楊　　濤，王凈凈*，陶　　琳，鐘喬青，吳彬才

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.衡陽(yáng)市江東中醫(yī)院，湖南 衡陽(yáng) 421002）

補(bǔ)腎祛痰活血湯對(duì)缺血再灌注損傷大鼠Occludin、ZO-1蛋白的調(diào)節(jié)作用

楊濤1，2，王凈凈1*，陶琳1，鐘喬青1，吳彬才1

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.衡陽(yáng)市江東中醫(yī)院，湖南 衡陽(yáng) 421002）

目的 觀察補(bǔ)腎祛痰活血湯對(duì)預(yù)處理腦缺血再灌注損傷的大鼠腦組織水腫、血腦屏障通透性及損傷區(qū)咬合蛋白（Occludin）、閉鎖小帶蛋白（zonula occludens-1，ZO-1）的影響。方法 SD成年雄性大鼠50只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、假手術(shù)組、治療組、對(duì)照組，每組10只。治療組給補(bǔ)腎祛痰活血湯、對(duì)照組給消栓通絡(luò)膠囊，正常組、模型組、假手術(shù)組給與相應(yīng)量的雙蒸餾水。采用線栓法復(fù)制腦缺血再灌注損傷模型，72 h后，干濕重法測(cè)定腦含水量反映腦水腫程度，用免疫組織化學(xué)方法測(cè)定損傷區(qū)Occludin、ZO-1蛋白的表達(dá)量，并對(duì)各結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果 與正常組、假手術(shù)組比較，模型組、治療組、對(duì)照組72 h時(shí)間點(diǎn)大鼠腦組織含水量較正常組、假手術(shù)組要增高一些，腦組織損傷區(qū)周圍Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01）。腦組織含水量與腦組織損傷程度正相關(guān)，腦組織損傷區(qū)周圍Occludin、ZO-1蛋白與腦組織損傷程度呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論 補(bǔ)腎祛痰活血湯對(duì)缺血性腦損傷發(fā)生后損傷區(qū)Occludin、ZO-1蛋白含量降低有抑制作用，抑制血腦屏障通透性增高，減輕腦水腫形成。

補(bǔ)腎祛痰活血湯；咬合蛋白；閉鎖小帶蛋白；腦缺血再灌注損傷模型；制附子；桂枝；熟地黃

〔Abstract〕Objective To investigate the effect of Bushen Huoxue decoction on rat brain edema，blood brain barrier permeability，damage zone occlusal protein（occludin），zonula occludens（ZO-1）proteinin pretreatment ischemia reperfusion injury rats.Methods Fifty SD adult male rats were divided into normal group，model group，sham operation group，treatment group，control group according to the random number table method，10 rats in each group.The treatment group was given Bushen Huoxue decoction，while the control group was given Xiaoshuan Tongluo capsule.The normal group，model group，sham operation group were given the corresponding double distilled water.The model of cerebral ischemia-reperfusion injury was established by suture method.After 72 hours，the brain water content was determined by dry wet weight method to reflect the degree of brain edema.The damage zone occludin and ZO-1 protein expression were tested by immunohistochemical method，and the results were analyzed by correlation analysis.Results Compared with the normal group and sham operation group，the brain tissue water content in rats at 72 h of model group，treatment group and control group was increased，the occludin and ZO-1 protein expression in brain tissue damage zone were significantly decreased（P＜0.01）.The water content of brain tissuewas positively correlated with the degree of brain tissue injury，ZO-1 and occludin protein were negatively correlated with the degree of brain tissue injury.Conclusion Bushen Quyu Huoxue decoction can inhibite the decrease of occludin and ZO-1 protein，inhibite the blood brain barrier permeability and relieve brain edema formation.

〔Keywords〕Bushen Huoxue decoction；occludin；zonula occludens protein；cerebral ischemia reperfusion injury model；prepared monkshood；Cassia Twig；prepared rehmannia root

腦卒中是神經(jīng)系統(tǒng)較為常見(jiàn)疾病之一，是死亡較高的三大疾病之一。在腦血管疾病中，最常見(jiàn)的是缺血性腦卒中，約占60%～80%。迅速重建梗塞區(qū)域血流供應(yīng)能顯著改善缺血性腦卒中預(yù)后［1］。中醫(yī)藥對(duì)急性期及恢復(fù)期腦梗所致的神經(jīng)功能缺損的有改善的作用。常以益氣活血通絡(luò)、化痰通腑為治療法則，較少提及溫陽(yáng)治法。本研究將溫陽(yáng)通絡(luò)為主的補(bǔ)腎祛痰活血湯作用于預(yù)處理腦缺血再灌注損傷大鼠，探討其預(yù)防保護(hù)作用與機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物健康雄性SPF級(jí)SD大鼠50只，鼠齡6-8周，體質(zhì)量180～220 g，由湖南斯萊克景達(dá)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物使用許可證編號(hào)：SYXK（湘）2013-0005。

1.1.2受試藥物補(bǔ)腎祛痰活血湯：由制附子10 g（先煎），桂枝10 g，熟地黃10 g，山茱萸10 g，山藥10 g，巴戟天10 g，肉蓯蓉10 g，石菖蒲10 g，遠(yuǎn)志10 g，黃芪30 g，水蛭3 g，當(dāng)歸10 g，川芎10 g，丹參10 g，牡丹皮10 g，桃仁10 g，防風(fēng)10 g，刺蒺藜10 g，地龍10 g，甘草5 g等23味藥組成，以上飲片由湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)附屬第一醫(yī)院中藥房提供，228 g/劑，加水煎煮濃縮為114 mL，含生藥2 g/mL。消栓通絡(luò)膠囊：由川芎，丹參，黃芪，澤瀉，三七，槐花，桂枝，郁金，木香，冰片，山楂11味藥組成（吉林省東北亞藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z10940067，0.37 g/粒），6粒溶散于114 mL雙蒸水，含生藥0.019 5 g/mL。

1.1.3試劑及儀器一抗試劑Rabbit-anti-Occ（Cat Number bs10011R、Lot類型AD081219），一抗Rabbitanti-ZO-1（Cat Number bs1329R、Lot類型AD120439），均購(gòu)自北京奧博森生物技術(shù)有限公司；二抗試劑通用型（批號(hào)：K152318A），購(gòu)自北京中杉金橋，Motic B5顯微攝像圖像分析系統(tǒng) （麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)公司）；S2-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器 （上海亞榮生化儀器廠）；Shandon325型石蠟切片機(jī)（英國(guó)Shandon公司產(chǎn)）；LEICA DM LB型雙目顯微鏡 （德國(guó)LEICA公司產(chǎn)）。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組及造模［2］SD大鼠經(jīng)過(guò)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組、治療組、對(duì)照組，共5組，每組10只。實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組、模型組造模，將SD大鼠麻醉后固定于操作臺(tái)，從其右頸部逐層切開(kāi)，將頸總動(dòng)脈分離出來(lái)，分離出頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，將頸總動(dòng)脈近分支端用血管夾鉗夾，頸外動(dòng)脈結(jié)扎，近頸總動(dòng)脈段將頸內(nèi)動(dòng)脈斜形切開(kāi)，將3.0的魚(yú)線插入大腦中動(dòng)脈，進(jìn)行栓塞，用線打結(jié)固定線栓，于傷口處覆蓋濕潤(rùn)生理鹽水紗布，1.5 h后，將線栓拔出，逐層縫合，傷口絡(luò)合碘消毒，1 h后再進(jìn)行評(píng)分。模型評(píng)定：0分為肢體活動(dòng)正常；1分為提尾懸空后不能伸展對(duì)側(cè)前爪；2分為行走向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分為行走困難，并向?qū)?cè)傾倒；4分為不能自發(fā)行走或昏迷。1-3分的納入實(shí)驗(yàn)：模型組2分的7只，3分的1只。治療組2分的5只，3分的3只，對(duì)照組1分的1只，2分的7只。假手術(shù)組造模，大鼠麻醉后固定于操作臺(tái)，從其右頸部逐層切開(kāi)，將頸總動(dòng)脈分離出來(lái)，分離出頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，頸總動(dòng)脈后，頸內(nèi)動(dòng)脈不切開(kāi)，不插入線栓，立即逐層縫［3］。正常組未做處理。

1.2.2藥物干預(yù)正常組、假手術(shù)組和模型組按11 ml/（kg·d）的雙蒸餾水灌胃給藥。治療組以補(bǔ)腎祛痰活血湯濃縮成114 mL，按23 g/（kg·d）灌胃給藥［4］。對(duì)照組給予消栓通絡(luò)膠囊，將6粒膠囊溶散于114 mL雙蒸水，按0.224 g/（kg·d）給藥。給藥3 d后，將治療組、對(duì)照組、模型組造模，假手術(shù)組按相關(guān)方案處理，造模后第2天各組灌胃相應(yīng)的雙蒸水或藥物，3 d后，將所有實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行標(biāo)本取材及檢測(cè)。

1.2.3腦水腫程度測(cè)定采用干濕重法測(cè)定腦組織含水量。各組取8只大鼠，水合氯醛腹部注射麻醉后，尾靜脈按體質(zhì)量注射EB，運(yùn)用2%EB按0.2 mL/100 g注射，身體及雙眼變藍(lán)1 h，心內(nèi)注入生理鹽水，直到右心耳漏出清涼液體，迅速斷頭，取出左側(cè)前端大腦皮質(zhì)100 mg，用電子天平稱其濕重后，置入60℃烤箱中烤干24 h至恒重。腦組織含水量=（濕重—干重）÷濕重×100%。

1.2.4免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)相關(guān)因子的表達(dá)將所取的左側(cè)大腦組織入4%多聚甲醛固定24 h以上，遞度乙醇脫水，石蠟包埋，切片厚4～5 μm，鋪片，烤片，染色，封片，干后鏡下觀察并顯微鏡采圖。切片脫蠟，水化組織切片，3%雙氧水阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，入PBS修復(fù)液置微波爐修復(fù)抗原，冷至室溫，PBS沖洗，加1∶100一抗Rabbit-anti-Occludin/Rabbit-anti-ZO-1，每片50 μL，4°C過(guò)夜，PBS漂洗，滴加試劑1聚合物捕助劑每片50 μL，滴加二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗，DAB顯色，鏡下控制，水洗，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片，鏡下觀察并拍照。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1腦組織含水量

正常組、假手術(shù)組、治療組、對(duì)照組與模型組比較，正常組與假手術(shù)組沒(méi)有明顯差異（P＞0.05），治療組、對(duì)照組各組腦含水量較模型組明顯減低 （P＜0.01）。治療組較對(duì)照組能更好減輕腦組織水腫（P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2HE染色結(jié)果

實(shí)驗(yàn)大鼠左側(cè)大腦海馬C2區(qū)，正常組與假手術(shù)組胞核成圓行，核質(zhì)分布均勻，核仁明顯，清晰圓潤(rùn)。模型組胞核固縮，塌陷，核質(zhì)不清晰，部分細(xì)胞壞死消失，膠質(zhì)細(xì)胞增生，較其他組壞死比例明顯增加。治療組較對(duì)照組壞死細(xì)胞減少。補(bǔ)腎祛痰活血湯較消栓通絡(luò)膠囊能更好地保護(hù)腦組織，減少腦細(xì)胞破壞。見(jiàn)圖1。

圖1大鼠腦組織染色形態(tài)光鏡圖（HE×400）

2.3各組Occludin與ZO-1表達(dá)的比較

實(shí)驗(yàn)大鼠左側(cè)大腦海馬C2區(qū)Occludin陽(yáng)性表達(dá)為棕黃色。正常組、假手術(shù)組胞質(zhì)強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，胞核弱陽(yáng)性表達(dá)，細(xì)胞外組織表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性。模型組胞核表達(dá)弱陽(yáng)性，細(xì)胞外表達(dá)弱陽(yáng)性，少部分細(xì)胞核呈陽(yáng)性表達(dá)，壞死的細(xì)胞核固縮。治療組、對(duì)照組胞核弱陽(yáng)性表達(dá)，胞外突起表達(dá)呈中陽(yáng)性，。實(shí)驗(yàn)大鼠左側(cè)大腦海馬C2區(qū)ZO-1陽(yáng)性表達(dá)為棕黃色。正常組、假手術(shù)組胞核胞質(zhì)均有表達(dá)，胞外陽(yáng)性表達(dá)豐富，治療組部分細(xì)胞壞死。模型組ZO-1海馬部位細(xì)胞無(wú)表達(dá)，胞外弱陽(yáng)性，較多細(xì)胞壞死。對(duì)照組、治療組ZO-1表達(dá)呈中陽(yáng)性，部分細(xì)胞壞死，與正常組和假手術(shù)組比較，模型組Occludin、ZO-1光密度值均下降 （P＜0.01）；與模型組比較，治療組與對(duì)照組Occludin、ZO-1光密度值均升高（P＜0.01），且治療組優(yōu)于對(duì)照組（P＜0.01）。說(shuō)明補(bǔ)腎祛痰活血湯較消栓通絡(luò)膠囊能更好調(diào)節(jié)Occludin、ZO-1的表達(dá)，減少腦組織損傷。見(jiàn)表1，圖2-3。

圖2大鼠腦組織Occludin的表達(dá)光鏡圖（免疫組化×400）

圖3大鼠腦組織ZO-1的表達(dá)光鏡圖（免疫組化×400）

3討論

模型鼠大腦局部梗塞后，血腦屏障功能破壞，腦組織功能受損傷。病灶中心區(qū)腦組織發(fā)生損害多為不可逆性，其周圍半暗帶區(qū)神經(jīng)組織損害可逆，盡早解除梗塞，尤為重要?；謴?fù)血流可縮小甚至消除梗塞，改善腦組織功能，促進(jìn)神經(jīng)再生，還能多環(huán)節(jié)干預(yù)包括神經(jīng)細(xì)胞凋亡在內(nèi)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)［5］。血腦屏障是腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、其間的緊密連接、基底膜下星型膠質(zhì)細(xì)胞周足及基底膜構(gòu)成的屏障［6］。緊密連接是維持血腦屏障功能與的結(jié)構(gòu)重要基礎(chǔ)［7］。緊密連接〔Tihgt junction.TJ〕存在于細(xì)胞間，對(duì)于細(xì)胞旁路途徑（屏障功能）的調(diào)控具有重要意義。occludin蛋白是構(gòu)成TJ的重要跨膜蛋白，對(duì)其組成和屏障功能維持起到了重要作用［8］。ZO-1表達(dá)水平的高低與血腦屏障的通透性密切相關(guān)［9］，occludin及 ZO-1蛋白表達(dá)的變化可能是血腦屏障通透性改變的分子基礎(chǔ)之一。ZO-1蛋白的變化幅度高于Occludin蛋白，位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的 ZO-1蛋白對(duì)缺血再灌注的刺激更為敏感，偏向于調(diào)節(jié)作用，而跨膜蛋白Occludin則更偏向于維持TJ形態(tài)和功能［10］。Occludin存在于腦血管內(nèi)皮細(xì)胞間的TJ處，對(duì)于維持BBB的生理功能具有重要作用。Occludin的羧基端與ZO-1的PDz結(jié)構(gòu)域相連，ZO-1作為細(xì)胞骨架的連接者，協(xié)助Occludin與細(xì)胞骨架的聯(lián)系，維持內(nèi)皮細(xì)胞間的連接和細(xì)胞信號(hào)的傳導(dǎo)等。在某些病理因素的參與下，TJ的功能下降，細(xì)胞間的通透性增高，而Occludin是衡量TJ功能變化的重要指標(biāo)之一，TNF-α影響B(tài)BB的靶位點(diǎn)可能存在于對(duì)Occludin的mRNA的轉(zhuǎn)錄與蛋白質(zhì)的表達(dá)有調(diào)控作用［11］。筆者將大鼠進(jìn)行腦缺血再灌注，運(yùn)用在王凈凈老師經(jīng)驗(yàn)方化瘀通絡(luò)復(fù)步湯［12］的基礎(chǔ)上，經(jīng)王老師指導(dǎo)擬定的補(bǔ)腎祛痰活血湯進(jìn)行治療。本方針對(duì)陽(yáng)化氣，陰成形設(shè)計(jì)。陽(yáng)虛不化濕，濕聚成痰，痰瘀管壁，日久瘀而不通，而發(fā)中風(fēng)，即西醫(yī)所說(shuō)的缺血性腦卒中。從補(bǔ)腎入手，本虛標(biāo)實(shí)，腎為先天之本，故用制附子為君藥，附子可溫通陽(yáng)，暖命門(mén)，溫坎水，破陰凝，可謂是扶陽(yáng)第一要藥。桂枝、巴戟天、肉蓯蓉為臣藥，溫陽(yáng)化氣，痰瘀得溫而化，熟地、山茱萸為佐藥，佐助附子，善補(bǔ)陽(yáng)者，陰中求陽(yáng)。石菖蒲、遠(yuǎn)志祛痰，水蛭、當(dāng)歸、川芎、丹參、桃仁活血祛瘀，防風(fēng)、刺蒺藜有祛風(fēng)之效，多靶點(diǎn)、多系統(tǒng)、全方位治療。從現(xiàn)代藥理學(xué)來(lái)看：附子有消炎鎮(zhèn)靜的作用。桂枝有抗炎抗菌的作用，能解除毛細(xì)血管的收縮，降低血漿纖維蛋白原含量，降低血漿粘度，有助于血細(xì)胞表面電荷的充分暴露和變形活動(dòng)，從而使全血黏度降低，改善組織循環(huán)，使病變組織逆轉(zhuǎn)修復(fù)。當(dāng)歸、川芎、桃仁、具有擴(kuò)張血管、增強(qiáng)腦血流量、改善腦部血液循環(huán)、改善血液流變性、降低血脂、改善腦缺氧及促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)等作用［13］，刺蒺藜可降壓，紅景天可以提高血紅蛋白與氧的結(jié)合能力。實(shí)驗(yàn)研究表明，Occludin與ZO-1蛋白表達(dá)越強(qiáng)，血腦屏障損傷越少，補(bǔ)腎祛痰活血湯能提升缺血性腦損傷區(qū)腦組織Occludin與ZO-1蛋白的表達(dá)，保護(hù)血腦屏障的緊密連接，改善血腦屏障的通透性。補(bǔ)腎祛痰活血湯對(duì)緊密連接關(guān)系密切的ZO-1、Occludin蛋白有較好調(diào)控作用，具體作用與調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究，為治療缺血性腦卒中患者研究提供更多的思路，為臨床治療帶來(lái)新的啟示。

表1各組腦組織含水量、Occludin及ZO-1的比較　?。ā纒）

表1各組腦組織含水量、Occludin及ZO-1的比較　?。ā纒）

注：與假手術(shù)組比較△△P＜0.01；與模型組比較▲▲P＜0.01；與對(duì)照組比較##P＜0.01。

組別　n　　腦組織含水量（%）　Occludin光密度值　ZO-1光密度值正常組　8　0.805 0±0.009 3　0.336 2±0.020 7　0.515 0±0.017 7假手術(shù)組　8　0.802 5±0.012 8　0.335 0±0.020 0　0.516 0±0.026 1模型組　8　0.888 7±0.012 5△△　0.173 8±0.020 7△△　0.281 3±0.025 9△△治療組　8　0.835 0±0.009 3△△▲▲##　0.260 0±0.011 9△△▲▲##　0.441 3±0.025 3△△▲▲##對(duì)照組　8　0.853 7±0.010 6△△▲▲　0.220 0±0.0119△△▲▲　0.330 0±0.016 0△△▲▲F值　85.771　132.224　104.361 P值　0.000　0.000　0.000

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（本文編輯楊瑛）

The Effect of Bushen Huoxue Decoction through Regulating ZO-1 and Occludin Proteins in Ischemia Reperfusion Injury Model Rats

YANG Tao1，2，WANG Jingjing1*，TAO Lin1，ZHONG Qiaoqing1，WU Bincai1
（1．Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410208，China；2.Jiangdong Hospital of Traditional Chinese Medicine，Hengyang，Hunan 421002，China）

R285.5；R278

B

10.3969/j.issn.1674－070X.2016.08.006

2016-03-15

衡陽(yáng)市科學(xué)技術(shù)局科技計(jì)劃發(fā)展項(xiàng)目項(xiàng)目編號(hào)（2014KJ63）。

楊濤，男，在讀碩士研究生，副主任醫(yī)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合腦血管疾病防治。

*王凈凈，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：wangjingjing1954@163.com。