張顏廷 Joerg J.Jacoby,2 王靜* 劉虹 張化朋 王麗春

1.山東鳳凰生物有限公司，泰安 271000； 2.山東寶來利來生物工程股份有限公司，泰安 271000

骨質(zhì)疏松癥是一種以低骨量和骨組織微細(xì)結(jié)構(gòu)破壞為特征，導(dǎo)致骨的脆性和骨折危險(xiǎn)性增加的疾病，主要是以為骨骼代謝失衡，骨的再吸收作用大于骨的形成作用[1]。骨質(zhì)疏松癥是一種多因素引起的慢性疾病，隨著年齡的增長骨質(zhì)流失而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥，這種持續(xù)的骨質(zhì)流失會使骨的吸收與再生越來越慢，骨折的發(fā)生率隨之增加[2]。50歲以上的中老年人、絕經(jīng)后婦女、營養(yǎng)不均衡人群容易患骨質(zhì)疏松癥。目前對于骨質(zhì)疏松的治療藥物一般主要有鈣制劑、維生素D和鈣的復(fù)合制劑和抗骨吸收藥及激素等藥物，但是由于藥物及激素的長期服用，其副作用也逐漸突顯。最近研究發(fā)現(xiàn)，維生素K2具有促進(jìn)骨形成，防治骨質(zhì)疏松癥的作用[3,4]。自1995年日本首次批準(zhǔn)維生素K2作為骨質(zhì)疏松治療用藥以來, 其療效及藥用安全性得到了廣泛而深入的研究和認(rèn)可，但是由于由于其從發(fā)酵的納豆中提取，來源有限且價(jià)格昂貴，并未普及[5]，且目前關(guān)于含維生素K2的益生菌制劑治療骨質(zhì)疏松的研究報(bào)道較少。本研究以鈣攝入不足引起骨質(zhì)疏松的大鼠為試驗(yàn)對象，利用自主研發(fā)的高產(chǎn)維生素K2(MK-7)的益生菌粉，配伍VD2及Ga等成分，探討益生菌制劑對骨質(zhì)疏松的作用。

1 材料和方法

1.1 藥品與試劑

戊巴比妥鈉，Merck P11011；大鼠羧化不全骨鈣素(ucOC)檢測試劑盒，上海酶聯(lián)生物研究所；大鼠羧化骨鈣素(cOC)檢測試劑盒，上海酶聯(lián)生物研究所；鈣，鄭州瑞普生物工程有限公司；維生素D，廣州利源食品添加劑有限公司；低鈣飼料購于北京科奧協(xié)力飼料有限公司；維生素K2(MK-7)益生菌粉為山東寶來利來公司生產(chǎn)。

1.2 儀器

美國好樂杰(Hologic)雙能X線骨密度儀

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物與分組

清潔級雌性SD大鼠32只，體重220 g～250 g，隨機(jī)分為4組，每組8只。分籠飼養(yǎng)，室溫20～25℃，相對濕度40%～60%，自由飲水。將大鼠分為普通飼料飼喂組(對照組)、低鈣飼料飼喂組(模型組)、低劑量復(fù)配產(chǎn)品治療組(C1組)、高劑量復(fù)配產(chǎn)品治療組(C2組)，C1組和C2組產(chǎn)品成分包括維生素K2(MK-7)的益生菌粉、VD2及Ga等。

對照組在實(shí)驗(yàn)過程中飼喂普通飼料，自由飲水。模型組、C1組、C2組同時(shí)飼喂低鈣飼料。飼喂低鈣飼料三周后，C1組、C2組給予產(chǎn)品治療，C1組給予低劑量維生素K2(MK7)的益生菌粉(MK7劑量8.31ug/d.bw)+VD2(1.6ug/d.bw)+鈣(80 mg/d)，C2組給予高劑量維生素K2(MK-7)的益生菌粉(MK-7劑量83.1ug/d.bw)+VD2(16ug/d.bw)+鈣(80 mg/d)。通過灌胃的形式給藥，給藥時(shí)間為3周。每周稱體重一次，根據(jù)體重調(diào)整灌胃量。

1.4 試驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)開始前及實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用30 mg/mL戊巴比妥鈉25 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，用雙能X射線測定儀(DEXA)測定大鼠骨密度(BMD)及骨礦含量(BMC)，并計(jì)算△BMC和△BMD，△BMC為試驗(yàn)結(jié)束后大鼠的BMC值與試驗(yàn)開始時(shí)大鼠的BMC值的差值，△BMD為試驗(yàn)結(jié)束后大鼠的BMC值與試驗(yàn)開始時(shí)大鼠的BMC值的差值。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，完成DEXA測定時(shí)，對大鼠心臟取血，測定大鼠血清中羧化不完全骨鈣素(ucOC)及羧化完全骨鈣素(cOC)含量，計(jì)算ucOC/cOC值。

1.5 相關(guān)指標(biāo)檢測

美國好樂杰(Hologic)雙能X線骨密度儀測定大鼠骨組織參數(shù)：BMC：骨礦物質(zhì)含量，BMD：骨密度。

ELISA法測定ucOC及cOC水平：使用大鼠羧化不全骨鈣素(ucOC)檢測試劑盒測定血清中ucOC水平，使用大鼠羧化完全骨鈣素(cOC)檢測試劑盒測定血清中cOC水平。

1.6 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠體重變化

在實(shí)驗(yàn)三周后，對照組、模型組、C1組、C2組大鼠的體重較試驗(yàn)開始時(shí)顯著增加(P<0.05)，在試驗(yàn)后3周，灌胃產(chǎn)品的C1組、C2組大鼠的體重與對照組的大鼠的體重呈增加的趨勢，而模型組大鼠體重?zé)o明顯變化(P>0.05)。

圖1 大鼠體重變化Fig.1 The change of weight in rats

2.2 骨礦含量測定結(jié)果

在飼喂6周后，與對照組相比，模型組、C1組、C2組的BMC值顯著降低(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)前后各組大鼠BMC值都有一定程度的增加，C1組與C2組增加量要顯著高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 骨密度測定結(jié)果

與對照組相比，模型組、C1組、C2組大鼠的BMD顯著降低(P<0.05)，在飼喂低鈣飼料6周后，模型組大鼠骨密度要顯著低于對照組(P<0.01)，并且要比飼喂之前低。后期灌胃產(chǎn)品的C1組、C2組大鼠骨密度要顯著高于模型組(P<0.05)，且骨密度有一定的增加，增加量相對于模型組顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

表1 各組大鼠骨密度值變化Table 1 The change of BMD in rats of each group

注：對照組：正常飼喂組；模型組：飼喂低鈣飼料組；C1組：低劑量產(chǎn)品灌胃組；C2組：高劑量產(chǎn)品灌胃組；與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05
Note: Control group-Normal feeding; Model group-Low calcium group;C1-Low dose probiotics group; C2-High dose probiotics group;*P<0.05 vs Control group;#P<0.05 vs Model group

2.4 ucOC/cOC值

給予產(chǎn)品三周后，與對照組相比，模型組、C1組、C2組大鼠的ucOC/cOC值差異不顯著(P>0.05)。而C1組、C2組大鼠的ucOC/cOC值顯著低于模型組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

表2 各組大鼠ucOC/cOC值Table 2 The result of ucOC/cOC in rats of each group

注：對照組：正常飼喂組；模型組：飼喂低鈣飼料組；C1組：低劑量產(chǎn)品灌胃組；C2組：高劑量產(chǎn)品灌胃組；與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05
Note: Control group-Normal feeding; Model group-Low calcium group;C1-Low dose probiotics group; C2-High dose probiotics group;*P<0.05 vs Control group;#P<0.05 vs Model group

3 討論

研究表明，長期的低鈣飲食使人體鈣吸收減少，能夠?qū)е鹿琴|(zhì)疏松癥[6,7]。有研究顯示，成年動(dòng)物鈣攝入量少時(shí)，會導(dǎo)致骨松動(dòng)，最終形成骨質(zhì)疏松[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)飼喂低鈣飼料6周時(shí)，大鼠的骨礦含量及骨密度要顯著低于正常飼喂組，即長期的鈣缺失能夠?qū)е麓笫蠊琴|(zhì)疏松。

眾所周知攝入充足的鈣可以保證骨骼的健康成長并可以預(yù)防骨質(zhì)流失。研究表明維生素D能促進(jìn)鈣被人體有效的吸收，將“腸鈣”轉(zhuǎn)化為“血鈣”[9]。但是，該補(bǔ)充也有兩面性，當(dāng)鈣攝入量過多，MGP濃度較低時(shí)，鈣不能被人體有效利用，會出現(xiàn)血管等的鈣化，引發(fā)一系列的心血管疾病[10]。研究表明，維生素K，特別是維生素K2(MK-7)能維持機(jī)體內(nèi)鈣的平衡，將“血鈣”轉(zhuǎn)化為“骨鈣”[9]。2004年Liman Sun等人研究也表明活性VD3和VK2可以抑制蛋白質(zhì)缺乏導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松[11]。陳鵬等的研究也發(fā)現(xiàn)維生素K2配伍維生素D3和檸檬酸鈣具有明顯增加骨密度和骨鈣的作用[12]。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)灌胃產(chǎn)品組BMC與BMD值顯著高于模型對照組，說明當(dāng)維生素K2、維生素D以及鈣同時(shí)存在時(shí)，具有提高骨礦含量，增強(qiáng)骨密度的作用，即含天然維生素K2的益生菌制劑能夠有效地防治鈣攝入不足引發(fā)的骨質(zhì)疏松。

OC是血清骨鈣蛋白，是骨形成和骨轉(zhuǎn)換的標(biāo)志，具有維生素K依賴性，可形成羧化完全骨鈣素(cOC)，cOC能夠轉(zhuǎn)運(yùn)血液中的鈣到骨骼中，具有維持骨礦化速率、抑制軟骨礦化速率等的作用。當(dāng)維生素K不足時(shí)，OC不能完全羧化，形成羧化不完全骨鈣素(ucOC)。研究表明，椎骨骨折的病人體內(nèi)ucOC水平明顯高于非骨折病人，當(dāng)ucOC/cOC比率升高時(shí)，即說明了維生素K的缺乏同時(shí)也說明骨骼具有骨質(zhì)疏松的風(fēng)險(xiǎn)[13]。最近研究發(fā)現(xiàn)，維生素K2是必不可少的骨代謝調(diào)節(jié)劑，能刺激成骨細(xì)胞的作用，促進(jìn)骨形成[14,15]。Je SH等[16]研究顯示聯(lián)合應(yīng)用維生素K2、維生素D和鈣可減少ucOC的血液濃度。Hirao M[17]等研究顯示維生素K2可促進(jìn)骨鈣素的羧化，形成cOC，增加股骨和頸骨密度。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組相比，灌胃復(fù)配產(chǎn)品組ucOC/cOC值顯著降低，說明灌胃產(chǎn)品中補(bǔ)充的維生素K2能有效的被大鼠吸收，促進(jìn)骨鈣素的羧化，進(jìn)而促進(jìn)鈣的有效利用，提高骨礦含量，降低其骨質(zhì)疏松的風(fēng)險(xiǎn)。

本試驗(yàn)研究表明含有維生素K2的益生菌粉與維生素D和鈣復(fù)配之后，能夠有效的被大鼠吸收利用，達(dá)到防治骨質(zhì)疏松的目的。