賴家玲，付文垚，何欣，肖川云，曹俊

（江西省九江學(xué)院 1.臨床醫(yī)學(xué)院，2.藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西 九江 332000）

香菜揮發(fā)油體外抑制Saos-2細(xì)胞生長(zhǎng)與遷移*

賴家玲1，付文垚2，何欣2，肖川云2，曹俊3

（江西省九江學(xué)院 1.臨床醫(yī)學(xué)院，2.藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西 九江 332000）

目的探討香菜揮發(fā)油對(duì)Saos-2腫瘤細(xì)胞株體外生長(zhǎng)及遷移的影響。方法采用超聲波輔助醇提法制備香菜揮發(fā)油；M TT法檢測(cè)香菜揮發(fā)油對(duì)Saos-2細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用；Trans w el l趨化小室檢測(cè)細(xì)胞遷移抑制作用；定量PC R檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)P21C i p1/W af1、P27Ki p1、N M23H1和S100A4的表達(dá)變化。結(jié)果使用超聲輔助醇提法，香菜揮發(fā)油得率為0.424%；香菜揮發(fā)油可明顯抑制Saos-2細(xì)胞的生長(zhǎng)與遷移，伴隨細(xì)胞內(nèi)P21 C i p1/W af1及P27Ki p1的升高及S100A4降低，顯示具有較強(qiáng)的抗成骨肉瘤活性。結(jié)論香菜揮發(fā)油可體外抑制Saos-2細(xì)胞生長(zhǎng)及遷移，其可能機(jī)制與P21C i p1/W af1、P27Ki p1及S100A4有關(guān)。

香菜揮發(fā)油；抗腫瘤；P21C i p1/W af1；P27Ki p1；S100A4

香菜又名芫荽、胡荽、香荽等，屬傘形科芫荽屬。香菜營(yíng)養(yǎng)豐富，并有強(qiáng)烈氣味，其莖葉常作為日常蔬菜和調(diào)香料。研究顯示香菜還具有多種藥理作用，其主要藥理成分包括揮發(fā)油及黃酮等，已知香菜揮發(fā)油具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤和促毛發(fā)生長(zhǎng)等多種活性［1-4］。本研究采用超聲波輔助醇溶劑法制備香菜揮發(fā)油，探討其對(duì)人成骨肉瘤細(xì)胞株Saos-2的生長(zhǎng)及遷移的作用，同時(shí)檢測(cè)胞內(nèi)抑癌基因P21Ci p1/W af1、P27Ki p1及腫瘤遷移相關(guān)基因NM23H1和S100A4含量的變化，從分子水平明確香菜揮發(fā)油抑制細(xì)胞生長(zhǎng)及遷移的機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料

香菜（購(gòu)自九江市超市），Saos-2細(xì)胞株（來自江西省系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室），槲皮素（購(gòu)自美國(guó) Si gm a公司），F(xiàn)BS（購(gòu)自 H ycl one公司），RPM I 1640培養(yǎng)基（購(gòu)自吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司），Transwel l cam ber（購(gòu)于 Corni ng公司），噻唑藍(lán)（m et hyl t hi azol yl t et razol i um，M TT）（Am resco公司，由北京索萊寶分裝），GoScri pt Reverse Transcri pt i on Syst em（購(gòu)自Prom ega公司），Tri zol（購(gòu)自Invi t rogen公司），SYBR Prem i x Ex TaqⅡ（Tl i RNaseH Pl us）（購(gòu)自TaKaRa公司）。

1.2儀器與設(shè)備

超聲波清洗機(jī)（南昌市化學(xué)儀器有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市宇翔儀器有限公司），粉碎機(jī)（上海市亞榮生化儀器廠），重光IBE2000型倒置熒光顯微鏡（中國(guó)重慶光電儀器有限公司），5420-1型二氧化碳CO2培養(yǎng)箱（日本Napco公司），Bi o-Rad 550型酶標(biāo)儀（美國(guó)伯樂公司），ABI7500型熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司），NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)（美國(guó)賽默飛世爾公司）。

1.3方法

1.3.1香菜揮發(fā)油的制備香菜莖葉經(jīng)太陽(yáng)照射6 h除去表面的水分，放入恒溫干燥箱中干燥24 h，粉碎后超低溫條件下保存。取粉末50 g放入500 m l的燒杯并加入200 m l無水乙醇。攪拌至粉末充分浸潤(rùn)，并蓋上保鮮膜。70℃超聲波提取3次，每次20 m i n，超聲工作頻率為99 H z。加入無水硫酸鈉干燥，制得0.212 g揮發(fā)油固體。加入無水乙醇使揮發(fā)油溶解，配制成濃度為1.0、0.8、0.6及0.4 m g/m l的香菜揮發(fā)油母液，取上述母液分別加入RPM I 1640培養(yǎng)基，配成濃度為5、4、3及2μg/m l的細(xì)胞培養(yǎng)液，各組培養(yǎng)液中乙醇的終濃度均為0.5%。

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng)及M TT細(xì)胞培養(yǎng)人成骨肉瘤細(xì)胞株Saos-2采用RPM I 1640培養(yǎng)基（含10%FBS、1%雙抗）培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，每隔72 h換液1次。M TT：于96孔板內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞，每孔接種1萬個(gè)，貼壁后分別加入4種含不同濃度的香菜揮發(fā)油（5、4、3及 2μg/m l）培養(yǎng)基培養(yǎng)，每孔200μl，空白對(duì)照組為含0.5%乙醇培養(yǎng)基，陽(yáng)性對(duì)照組采用400μg/m l槲皮素。培養(yǎng)72 h后于重光IBE2000型倒置熒光顯微鏡拍照記錄，棄去上清，每孔加入M TT試劑150μl，4 h后棄去上清再加入DM SO 200μl進(jìn)行溶解，置于Bi o-Rad 550型酶標(biāo)儀，測(cè)其OD值，計(jì)算出細(xì)胞生長(zhǎng)活性度。細(xì)胞生長(zhǎng)活性度=［1-（對(duì)照組平均OD值-實(shí)驗(yàn)組平均OD值）/對(duì)照組平均OD值］×100%。

1.3.3細(xì)胞遷移抑制檢測(cè)①Saos-2細(xì)胞消化后用含0.1%FBS培養(yǎng)基重懸，并調(diào)整細(xì)胞密度至1× 105，培養(yǎng)基中分別含終濃度5μg/m l的香菜揮發(fā)油及0.5%的乙醇。②取細(xì)胞懸液200μl加入t ranswel l cam ber趨化小室上室，下室中加入600μl含10%FBS的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。③將上室從24孔板中取出，用棉簽擦去上室內(nèi)的細(xì)胞，然后放入0.1%結(jié)晶紫中染色20 m i n，再用三蒸水沖洗3遍，在光鏡下觀察穿膜細(xì)胞數(shù)。采用10×物鏡，每個(gè)小室取6個(gè)視野，計(jì)算各視野細(xì)胞數(shù)目，拍照并保存。細(xì)胞遷移抑制率=［（對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)－香菜揮發(fā)油組遷移細(xì)胞數(shù)）/對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)］×100%。

1.3.4熒光定量PC R5μg/ml的香菜揮發(fā)油處理Saos-2細(xì)胞72 h，以0.5%的乙醇作為對(duì)照，Tri zol法提取細(xì)胞總RNA，Nanodrop 2000測(cè)定純度，采用GoScri ptReverse Transcri pt i on Syst em（Prom ega）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，操作按試劑盒說明書進(jìn)行；定量PCR擴(kuò)增采用SYBR Prem i x Ex TaqⅡ（Tl i RNaseH Pl us），在ABI7500型熒光定量PCR儀上檢測(cè)，PCR程序?yàn)?5℃預(yù)變性30 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，共40循環(huán)。以ACTB作為內(nèi)參，目的基因表達(dá)水平采用2-△△CT法進(jìn)行分析，所有基因檢測(cè)均重復(fù)3次（見表1）。

表1　實(shí)時(shí)PC R引物序列

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

圖1　香菜揮發(fā)油抑制Saos-2的生長(zhǎng) （×40）

圖2　香菜揮發(fā)油體外抑制Saos-2的遷移 （×100）

2　結(jié)果

2.1香菜揮發(fā)油得率

用電子分析天平精密稱量香菜揮發(fā)油質(zhì)量為0.212 g，而總的質(zhì)量為50 g，計(jì)算揮發(fā)油的得率為0.424%。

2.2M TT結(jié)果

各組細(xì)胞活性與藥物劑量成反比，提示抑制作用呈劑量依賴性（見表2），香菜揮發(fā)油具有明顯抑制Saos-2細(xì)胞生長(zhǎng)的作用（見圖1）。

2.3遷移抑制結(jié)果

在香菜揮發(fā)油5μg/m l組，對(duì)Saos-2細(xì)胞t ranswel l趨化小室的上室底膜反面10倍物鏡下6個(gè)視野細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為2、4、3、4、0及1個(gè)，均數(shù)為2.333，下室中未見有細(xì)胞懸浮或貼壁；在乙醇對(duì)照組，顯示上室底膜反面有較多細(xì)胞黏附，在10倍物鏡下取6個(gè)視野計(jì)數(shù)為14、13、12、15、10及17，均數(shù)為13.500。根據(jù)公式計(jì)算，香菜揮發(fā)油對(duì)Saos-2細(xì)胞的遷移抑制率=［（對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)－香菜揮發(fā)油組遷移細(xì)胞數(shù)）/對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)］×100%=［（13.5-2.33）/13.5］×100%=82.716%。結(jié)果提示香菜揮發(fā)油可顯著抑制體外Saos-2細(xì)胞的遷移（見圖2）。定量PCR結(jié)果見圖3。

表2　各組M TT實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖3　定量PC R檢測(cè)結(jié)果

3　討論

植物揮發(fā)油為中藥的重要有效成分，分布廣泛，含量一般在1%以下。目前常用的揮發(fā)油提取方法有蒸餾法、溶劑提取法、壓榨法、超聲波輔助萃取法、微波輔助萃取法、超臨界流體萃取法和酶解提取法等［5］。其中超聲波輔助萃取法利用超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動(dòng)和空化效應(yīng)，加速藥物有效成分進(jìn)入溶劑，從而提高提取效率，縮短提取時(shí)間，同時(shí)還可以防止高溫對(duì)提取成分的破壞［6-7］。本研究中利用該方法香菜揮發(fā)油的得率達(dá)到0.424%，可見是一種比較好的制備方法。

目前，各種植物揮發(fā)油類成分對(duì)腫瘤的作用已有報(bào)道，如花椒揮發(fā)油、姜黃揮發(fā)油、洋蔥揮發(fā)油及荊芥揮發(fā)油等均有抗腫瘤作用［8-11］。研究提示香菜揮發(fā)油類可阻斷亞硝酸鹽的合成［12］，香菜甲醇提取物對(duì)M K-1、H eLa和B16F10等多種腫瘤細(xì)胞系有生長(zhǎng)抑制作用［13］。本研究發(fā)現(xiàn)香菜揮發(fā)油可明顯抑制人骨肉瘤細(xì)胞Saos-2的生長(zhǎng)，5μg/m l濃度時(shí)細(xì)胞活性度為34.519%，這種抑制作用呈劑量依賴。同時(shí)，5μg/m l濃度對(duì)細(xì)胞的遷移抑制率達(dá)到82.716%。

P21Ci p1/W af1可與 cycl i n/CDK結(jié)合而抑制CDK的活性，P21Ci p1/W af1不但阻滯細(xì)胞G1/S轉(zhuǎn)換，而且也參與G2/M轉(zhuǎn)換的調(diào)節(jié)［14］。P27Ki p1與P21Ci p1/W af1有一定的同源性，亦具有阻止細(xì)胞通過G1/S期轉(zhuǎn)換的“關(guān)卡”作用，從而抑制細(xì)胞增殖［15］。研究還顯示，P21Ci p1/W af1與P27Ki p1在腫瘤內(nèi)表達(dá)水平的高低與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)，在高分化腫瘤這兩種抑癌基因的表達(dá)水平比低分化腫瘤高［16］。本研究中筆者發(fā)現(xiàn)香菜揮發(fā)油可明顯上調(diào)Saos-2細(xì)胞中P21Ci p1/W af1及P27Ki p1的表達(dá)，說明其對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用與這兩種抑癌基因的高表達(dá)有關(guān)。S100A4基因?qū)儆赟-100鈣離子結(jié)合蛋白超家族，被認(rèn)為與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與擴(kuò)散密切相關(guān)［17］。研究顯示S100A4可以減少骨肉瘤細(xì)胞間的黏附、促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞外基質(zhì)的降解和重塑，增加骨肉瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，幾乎參與了骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移的整個(gè)過程［18］，同時(shí)S100A4還是成骨細(xì)胞分化及礦化的負(fù)性調(diào)控因子［19］。本研究發(fā)現(xiàn)香菜揮發(fā)油可顯著抑制S100A4的表達(dá)，而另一種主要的遷移促進(jìn)基因NM23H1表達(dá)無明顯變化，提示香菜揮發(fā)油對(duì)遷移的抑制主要與S100A4的表達(dá)下調(diào)相關(guān)，由于S100A4是成骨分化的抑制基因，其表達(dá)下調(diào)可能同時(shí)促進(jìn)了細(xì)胞的成骨分化成熟，在后續(xù)研究中將進(jìn)一步關(guān)注。

綜上所述，本研究首次證實(shí)香菜揮發(fā)油對(duì)人成骨肉瘤細(xì)胞株Saos-2的生長(zhǎng)及遷移有顯著抑制作用，并初步探討了其分子機(jī)制，為香菜的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

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（王榮兵編輯）

Coriander volatile oil inhibits growth and migration of Saos-2 cellsin vitro*

Jia-ling Lai1，Wen-yao Fu2，Xing He2，Chuan-yun Xiao2，Jun Cao3
（1.Clinical Medical College；2.College of Pharmacy and Life Sciences；3.College of Basic Medical Sciences，Jiujiang University，Jiujiang，Jiangxi 332000，China）

Objective To extract coriander volatile oil and investigate its effects on growth and migration of human Saos-2 cellsin vitro.Methods Ultrasound-assisted ethanol extraction was used to prepare coriander volatile oil.MTT assay was used to determine the growth inhibion of Saos-2 cells by volatile oil.Cell migration was examined using Boyden chamber assay.Expression ofP21Cip1/Waf1，P27Kip1，NM23H1 and S100A4 were examined by real-time PCR.Results The results showed that the yield of coriander volatile oil was 0.424%using ultrasound-assisted ethanol extraction.Coriander volatile oil inhibited the growth and migration of Saos-2 cells，along with the decrease in the expression levels ofP21Cip1/Waf1，P27Kip1 and S100A4.Conclusions Coriander volatile oil can inhibit Saos-2 cell growth and migration in vitro，which may involveP21Cip1/Waf1，P27Kip1 andS100A4.

coriander volatile oil；anti-tumour；P21Cip1/Waf1；P27Kip1；S100A4

R 282.71

A

1005-8982（2016）05-0017-05

10.3969/j.i s s n.1005-8982.2016.05.004

2015-07-27
*

江西省衛(wèi)生廳科技計(jì)劃項(xiàng)目（No：20157101）；江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（贛教技字GJJ08441）

曹俊，E-m ai l：caoj un002@al i yun.com