒙古櫟春季08:00)。

表1　8個闊葉樹種不同季節(jié)SPAD值日變化特征

時刻胡桃楸春夏秋黃波欏春夏秋白樺春夏秋紫椴春夏秋04:00(29.4±0.8)ab(36.0±0.6)c(32.4±0.9)a(30.5±0.8)a(33.0±0.7)a(29.8±0.9)a(25.5±0.7)bc(30.0±0.7)b(33.1±0.7)d (24.6±0.6)a(32.2±1.0)b(31.4±0.8)b06:00(28.1±0.8)b(36.4±0.5)bc(31.5±0.6)a(30.4±0.6)a(32.4±0.5)a(29.2±0.8)a(25.6±0.6)bc(30.9±0.7)b(34.7±0.7)cd(25.0±0.7)a(32.3±1.1)b(32.4±0.7)ab08:00(29.0±0.7)ab(37.9±0.7)ab(33.7±0.6)a(30.0±0.9)a(33.1±0.6)a(30.5±0.6)a(25.3±0.6)c(33.5±0.8)a(37.1±0.8)ab(25.2±0.6)a(34.8±1.1)ab(34.2±0.7)a10:00(29.5±0.7)ab(38.7±0.7)a(33.3±0.5)a(29.9±0.9)a(34.3±0.5)a(30.4±0.7)a(26.0±0.6)bc(33.6±0.9)a(37.4±0.7)a(26.0±0.6)a(34.6±1.2)ab(34.2±0.7)a12:00(29.9±0.7)ab(39.2±0.6)a(32.6±0.7)a(30.6±0.7)a(34.0±0.6)a(30.3±0.8)a(26.5±0.6)abc(33.5±0.8)a(36.9±0.7)abc(25.7±0.6)a(35.4±1.0)a(32.9±0.7)ab14:00(30.4±0.7)a(39.2±0.6)a(32.9±0.9)a(30.9±0.7)a(33.8±0.7)a(30.7±0.8)a(26.8±0.6)abc(33.8±0.8)a(35.9±0.8)abc(25.7±0.5)a(35.1±1.1)ab(32.0±0.7)b16:00(31.1±0.7)a(39.3±0.6)a(33.3±0.7)a(31.4±0.5)a(34.4±1.0)a(31.2±0.8)a(27.0±0.6)ab(34.4±0.7)a(35.4±0.9)abcd(25.9±0.6)a(35.2±1.2)ab(32.2±0.8)ab18:00(30.1±0.7)ab(39.3±0.6)a(32.8±0.8)a(30.7±0.6)a(34.4±0.7)a(31.2±0.5)a(27.7±0.5)a(34.1±0.8)a(34.9±0.9)bcd(25.9±0.6)a(34.4±1.1)ab(32.0±0.8)b變化率0.1060.0920.0690.0530.0650.0700.0920.1470.1290.0580.0990.089

注：表中括號內(nèi)數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤；同列不同小寫字母代表同一樹種同一季節(jié)內(nèi)不同測定時刻SPAD值的差異(P<0.05)。

圖1　8個闊葉樹種不同季節(jié)不同測定時間SPAD值估測葉綠素面積質(zhì)量誤差

3.3不同樹種葉片指標(biāo)及其與SPAD值、SPAD變化率相關(guān)性

8個樹種葉綠素面積質(zhì)量、葉面積質(zhì)量夏季最高，含水率春季最高(表2)。除蒙古櫟夏秋葉綠素面積質(zhì)量高達57μg·cm-2，春榆、胡桃楸和五角槭夏季在40.0～41.3μg·cm-2，其他在16.1～37.4μg·cm-2。8個樹種夏季水曲柳葉面積質(zhì)量最高、其次為白樺，五角槭最低。8個樹種春夏秋季葉片含水率分別在71%～78%、61%～68%、58%～69%。

不同時期8個樹種葉片SPAD值與葉綠素面積質(zhì)量呈顯著正相關(guān)的占近70%(表3)；與光量子通量密度、葉面積質(zhì)量、含水率分別呈顯著正相關(guān)、正相關(guān)、負(fù)相關(guān)，依次占50%、30%和20%。各樹種3個季節(jié)合并數(shù)據(jù)與光量子通量密度相關(guān)不顯著，與葉綠素面積質(zhì)量呈顯著正相關(guān)；除水曲柳，其余樹種SPAD值與葉面積質(zhì)量呈顯著正相關(guān)、與含水率呈顯著負(fù)相關(guān)。SPAD變化率與光量子通量密度、葉綠素面積質(zhì)量、葉面積質(zhì)量和葉片含水率相關(guān)性均不顯著。

表2　不同樹種葉片葉綠素面積質(zhì)量、葉面積質(zhì)量及含水率特征

注：表中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤；同行不同小寫字母表示同一樹種不同季節(jié)該指標(biāo)的差異(P<0.05)，同列不同大寫字母表示同一季節(jié)不同樹種該指標(biāo)的差異(P<0.05)。

表3　SPAD值及單株SPAD變化率與光量子通量密度、葉綠素面積質(zhì)量、葉面積質(zhì)量、含水率相關(guān)系數(shù)

注：各季節(jié)各樹種葉片SPAD值與光量子通量密度樣本數(shù)均為8株；葉綠素面積質(zhì)量、葉面積質(zhì)量和含水率樣本數(shù)均為15株；各季節(jié)各樹種單株SPAD變化率與以上4個指標(biāo)樣本數(shù)均為24；** 、*分別代表0.01和0.05水平差異顯著。

4結(jié)論與討論

多項研究表明，SPAD值具有明顯的日變化現(xiàn)象，其主要因素是太陽輻射及葉片特性，但研究結(jié)果卻不盡相同。

首先使用葉綠素儀時，應(yīng)考慮光照輻射這一重要因素。如溫室冬小麥(Triticum aestivum)、白花酢漿草(Oxalis acetosella)和煙草(Nicotiana tabacumcv. Samsun)SPAD值隨著光量子通量密度增強而下降，變化率分別為9%、18%、16%[11，13]。而溫室煙草(光量子通量密度最大值70μmol·m-2·s-1，8h黑暗/16h光照)SPAD值隨輻射增強而升高，變化率達14%[13]，然而溫室油菜canola(Brassica napus)、冬小麥(Triticum aestivum)、大麥(Hordeum vulgare)、馬鈴薯(Solanum tuberosum)和玉米(Zea mays)SPAD值并不受輻射的影響[18]。本文SPAD日變化與光量子通量密度具顯著正相關(guān)的占近一半，這與Nau?etal[13]研究結(jié)果一致。但除各測定時間SPAD值無顯著差異的樹種與光量子通量密度相關(guān)性不顯著外，SPAD值差異顯著、變化率9%～16%的春榆、胡桃楸和白樺(春季)，白樺(夏季)、水曲柳和紫椴(秋季)也與光量子通量密度相關(guān)性不顯著,即該樹種該季節(jié)SPAD日變化對輻射并無響應(yīng)，應(yīng)考慮其他因素。

葉片特性包括葉綠素面積質(zhì)量、葉面積質(zhì)量和含水率。有研究表明輻射對SPAD值影響與葉片葉綠素面積質(zhì)量有關(guān)。葉綠素面積質(zhì)量高時，葉綠體隨著輻射強度而移動其位置導(dǎo)致葉綠素分布不均勻，進而強烈影響SPAD值；而低葉綠素?zé)o此現(xiàn)象發(fā)生[8，11]。熱帶樹種無隔囊木棉(Matisia cordata)和秘魯橡膠樹(Hevea guianensis)葉綠素分別為652、500mg·m-2，SPAD值隨輻射增強而下降，變化率達11%～23%；而葉綠素低于357mg·m-2的擬龍血巴豆(Croton draconoides)和孿葉豆(Hymenaea courbaril)SPAD值并未隨光強而發(fā)生變化[14]。但Martínezetal[12]發(fā)現(xiàn)溫室及田間玉米葉綠素分別為16.1～17.5、20～21μg·cm-2，SPAD值隨輻射增強而升高，變化率達8%、13%[12]。本文測定葉片8個不同位置讀數(shù)的平均值代表葉片值[19-21]，基本上消除了由于葉綠素分布不均勻?qū)PAD的影響。蒙古櫟夏秋季葉綠素面積質(zhì)量最高(57.7、57.1μg·cm-2)，但SPAD變化率只有2%、9%；春榆、胡桃楸和五角槭夏季質(zhì)量濃度在40.0～41.3μg·cm-2之間，SPAD變化率在5%～12%。而葉綠素面積質(zhì)量最低的五角槭春季、水曲柳秋季變化率高于葉綠素高樹種。

葉片含水率及葉片厚度影響光線透過葉片透射系數(shù)，進而影響葉綠素儀讀數(shù)[22]。葉綠素儀已通過遠紅外940nm參考波長消除葉片含水率及葉厚的影響，但研究結(jié)果仍具有不確定性。已有研究表明SPAD值與葉片含水率正相關(guān)[23-24]、負(fù)相關(guān)[12，25-26]，甚至兩者間根本無關(guān)[14，27-28]。與葉面積質(zhì)量也有正相關(guān)[24-25，29-33]、負(fù)相關(guān)[34]和無關(guān)[20，35-37]。本文中8個樹種各季節(jié)SPAD值與葉面積質(zhì)量、含水率相關(guān)性顯著的僅占1/3、1/5。但總體數(shù)據(jù)除了水曲柳，其余樹種SPAD值與含水率顯著負(fù)相關(guān)，與葉面積質(zhì)量顯著正相關(guān)。即04:00—06:00間SPAD值較低可能與含水率有關(guān)。但單株SPAD變化率與以上4個因素均無明顯關(guān)系。

對于SPAD日變化，盡管其影響因素較難區(qū)分，但基于研究對象、生境等因素的不同，有研究建議其測定時間應(yīng)在06:00[25]、08:00—10:00[12]、10:00和12:00[13，38]、10:00—16:00[19]，或黑暗環(huán)境[5]以獲得準(zhǔn)確穩(wěn)定測定結(jié)果。而本文結(jié)果是盡管不同樹種葉片特性在不同生長時期具有一定差異，但8個闊葉樹種SPAD最小值多出現(xiàn)在04:00—06:00，導(dǎo)致誤差低估葉綠素面積質(zhì)量達10%～20%，其他時間段誤差在±9%內(nèi)(除了蒙古櫟春季)。因此對于東北東部闊葉樹種SPAD值適當(dāng)?shù)臏y定時間是08:00—18:00。

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第一作者簡介：李改艷，女，1989年12月生，東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，碩士研究生。E-mail:1106131938@qq.com。 通信作者：孫慧珍，東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，副教授。E-mail:sunhz-cf@nefu.edu.cn。

收稿日期：2016年1月6日。

分類號Q945.79

EffectofSPADMeasurementTimeonEstimatingChlorophyllContentandItsRelatedFactors//

LiGaiyan,ChenKangkang,SunHuizhen

(NortheastForestryUniversity,Harbin150040,P.R.China)//JournalofNortheastForestryUniversity，2016,44(8)：44-48，60.

WestudiedthediurnalcharacteristicsofSPADvalues,andcalculatedtheestimationerrorsfromdifferentmeasurementtimeofSPADusingtheportablenondestructiveopticalchlorophyllmetersSPAD-502forQuercus mongolica, Acer mono, Ulmus japonica, Fraxinus mandshurica, Juglans mandshurica, Phellodendron amurense, Betula platyphylla,andTilia amurensisinnortheastChina.ThediurnalmaximumSPADvaluesmostlyoccurredbetween12:00to18:00,andminimumvaluesin04:00-06:00,withthevariationin2%-17%incleardaysduringthegrowingseason.Minimumestimationerrorwere10%-20%foreighttreespecies,occurringin04:00-06:00,whileerrorwaswithin±9%duringtheothermeasurementtimeperiodexceptfortheSpringofQ. mongolica.ThecorrelationbetweenleafSPADandPPFD(photosyntheticphotonfluxdensity),chlorophyllcontent,LMA(leafmassarea),andLWC(leafwatercontent)wasnotconsistentwithtreespeciesandmeasurementperiod.TheSPADmeasurementtimewasbetterin08:00-18:00innortheastChina.

KeywordsDiurnal characteristics of SPAD; Chlorophyll content; Estimation error

1)國家自然科學(xué)基金項目(31300507)；國家“十二五”科技支撐項目(2011BAD37B01)資助。

責(zé)任編輯：潘華。