李健，蔣艷忠（廣西工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530001）

雙酶水解蠶蛹蛋白工藝研究

李健，蔣艷忠*
（廣西工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530001）

研究了堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶雙酶法水解蠶蛹蛋白的工藝條件。通過單因素試驗(yàn)探討了溫度、加酶量、底物濃度、水解時(shí)間、酶質(zhì)量比（堿性蛋白酶∶木瓜蛋白酶）對(duì)蠶蛹蛋白水解效果的影響，然后通過正交試驗(yàn)優(yōu)化水解工藝務(wù)件。結(jié)果表明，影響水解率的主次關(guān)系依次為：溫度、底物濃度、時(shí)間、酶用量、酶比。優(yōu)化的工藝條件為：溫度55℃，加酶量3.0%，底物濃度3%，水解時(shí)間6h，酶質(zhì)量比4∶1，上述條件下蠶蛹蛋白水解率達(dá)25.04%。

堿性蛋白酶；木瓜蛋白酶；蠶蛹蛋白；水解度

蠶蛹是蠶繭抽絲后剩下的主要副產(chǎn)物，我國(guó)每年副產(chǎn)約50多萬t干蠶蛹［1］。干蠶蛹含有60.0%左右的蛋白質(zhì)，且8種人體必需氨基酸占總氨基酸的42%左右，符合FAO/WHO建議的理想氨基酸模式，是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白資源［1-2］。目前，蠶蛹主要被用作動(dòng)物飼料，僅有少量被人類食用［1，3］，因此，造成了蠶蛹資源的極大浪費(fèi)。將蠶蛹蛋白進(jìn)一步水解成多肽和氨基酸后，將更容易為人體所吸收，在食品、保健品行業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景，國(guó)內(nèi)已有廠家將蠶蛹水解制成復(fù)合氨基酸產(chǎn)品［4］。

蠶蛹蛋白主要為球蛋白，水解時(shí)可以采用酸水解、堿水解和酶水解的方式。但是酸水解導(dǎo)致色氨酸全部破壞，絲氨酸、酪氨酸和蘇氨酸部分破壞；堿水解引起消旋作用而降低營(yíng)養(yǎng)價(jià)值；酶水解時(shí)反應(yīng)條件溫和，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值得以保障［5-6］。本試驗(yàn)以脫脂蠶蛹粉為原料采用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶水解工藝，對(duì)溫度、時(shí)間、底物濃度、加酶量、酶比等因素進(jìn)行了單因素和正交試驗(yàn)，探討了雙酶水解蠶蛹蛋白的優(yōu)化條件。

1　試驗(yàn)部分

1.1試劑與儀器

干蠶蛹：購(gòu)于廣西宜州繅絲廠；JY10001上皿電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；FW100型高速萬能粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；HH-S型水浴鍋、SHB-III循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；JB50-D型增力電動(dòng)攪拌機(jī)：上海標(biāo)本模型廠；LABOROTA 400旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：德國(guó)heidoph公司；pH 211酸度計(jì)、101A-E1電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司；TGL-16C高速臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；KDY-9830凱氏定氮儀：北京思備得研究所；木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶：由南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司提供；石油醚、甲醛、NaOH、HCl、H2SO4、H3BO3、K2SO4、Cu2SO4等均為分析純。

1.2脫脂蠶蛹的酶水解處理［7］

稱取一定量的干蠶蛹，用粉碎機(jī)粉碎，于250 mL三口燒瓶中，按一定比例加入石油醚，在沸點(diǎn)溫度下恒溫水浴設(shè)定時(shí)間，并不定時(shí)攪拌使物料溶劑充分接觸。冷卻至室溫，真空抽濾，濾餅即為脫脂蠶蛹粉。

準(zhǔn)確稱取一定量的脫脂蠶蛹粉按設(shè)定的底物濃度加入一定量的水。采用1 moL/L NaOH溶液調(diào)節(jié)至所需pH，加熱至85℃保持20 min后冷卻至40℃以下，然后加入蛋白酶，在保持一定pH及溫度條件下水解。水解結(jié)束后煮沸10 min滅酶，冷卻后離心分離，取上清液。沉淀用適量蒸餾水洗滌1次，合并上清液，并記錄體積。采用甲醛滴定法測(cè)定上層清液中氨基酸態(tài)氮含量。

1.3各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1脫脂蠶蛹粉蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

脫脂蠶蛹粉蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定采用凱氏定氮法測(cè)定（蛋白質(zhì)換算系數(shù)為6.25）。

1.3.2水解液中氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定

水解液中氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定采用甲醛滴定法測(cè)定［8］。

1.3.3水解度（DH）的計(jì)算

式中：N為水解液中氨基酸態(tài)氮含量，g/mL；V為水解液體積，mL；G為脫脂蠶蛹粉質(zhì)量，g；P為脫脂蠶蛹粉蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；6.25為蛋白質(zhì)換算系數(shù)。

2　結(jié)果與討論

通過參考文獻(xiàn)［6］及對(duì)堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解蠶蛹蛋白的試驗(yàn)結(jié)果表明，堿性蛋白酶的水解效果明顯優(yōu)于木瓜蛋白酶，但蛋白酶具有底物特異性，對(duì)于同一種蛋白，不同蛋白酶的酶切位點(diǎn)不同，多酶協(xié)調(diào)作用更有利于將蛋白質(zhì)水解成低分子肽類［9］。因此本試驗(yàn)采用堿性蛋白酶與木瓜蛋白酶雙酶水解蠶蛹蛋白。

2.1雙酶水解蠶蛹蛋白的單因素試驗(yàn)［6-7，10］

2.1.1溫度對(duì)蠶蛹蛋白水解度的影響

在酶用量2%，底物濃度4%，時(shí)間4 h，堿性蛋白酶與木瓜蛋白酶質(zhì)量比3∶1的條件下，先調(diào)pH 9加堿性酶水解2 h后，再調(diào)pH 8加木瓜蛋白酶水解2 h，考察溫度對(duì)蠶蛹蛋白水解度的影響。溫度對(duì)蠶蛹蛋白水解度的影響見圖1。

圖1溫度對(duì)蠶蛹蛋白DH的影響Fig.1　Effect of temperature on the degree of hydrolysis of silkworm pupa protein

溫度升高，蠶蛹蛋白水解度不斷提高，55℃達(dá)到最大，這是因?yàn)槊笇?duì)溫度有適應(yīng)范圍，在最適應(yīng)溫度下酶的活性最高，高于或低于最適溫度時(shí)酶的活性下降。因此后續(xù)試驗(yàn)過程擬選用溫度為55℃。

2.1.2加酶量對(duì)蠶蛹蛋白水解度的影響

在溫度55℃，其它條件及試驗(yàn)過程同2.1.1，考察加酶量對(duì)蠶蛹蛋白水解度的影響。加酶量對(duì)蠶蛹蛋白水解度的影響見圖2。

圖2 加酶量對(duì)蠶蛹蛋白DH的影響Fig.2　Effect of amount of enzyme on the degree of hydrolysis of silkworm pupa protein

結(jié)果表明，隨著加酶量的增加DH逐漸增加，增大加酶量會(huì)導(dǎo)致成本加大。故在后續(xù)試驗(yàn)過程選用加酶量2.0%。

2.1.3底物濃度對(duì)蠶蛹蛋白水解度的影響

在溫度55℃，加酶量2%，時(shí)間4 h，酶質(zhì)量比3∶1的條件下，考察了底物濃度對(duì)蠶蛹蛋白水解度的影響。底物濃度對(duì)蠶蛹蛋白水解度的影響見圖3。

圖3底物濃度對(duì)蠶蛹蛋白DH的影響Fig.3　Effect of substrate concentration on the degree of hydrolysis of silkworm pupa protein

結(jié)果表明，隨著脫脂蠶蛹粉濃度的增加蠶蛹蛋白DH逐漸降低。這是由于脫脂蠶蛹粉濃度小，酶與蛋白質(zhì)能夠充分反應(yīng)，但過低的脫脂蠶蛹粉濃度會(huì)導(dǎo)致后續(xù)處理的難度加大。因此后續(xù)試驗(yàn)過程擬選用底物濃度4%。

2.1.4時(shí)間對(duì)蠶蛹蛋白水解度的影響

在溫度55℃，加酶量2%，底物濃度4%，酶質(zhì)量比3∶1的條件下，考察了時(shí)間對(duì)蠶蛹蛋白水解度的影響。時(shí)間對(duì)蠶蛹蛋白水解度的影響見圖4。

圖4 時(shí)間對(duì)蠶蛹蛋白DH的影響Fig.4　Effect of time on the degree of hydrolysis of silkworm pupa protein

結(jié)果表明，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，蠶蛹蛋白的水解度逐漸增加。5 h以后DH變化逐漸平緩。因此后續(xù)試驗(yàn)過程擬選用5 h。

2.1.5堿性蛋白酶與木瓜蛋白酶質(zhì)量比對(duì)蠶蛹蛋白水解度的影響

在溫度55℃，加酶量2%，底物濃度4%，時(shí)間5 h的條件下，考察了酶比對(duì)蠶蛹蛋白水解度的影響。酶比對(duì)蠶蛹蛋白水解度的影響見圖5。

結(jié)果表明，隨著堿性蛋白酶用量的增加，蠶蛹蛋白DH增加，當(dāng)達(dá)到4∶1以后已增加不明顯，說明堿性蛋白酶的水解效果優(yōu)于木瓜蛋白酶。

圖5 酶質(zhì)量比對(duì)蠶蛹蛋白DH的影響Fig.5　Effect of enzyme mass ratio on the degree of hydrolysis of silkworm pupa protein

2.2正交試驗(yàn)優(yōu)化雙酶水解蠶蛹蛋白的條件

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取溫度、加酶量、底物濃度、時(shí)間和酶比（堿性蛋白酶與木瓜蛋白酶質(zhì)量比）5個(gè)因素，以蠶蛹蛋白水解度（DH）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行L16（45）正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素及水平見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果及分析見表2。

表1　正交試驗(yàn)因素及水平Table 1　Factors and levels of orthogonal experiment

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析Table 2　Rresults of orthogonal test and analysis

續(xù)表2　正交試驗(yàn)結(jié)果及分析Continue table 2　Rresults of orthogonal test and analysis

極差分析表明，在所考察因素的水平范圍內(nèi)，影響蠶蛹蛋白水解的主次順序依次為溫度、底物濃度、時(shí)間、酶用量、酶質(zhì)量比；優(yōu)化的工藝方案為A3B1C4D4E2，即溫度55℃，底物濃度3%，水解時(shí)間6 h，加酶量3.0%，酶質(zhì)量比4∶1，用優(yōu)化的工藝方案再次進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果得蠶蛹蛋白水解率為25.04%，高于正交試驗(yàn)中的最高值24.73%，說明優(yōu)化結(jié)果可靠。

3　結(jié)論

1）在試驗(yàn)條件下通過單因素和正交試驗(yàn)得知雙酶水解蠶蛹蛋白的優(yōu)化條件為：溫度55℃，底物濃度3%，水解時(shí)間6 h，加酶量3.0%，酶質(zhì)量比（堿性蛋白酶：木瓜蛋白酶）4∶1，堿性蛋白酶處理時(shí)pH 9.0、木瓜蛋白酶處理時(shí)pH 8.0，堿性蛋白酶與木瓜蛋白酶的水解時(shí)間按1∶1分配，上述條件下蠶蛹蛋白水解率為25.04%。

2）通過正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析得知，對(duì)蠶蛹蛋白水解率影響的主次關(guān)系依次為：溫度、底物濃度、時(shí)間、酶用量、酶比。

［1］Zhou J，Han D X．Proximate，amino acid and mineral composition of pupae of the silkworm Antheraea pernyi in China［J］．Journal of Food Composition and Analysis，2006，19（8）：850-853

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［4］羅貴倫，陳器．蠶蛹硫酸水解制備復(fù)合氨基酸的研究［J］．食品工業(yè)科技，2003，24（5）：59

［5］佳善．蠶蛹蛋白的開發(fā)利用［J］．食品科技，1996（1）：16-17

［6］朱新鵬．堿性蛋白酶水解蠶蛹蛋白質(zhì)工藝的研究［J］．保鮮與加工，2011，11（4）：19-22

［7］朱新鵬，張恒瑞．蠶蛹蛋白雙酶法水解工藝優(yōu)化［J］．湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，51（10）：2081-2084

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［9］方佳茂，劉倔琪，莊楚周，等．復(fù)合酶水解蠶蛹蛋白制備功能性寡肽的工藝研究［J］．現(xiàn)代食品科技，2012，28（3）：323-328

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Study on Technology for Hydrolysis of Silkworm Pupa Protein with Double Enzyme

LI Jian，JIANG Yan-zhong*
（Guangxi Vocational＆Technical Institute of Industry，Nanning 530001，Guangxi，China）

The technology for silkworm pupa protein hydrolysis by double enzymatic（alkaline protease and papain）was studied．Single factor and orthogonal experiments were used to study the effects of the parameters such as temperature，amount of enzyme，substrate concentration，time，mass ratio of a1kaline protease and papain on the hydrolysis degree of silkworm pupa protein.The results showed that the temperature was the more important factor that affected the effect of hydrolysis，following substrate concentration and time and amount of enzyme and enzyme mass ratio，the optimal conditions were obtained with orthogonal experiments，as follows：the temperature was 55℃，the amount of enzyme was 3.0%，the substrate concentration was 3%，the time was 6 h and the enzyme mass ratio was 4∶1.The hydrolysis degree of silkworm pupa protein under these conditions could be 25.04%．

alkaline protease；papain；silkworm pupa protein；degree of hydrolysis

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.10.024

2011年度廣西教育廳科研立項(xiàng)項(xiàng)目（201106LX776）

李?。?970—），男（壯），工程師，本科，從事天然物提取、化工工藝的教學(xué)和科研。
*

蔣艷忠（1971—），女（漢），副教授，碩士，從事天然物提取、應(yīng)用化工的教學(xué)和科研。

2015-04-29