楊新生，姜忠麗（沈陽(yáng)師范大學(xué)，遼寧沈陽(yáng)110034）

枸杞多糖的超聲波輔助提取法及其抗氧化研究

楊新生，姜忠麗*
（沈陽(yáng)師范大學(xué)，遼寧沈陽(yáng)110034）

以枸杞為原料，考察超聲波輔助提取中的料液比、時(shí)間、溫度對(duì)枸杞多糖得率的影響，并采用響應(yīng)面優(yōu)化。枸杞多糖超聲波輔助提取的最佳工藝條件：料液比為1∶20（g/mL），溫度為70℃，提取時(shí)間20 min，理論枸杞多糖得率為3.37%，實(shí)際枸杞多糖得率為3.35%，近似率達(dá)到99.4%。枸杞多糖總抗氧化性達(dá)到10.44 U/mL，結(jié)果表明：枸杞多糖具有抗氧化作用。

枸杞多糖；超聲波輔助提?。豁憫?yīng)面優(yōu)化；總抗氧化作用

枸杞一種茄科植物，已有研究證實(shí)枸杞多糖具有一定的抗衰老、抗腫瘤、降血脂、保肝和增強(qiáng)免疫力等生理功能［1］。枸杞總多糖是一些單糖或蛋白質(zhì)、肽構(gòu)成的復(fù)合多糖為主，還含有聚合糖同肽復(fù)合的多糖。復(fù)合多糖糖鏈?zhǔn)欠种Y(jié)構(gòu)，肽鏈上氨基酸含量占總的5%～30%。枸杞多糖的分子量較大，曾有人分離某4種枸杞多糖，其分子量大致在0.8×104Da～6.6×104Da間［2］。枸杞多糖的提取方法也有多種，最常用的是水提法［3-6］，黃文書(shū)、郝金玉等用微波法提取［7-8］，梁敏等［9］利用木瓜蛋白酶提取枸杞多糖，酶在一定條件下分解植物組織，加速糖提取，超聲波輔助提取具有空化作用和次級(jí)效應(yīng)，改變枸杞細(xì)胞壁和膜，提高枸杞多糖得率［10］。本試驗(yàn)采用超聲波輔助提取枸杞多糖，并用響應(yīng)面優(yōu)化方法，采用苯酚-濃硫酸檢測(cè)多糖，以期為枸杞多糖的利用提供理論參考。

1　材料與設(shè)備

1.1材料與試劑

枸杞：市售，產(chǎn)于寧夏中寧，均購(gòu)自北京華聯(lián)超市，樣品顆粒飽滿，色澤正常，原料采集后將其裝入自封袋置于冰箱冷藏。

試驗(yàn)所用試劑均為分析純；總抗氧化值測(cè)定試劑盒：購(gòu)于南京建成生物研究所。

1.2儀器與設(shè)備

J014-2型電子分析天平：瑞士梅特勒托利多公司；72光柵分光光度計(jì)：上海第三分析儀器廠；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生儀器廠；SB 25-12 DTDN型超聲清洗儀：寧波新芝生物科技有限公司；SC-3610型離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；DGG-914OBD型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥器：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1枸杞預(yù)處理

枸杞置于60℃真空干燥箱中，真空烘干后放入干燥器中24 h，取適量研碎后置圓底燒瓶中，加氯仿：甲醇（體積比為2∶1）20 mL/次，60℃下回流脫脂2次，每次2 h，濾出溶劑，殘?jiān)L(fēng)干，殘?jiān)礊榻?jīng)過(guò)處理的枸杞。

1.3.2枸杞多糖的提?。?1-12］

1.3.2.1枸杞多糖提取工藝流程

枸杞破碎烘干→提取→抽濾→濃縮→無(wú)水乙醇沉淀→二次沉淀→95%乙醇、丙酮、乙醚反復(fù)洗滌→干燥→粗多糖

1.3.2.2枸杞多糖超聲波輔助提取單因素試驗(yàn)

料液比、提取時(shí)間、提取溫度作為考察因素，枸杞多糖得率為進(jìn)行單因素試驗(yàn)的指標(biāo)。

1）料液比對(duì)枸杞多糖得率的影響

稱(chēng)取等量已破碎烘干的枸杞，分別放入已編好號(hào)的錐形瓶中，料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL），60℃溫度下提取20 min，脫脂棉過(guò)濾，重復(fù)提取2次，測(cè)定吸光值，由枸杞多糖得率來(lái)確定超聲提取的料液比。

2）提取時(shí)間對(duì)枸杞多糖得率的影響

稱(chēng)取等量已破碎烘干的枸杞，分別放入已編好號(hào)的錐形瓶中，料液比定為1∶20（g/mL），60℃溫度下超聲提取5、10、20、30 min，提取2次，測(cè)定吸光值，由枸杞多糖得率來(lái)確定提取時(shí)間。

3）提取溫度對(duì)枸杞多糖得率的影響

稱(chēng)取等量已破碎烘干的枸杞，分別放入已編好號(hào)的錐形瓶中，料液比定為1∶20（g/mL），分別在40、50、60、70℃溫度下，提取2次，每次20 min，測(cè)定吸光值，由枸杞多糖得率來(lái)確定提取溫度。

1.3.3多糖純化［13］

先用10%三氯乙酸去除蛋白質(zhì)沉淀，濃縮，在用95%乙醇、無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚進(jìn)行多次洗滌，直至溶液顏色由黃色近無(wú)色。再于60℃干燥，得粗多糖，再將粗多糖熱水溶解，脫脂棉過(guò)濾［14］，棄去沉淀，進(jìn)一步重復(fù)上述洗滌過(guò)程直至顏色近為無(wú)色，干燥，得到枸杞多糖。

1.3.4多糖的檢測(cè)：苯酚-濃硫酸［15］

標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的配制。準(zhǔn)確稱(chēng)量50 mg干燥至恒重葡萄糖，加適量水溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，配成濃度1 mg/mL的葡萄糖溶液。然后按著表1依次添加標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液、蒸餾水、5%苯酚溶液、濃硫酸，充分搖勻，沸水浴中30 min，冷卻后于490 nm處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1　苯酚-硫酸法各溶劑添加量及濃度Table 1　The amount and concentration of each solvent of phenol sulfuric acid method

1.3.5枸杞多糖得率的計(jì)算公式

1.3.6總抗氧化性

按南京建成試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。配制好各試劑，按說(shuō)明書(shū)加入各試劑，混勻，放置10 min，用蒸餾水調(diào)零，于1 cm光徑下，測(cè)各管520 nm下吸光度。混勻，放置10 min，雙蒸水調(diào)零1 cm半徑，520 nm測(cè)各管吸光度總抗氧化性的定義，在37℃時(shí)，每分鐘每毫升樣品使反應(yīng)體系吸光度（OD）值，每增加0.01時(shí)，為一個(gè)總抗氧化能力單位。

其中：N為反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)；n為樣品測(cè)試前稀釋倍數(shù)。

2　超聲波輔助提取枸杞多糖的方法分析

2.1超聲波輔助提取枸杞多糖單因素試驗(yàn)

2.1.1料液比對(duì)枸杞多糖得率的影響

料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL），60℃溫度下提取20 min，重復(fù)提取2次，料液比對(duì)枸杞多糖得率的影響如圖1所示。

圖1　料液比對(duì)枸杞多糖得率的影響Fig.1　Effect of solid-liquid ratio on the yield of lycium barbarum polysaccharide

由圖1可以看出，一定料液比范圍下，枸杞多糖得率隨料液比增大而呈上升趨勢(shì)，料液比為1∶20（g/mL），最高，再減小料液比，得率有所下降。因此，最優(yōu)料液比條件應(yīng)為1∶20（g/mL）。

2.1.2時(shí)間對(duì)枸杞多糖得率的影響

料液比定為1∶20（g/mL），60℃溫度下超聲波輔助提取5、10、20、30 min，提取2次，時(shí)間對(duì)枸杞多糖得率的影響如圖2所示。

圖2 時(shí)間對(duì)枸杞多糖得率的影響Fig.2　Effect of time on the yield of lycium barbarum polysaccharide

由圖2可以看出，枸杞多糖的得率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而上升，并在20 min時(shí)達(dá)到最大。此后，隨時(shí)間延長(zhǎng)得率反而下降，20 min為較好的時(shí)間，得率最高。

2.1.3提取溫度對(duì)枸杞多糖得率的影響

料液比定為1∶20（g/mL），分別在40、50、60、70℃溫度下，提取2次，每次20 min，提取溫度對(duì)枸杞多糖得率的影響如圖3所示。

圖3　提取溫度對(duì)枸杞多糖得率的影響Fig.3　Effect of extraction temperature on the yield of lycium barbarum polysaccharide

由圖3所示，隨溫度的升高，得率緩慢上升，60℃達(dá)到最高，此后，隨溫度的升高，略有下降，因此，60℃條件最適宜，得率最高。

2.2響應(yīng)面法對(duì)枸杞多糖超聲波提取工藝的優(yōu)化

根據(jù)二次正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)的中心組合設(shè)計(jì)原理，綜合上述試驗(yàn)結(jié)果，選取提取時(shí)間、料液比、提取溫度的3個(gè)主要因素為自變量，采用三因素的響應(yīng)面分析方法優(yōu)化工藝。設(shè)計(jì)中心組合試驗(yàn)因素水平編碼，如表2所示。根據(jù)表2，設(shè)計(jì)枸杞多糖得率響應(yīng)面試驗(yàn)，并測(cè)定料液比、提取時(shí)間、提取溫度等指標(biāo)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表2　中心組合試驗(yàn)因素水平編碼表Table 2　Central composite test factors level encoding table

表3 枸杞多糖的得率響應(yīng)面數(shù)據(jù)Table 3　Response surface data of the yield of lycium barbarum polysaccharide

續(xù)表3　枸杞多糖的得率響應(yīng)面數(shù)據(jù)Continue table 3　Response surface data of the yield of lycium barbarum polysaccharide

計(jì)算得率指標(biāo)回歸方程的方差分析和提取各因素對(duì)得率顯著性分析，見(jiàn)表4。

表4 得率回歸方程方差分析Table 4　Variance analysis of regression equation

利用Design-Expert 8.0.6軟件分析數(shù)據(jù)，建立關(guān)于得率的二階響應(yīng)模型，從而找到最優(yōu)響應(yīng)因子水平。得到響應(yīng)值Y1（得率）和各因子（A、B、C）之間的回歸擬合方程：Y1=3.29+0.325A-0.038B+0.080C-0.012AB+2.50×10-3AC-2.500×10-3BC-0.16A2-0.28B2-1.75×10-3C2?；貧w方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.920 5，離回歸標(biāo)準(zhǔn)差=0.818 2。從表4可以看出，回歸模型中F=9，“Pr＞F”=0.004 2＜0.05，表明得到的回歸方程擬合程度較好，回歸效果顯著，而失擬項(xiàng)P=0.776 1＞0.05，說(shuō)明回歸方程差異性不顯著。因此，應(yīng)用此方程來(lái)模擬指標(biāo)值與因素的關(guān)系是可行的。

圖4　料液比和時(shí)間對(duì)枸杞多糖得率影響的響應(yīng)面立體分析圖及其相應(yīng)等高線圖Fig.4　Effect of solid-liquid ratio and time on the yield of lycium barbarum polysaccharide from three dimensional analysis diagram of response surface and its corresponding contour lines

圖5　溫度和時(shí)間對(duì)枸杞多糖得率影響的響應(yīng)面立體分析圖及其相應(yīng)的等高線Fig.5　Effect of temperature and time on the yield of the lycium barbarum polysaccharide from three dimensional analysis diagram of response surface and its corresponding contour lines

將提取提時(shí)間、料液比、提取溫度3個(gè)參數(shù)分別固定，得率隨剩余兩個(gè)參數(shù)的變化趨勢(shì)如圖4～圖6所示。

從圖4中可看出，料液比和時(shí)間對(duì)容重的影響程度相近。從圖5中可看出，溫度的影響程度大于料液比，隨著溫度的增加，得率增加，隨著時(shí)間的增加，得率先緩慢上升再下降。從圖6中可以看出，隨著溫度增加，得率增加；隨著料液比的升高，得率先緩慢升高再下降。

根據(jù)Design-Expert 8.0.6軟件分析得到超聲波輔助提取的最優(yōu)條件如下：時(shí)間20.59 min，料液比為1∶20（g/mL），溫度為70℃，得率3.37%。通過(guò)這最優(yōu)條件，做驗(yàn)證試驗(yàn)，得到枸杞多糖得率為3.35%，與3.37%極為近似，因此，最終確定試驗(yàn)的最佳工藝條件為溫度70℃，時(shí)間為20 min，料液比1∶20（g/mL）。

2.3枸杞多糖的總抗氧化性研究

枸杞多糖的總抗氧化能力見(jiàn)圖7。

圖6　溫度和料液比對(duì)枸杞多糖得率影響的響應(yīng)面立體分析圖及其相應(yīng)的等高線Fig.6　Effect of temperature and solid-liquid ratio on the yield of lycium barbarum polysaccharide from three dimensional analysis diagram of response surface and its corresponding contour lines

圖7 枸杞多糖的總抗氧化能力Fig.7　Total antioxidant capacity of lycium barbarum polysaccharide

根據(jù)圖7可以看出枸杞多糖總抗氧化能力是隨枸杞多糖濃度的增大而增強(qiáng)，當(dāng)枸杞多糖濃度為2 mg/mL時(shí)，總抗氧化能力為10.44U/mL。從而，說(shuō)明枸杞多糖抗氧化能力較強(qiáng)。

3　結(jié)論

1）超聲提取枸杞多糖的最佳工藝條件：料液比1∶20（g/mL），提取溫度為70℃，提取時(shí)間為20 min，枸杞多糖得率為3.35%。

2）枸杞多糖的總抗氧化能力測(cè)定，得到濃度為2 mg/mL時(shí)，枸杞多糖總抗氧化能力為10.44 U/mL。

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LBP Ultrasonic-assisted Extraction Method and Its Antioxidant Activity

YANG Xin-sheng，JIANG Zhong-li*
（Shenyang Normal University，Shenyang 110034，Liaoning，China）

With lycium chinense as raw materials，studied the ultrasonic-assisted extraction of solid to liquid ratio，time，temperature effect on the yield of lycium barbarum polysaccharides，and the response surface optimization.The optimum technological conditions for ultrasonic-assisted extraction of lycium barbarum polysaccharides were that solid-quid ratio was 1∶20（g/mL），the temperature was 70℃，extraction time was 20 min. The theory of lycium barbarum polysaccharide was 3.37%，the actual yield of lycium barbarum polysaccharide was 3.35%，the approximate rate reached 99.4%.The total antioxidant activity of lycium barbarum polysaccharide reaches 10.44 U/mL，the results showed that，lycium barbarum polysaccharides had anti-oxidative effect.

lycium barbarum polysaccharides；ultrasonic-assisted extraction；response surface optimization；total oxidative effect

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.10.019

楊新生（1992—），女（漢），碩士研究生，研究方向：糧油深加工。
*

姜忠麗（1968—），女（漢），副教授，研究方向：食品質(zhì)量控制及食品營(yíng)養(yǎng)。

2015-04-20