李知敏，王 妹，彭 亮，*（江西科技師范大學(xué)藥學(xué)院，江西 南昌 33003）

江香薷揮發(fā)油的化學(xué)成分分析及其對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜的抑制作用

李知敏1，王 妹2，彭 亮1，*
（江西科技師范大學(xué)藥學(xué)院，江西 南昌 330013）

目的：研究江香薷揮發(fā)油的化學(xué)成分及其對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜的影響。方法：運(yùn)用氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)鑒定江香薷揮發(fā)油的化學(xué)成分，并對(duì)其中相對(duì)含量較大的8 種化學(xué)成分的金黃色葡萄球菌生物被膜抑制作用進(jìn)行研究。結(jié)果：GC-MS分析鑒定出29 種成分，其中相對(duì)含量比較大的成分為百里香酚、香荊芥酚、對(duì)聚傘花素、γ-松油烯、百里香酚乙酸酯、α-石竹烯、3-蒈烯和香荊芥酚乙酸酯。江香薷揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜形成的抑制率可達(dá)91.3%，對(duì)成熟的金黃色葡萄球菌生物被膜清除率為78.5%，香荊芥酚、3-蒈烯、香荊芥酚乙酸酯和α-石竹烯對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜的形成抑制作用顯著，其中3-蒈烯的抑制率最高，為93.9%，而對(duì)聚傘花素和百里香酚乙酸酯對(duì)成熟的金黃色葡萄球菌生物被膜清除作用比較明顯。結(jié)論：江香薷揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜形成有較強(qiáng)的抑制作用，也具有一定的成熟金黃色葡萄球菌生物被膜清除作用，這可能是江香薷揮發(fā)油中多種化學(xué)成分共同作用的結(jié)果。

江香薷；揮發(fā)油；氣相色譜-質(zhì)譜分析；金黃色葡萄球菌生物被膜；抑制作用

細(xì)菌生物被膜（bacterial biofilm，BBF）是指細(xì)菌附著于惰性的接觸表面生長(zhǎng)，分泌多糖、蛋白質(zhì)等多聚物構(gòu)成胞外基質(zhì)將其自身包裹其中而形成的大量細(xì)菌聚集物［1］。研究［2］表明，BBF的形成是細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的重要原因之一，由于當(dāng)前的抗菌藥物幾乎不能穿透BBF殺死膜內(nèi)的細(xì)菌，從而導(dǎo)致體內(nèi)的慢性持續(xù)性感染。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種重要的食源性病原菌，也是引起醫(yī)源性感染的常見(jiàn)病原體［3-4］。近年來(lái)，金黃色葡萄球菌引起的醫(yī)院內(nèi)感染越來(lái)越多，臨床分離到的多種金黃色葡萄球菌突變株顯示，該菌對(duì)大部分抗菌藥（大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、喹諾酮類(lèi)和β-內(nèi)酰胺類(lèi)）均有耐藥性［5-10］，并呈逐年上升趨勢(shì)。因此，尋求抗BBF的藥物成為現(xiàn)下藥物研發(fā)領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。

江香薷（Mosla chinensis Maxim.cv.Jiangxiangru）是唇形科年生草本植物，是中國(guó)藥典收載的正品香薷之一［11］，其主產(chǎn)地為江西省分宜縣和新余市，味辛，微溫，是藥食同源的藥材，具有良好的食療作用［12］。具有化濕和中，發(fā)汗解表的功效，用于治療消暑濕，惡寒發(fā)熱，無(wú)汗胸悶，腹痛吐瀉等癥狀［13］。揮發(fā)油是江香薷中的主要成分之一，具有抗菌、抗衰老、提高免疫力、抗氧化和殺蟲(chóng)等作用［14-15］。目前，對(duì)江香薷揮發(fā)油及其中主要化學(xué)成分是否具有金黃色葡萄球菌BF的抑制作用還鮮見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在研究江香薷揮發(fā)油的化學(xué)成分及其對(duì)金黃色葡萄球菌BF的影響，為研究揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌BF的形成的抑制作用還是對(duì)成熟的金黃色葡萄球菌BF的清除作用提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

江香薷中藥飲片由江西樟樹(shù)天齊堂中藥飲片有限公司提供，江西科技師范大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室鑒定為唇形科植物江香薷（Mosla chinensis Maxim.cv.Jiangxiangru）的干燥莖葉。金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC 25923）、百里香酚對(duì)照品（含量為99.9%） 中國(guó)食品藥品檢定研究院；香荊芥酚、3-蒈烯、γ-松油烯、對(duì)聚傘花素對(duì)照品（含量＞95%）美國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；百里香酚乙酸酯對(duì)照品（含量≥98%） 美國(guó)Scientific Researh Special公司；香荊芥酚乙酸酯對(duì)照品（含量≥99%） 美國(guó)ChromaDex.Inc公司；α-石竹烯對(duì)照品（含量≥93.0%） 東京化成工業(yè)株式會(huì)社；胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB）、瓊脂粉、胰蛋白胨、牛腦心浸粉、牛肉膏、酸水解酪蛋白、酵母浸粉 北京博奧星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；葡萄糖、可溶性淀粉 天津市福星化學(xué)試劑廠(chǎng)；剛果紅、結(jié)晶紫 天津市化學(xué)試劑廠(chǎng)；精密pH試紙 上海三愛(ài)思試劑有限公司；氫氧化鈉、氯化鈉、磷酸二氫鉀、十二水磷酸氫二鈉、氯化鉀、蔗糖、無(wú)水乙醇、二甲基亞砜、鹽酸均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

MH-1000調(diào)溫型電熱套 北京科偉永興儀器有限公司；6890N+5975i型氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀（配有GC-MS工作站及MSD數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)） 美國(guó)安捷倫公司；Vortex-Genie2渦旋振蕩器 美國(guó)Scientific Industries公司；FA2004N電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；XS203S電子精密天平 瑞士梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司；BSC-1000IIA2生物安全柜 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；SPX-100BZ生化培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)；LDZM-40KCS立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)；MK3型酶標(biāo)儀 賽默飛世東（上海）儀器有限公司；UV-2550紫外-可見(jiàn)分光光度儀日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 江香薷揮發(fā)油的提取

稱(chēng)取100 g江香薷中藥飲片置于揮發(fā)油提取器中，按照《中國(guó)藥典》2015版附錄：XD揮發(fā)油測(cè)定法中甲法，用電熱套加熱，水蒸氣蒸餾提取5 h，至測(cè)定器中油量不再增加，停止加熱，放置片刻，開(kāi)啟測(cè)定器下端的活塞，將水緩緩放出，至油層上端到達(dá)刻度0線(xiàn)上面5 mm處為止。放置1 h以上，再開(kāi)啟活塞使油層下降至其上端恰與刻度0線(xiàn)平齊，讀取揮發(fā)油量，收集淡黃色油狀液體，用無(wú)水硫酸鈉干燥，裝于棕色瓶中低溫保存?zhèn)溆谩＝戕钢袚]發(fā)油提取量為1.5 mL/g。

1.3.2 江香薷揮發(fā)油的GC-MS分析

GC條件：HP-5MS彈性石英毛細(xì)管柱（30 m× 0.25 mm，0.25 μm）；載氣為99.999%的高純氦氣（He）；進(jìn)樣口溫度250 ℃；載氣流量1.0 mL/min；柱前壓7.69 psi；進(jìn)樣量1.0 μL；分流進(jìn)樣，分流比為50∶1；升溫程序：色譜柱初始溫度為50 ℃，保持2 min，以3 ℃/min升至100 ℃，保持10 min；再以1 ℃/min升至120 ℃，保持5 min；接著以2 ℃/min升至150 ℃，保持3 min；最后以4 ℃/min升至250 ℃后，保持5 min。

MS條件：電子電離源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；倍增電壓1.230 kV；電離能量69.9 eV；接口溫度280 ℃；溶劑延遲3 min；質(zhì)量掃描范圍35～550 u。

按照上述GC和MS條件檢測(cè)江香薷揮發(fā)油，得總離子流圖，經(jīng)MS掃描總離子流圖中的各峰后得到質(zhì)譜圖，檢索NIST 11質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)各峰的保留指數(shù)和各峰質(zhì)譜圖和NIST 11質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)中的質(zhì)譜圖對(duì)比，同時(shí)結(jié)合人工譜圖解析，各色譜峰的質(zhì)譜圖與文獻(xiàn)［16-19］核對(duì)，從而確定江香薷揮發(fā)油中的化學(xué)成分，并采用峰面積歸一化法測(cè)定各成分相對(duì)含量。

1.3.3 江香薷揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌BF的影響

1.3.3.1 培養(yǎng)基及供試藥溶液的配制

水解酪蛋白（Mueller-Hinton，MH）肉湯的配制：稱(chēng)取牛肉膏1.2 g、可溶性淀粉0.3 g、酸性水解酪蛋白3.5 g置于500 mL燒杯中，加200 mL蒸餾水，加熱溶解后，冷卻至50 ℃左右，用0.1 mol/mL NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.4±0.1，裝于250 mL的錐形瓶中高壓滅菌備用。

魯利亞-貝爾塔尼（Luria-Bertani，LB）瓊脂培養(yǎng)基的配制：稱(chēng)取胰蛋白胨2.0 g、酵母提取物1.0 g、NaCl 2.0 g、瓊脂3.0 g，置于500 mL燒杯中，加200 mL蒸餾水，加熱溶解后，冷卻至50 ℃左右，用0.1 mol/mL NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.4±0.1，裝于250 mL的錐形瓶中高壓滅菌備用。

剛果紅瓊脂培養(yǎng)基的配制：先稱(chēng)取剛果紅0.04 g溶于裝有10 mL蒸餾水的試管中，再稱(chēng)取牛腦心浸粉3.7 g、蔗糖5.0 g、瓊脂1.0 g，置于500 mL燒杯中，加100 mL蒸餾水，加熱溶解后，冷卻至50 ℃左右，用0.1 mol/mL NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.4±0.1，裝于250 mL錐形瓶中高壓滅菌備用。

含質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%葡萄糖的TSB培養(yǎng)基配制：稱(chēng)取6.0 g TSB、5.0 g葡萄糖，置于500 mL燒杯中，加200 mL蒸餾水，加熱溶解，裝于250 mL錐形瓶中高壓滅菌備用。

最低抑菌濃度（minimun inhibitory concentration，MIC）測(cè)定的供試藥溶液配制：分別精密稱(chēng)取10.00、10.00、19.52、207.80、204.00、233.28、7.80、205.68、20.28 mg江香薷揮發(fā)油、百里香酚、香荊芥酚、3-蒈烯、γ-松油烯、香荊芥酚乙酸酯、百里香酚乙酸酯、對(duì)聚傘花素、α-石竹烯，先用適量的二甲基亞砜（最終含量不大于體積分?jǐn)?shù)2%）充分溶解稱(chēng)好的供試藥，再用MH肉湯培養(yǎng)基稀釋至0.5 mL，混合均勻，用0.22 μm無(wú)菌水相針式過(guò)濾器過(guò)濾，備用。

1.3.3.2 菌株的預(yù)處理

精密稱(chēng)取0.2 mg金黃色葡萄球菌ATCC 25923凍干粉，置于5 mL含質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%葡萄糖的TSB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，涂布100 μL菌液于倒有20 mL LB培養(yǎng)基的平板上，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，選擇LB平板上培養(yǎng)出來(lái)的單個(gè)菌落接種于剛果紅培養(yǎng)基，經(jīng)37 ℃培養(yǎng)48 h后，篩選出菌落變?yōu)楹谏珟Ьw且生長(zhǎng)狀況良好的陽(yáng)性菌株進(jìn)行揮發(fā)油及其各對(duì)照品對(duì)金黃色葡萄球菌BF的實(shí)驗(yàn)。

1.3.3.3 MIC的測(cè)定

采用肉湯常量稀釋法［20-22］測(cè)定江香薷提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC。

菌液的配制：用無(wú)菌接種環(huán)挑取10 株金黃色葡萄球菌接種于LB瓊脂平板，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。挑取菌落分散于MH肉湯中，稀釋至在UV-2550紫外-可見(jiàn)分光光度儀測(cè)得的A600 nm為0.10（該菌液的含菌量約為1×107CFU/mL）。

抑菌實(shí)驗(yàn)：每個(gè)藥物各取12 支高壓滅菌后的試管，排列于試管架上編號(hào)，第1管中加入1.8 mL MH肉湯，其他每支試管加入1.0 mL MH肉湯，第1管中加入0.2 mL 1.3.3.1節(jié)中配制好的藥液，混勻后，取出1.0 mL加入第2管。依次將藥液成倍稀釋至第10管，取出1.0 mL，棄去。第11管不加藥液作為陽(yáng)性對(duì)照，第12管為不加藥液的無(wú)菌肉湯作為空白對(duì)照。在1～11 管中加入0.l mL上述配制好的菌液，最終的接種菌量約5×105CFU/mL。37 ℃培養(yǎng)24 h后，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，無(wú)肉眼可見(jiàn)生長(zhǎng)的最低的藥物濃度為該藥物對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC。該實(shí)驗(yàn)所測(cè)得的MIC用于確定金黃色葡萄球菌BF實(shí)驗(yàn)的藥液濃度。

1.3.3.4 揮發(fā)油及其各對(duì)照品對(duì)金黃色葡萄球菌BF的影響

1）供試藥物對(duì)金黃色葡萄球菌BF形成的抑制作用實(shí)驗(yàn)

根據(jù)文獻(xiàn)［23］，用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%葡萄糖的TSB培養(yǎng)基配制濃度為A600 nm=0.05的金黃色葡萄球菌菌液，再用該菌液配制濃度分別2、1、1/2、1/4、1/8 MIC和1/16 MIC的藥液，各取200 μL接種入96 孔板中，每個(gè)藥物濃度設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，空白對(duì)照孔6 個(gè)復(fù)孔（只加培養(yǎng)基）、另設(shè)陰性對(duì)照孔6 個(gè)復(fù)孔（未加藥的BF生長(zhǎng)對(duì)照），37 ℃培養(yǎng)48 h后，棄去上清液并用磷酸鉀緩沖鹽（PBS pH 7.4）清洗3 次。用0.1%結(jié)晶紫染色30 min，棄去結(jié)晶紫染液，用蒸餾水洗至澄清；加入無(wú)水乙醇溶液200 μL溶解，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔于波長(zhǎng)570 nm處的吸光度。

2）供試藥物對(duì)成熟金黃色葡萄球菌BF的清除作用

向96 孔板中加入200 μL用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%葡萄糖的TSB培養(yǎng)基配制濃度為A600 nm=0.05的金黃色葡萄球菌菌液，37 ℃培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基及懸浮菌，再用PBS清洗3 次，用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%葡萄糖的TSB培養(yǎng)基配制濃度分別為2、1、1/2、1/4、1/8 MIC和1/16 MIC的藥液，依次每孔加入200 μL，相同濃度的藥物做6 個(gè)復(fù)孔，空白對(duì)照孔6 個(gè)復(fù)孔（只加培養(yǎng)基）、另設(shè)陰性對(duì)照孔6 個(gè)復(fù)孔（未加藥的BF生長(zhǎng)對(duì)照），37 ℃培養(yǎng)48 h后，棄去上清液并用PBS清洗3 次。用0.1%結(jié)晶紫染色30 min，棄去結(jié)晶紫染液，用蒸餾水洗至澄清；加入無(wú)水乙醇溶液200 μL溶解，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔于波長(zhǎng)570 nm處的吸光度。

藥物對(duì)金黃色葡萄球菌BF（A570 nm）的抑制率或清除率按下式計(jì)算：

式中：A0空白對(duì)照組A570 nm的平均值；A1為藥物作用組A570 nm的平均值；A2為陰性對(duì)照組A570 nm的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 江香薷揮發(fā)油的GC-MS分析

按1.3.2節(jié)對(duì)從江香薷中提取的揮發(fā)油進(jìn)行GC-MS分析。江香薷揮發(fā)油總離子流圖見(jiàn)圖1；化學(xué)成分GC-MS分析結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 江香薷揮發(fā)油的總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatogram of the essential oil from Mosla chinensis Maxim.cv.Jiangxiangru

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，從江香薷揮發(fā)油中檢出59 個(gè)色譜峰。通過(guò)NIST 11質(zhì)譜庫(kù)檢索，按照1.3.2節(jié)中的結(jié)構(gòu)確定原則，確定了29 個(gè)化合物。再根據(jù)質(zhì)譜離子峰面積歸一化法測(cè)得這些成分的相對(duì)含量占揮發(fā)油總量的99.316%，檢索結(jié)果見(jiàn)表1。江香薷揮發(fā)油中主要含有酚類(lèi)、酯類(lèi)、烯烴、萜類(lèi)、芳香化合物、醇等化合物，其中相對(duì)含量最高的是百里香酚占58.476%，其次為香荊芥酚占22.239%，相對(duì)含量在0.5%以上的還有3-蒈烯占0.937%、對(duì)聚傘花素占5.601%、γ-松油烯占3.545%、百里香酚乙酸酯占2.235%、香荊芥酚乙酸酯占0.611%、α-石竹烯占1.848%，上述8 種成分占揮發(fā)油總量的95.492%。

表1 江香薷揮發(fā)油化學(xué)成分GC-MS分析結(jié)果Table1 Results of GC-MS analysisf orc hemical compositi on of t he essen tial oilfro m Mosla ch in e ns is Ma xim.cv.Jian gx ian gr u

2.2 江香薷揮發(fā)油及主要化學(xué)成分對(duì)金黃色葡萄球菌BF的抑制

2.2.1 各對(duì)照品對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC

表2 各對(duì) 照品 對(duì)金 黃色 葡萄 球菌 的M ICTable 2 MIC of r eferencesubstancesaga in st Staphylococcusaureus

由表2可知，8 個(gè)對(duì)照品中僅有百里香酚、香荊芥酚和百里香酚乙酸酯的MIC比江香薷揮發(fā)油的小，其他對(duì)照品都比揮發(fā)油的大，尤其是3-蒈烯、γ-松油烯和對(duì)聚傘花素都大于10 mg/mL。由此說(shuō)明，百里香酚、香荊芥酚和百里香酚乙酸酯是揮發(fā)油具有良好抗菌效果的主要成分。

2.2.2 供試藥物對(duì)金黃色葡萄球菌BF形成的抑制作用

按照1.3.3.4節(jié)中1）的操作步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，根據(jù)文獻(xiàn)［24］可知結(jié)晶紫檢測(cè)適用于測(cè)定全部細(xì)胞膜，結(jié)晶紫可以染色活菌、死菌及胞外基質(zhì)，形成的BF越多結(jié)合結(jié)晶紫的量就越多，吸光度就越大，BF的量與吸光度呈正比，由此可計(jì)算出各供試藥對(duì)金黃色葡萄球菌BF形成的抑制率。由圖2所示，江香薷揮發(fā)油及其8 種對(duì)照品對(duì)金黃色葡萄球菌BF的形成具有良好抑制作用，隨著濃度的增大，藥物對(duì)金黃色葡萄球菌BF形成的抑制作用能力越強(qiáng)。其中江香薷揮發(fā)油、香荊芥酚、香荊芥酚乙酸酯、α-石竹烯和3-蒈烯的抑制效果較好，其濃度為4 MIC時(shí)，抑制率分別是91.3%、92.5%、93.1%、91.4%和93.9%；濃度為1/4 MIC時(shí)，抑制率大于80%；而百里香酚、γ-松油烯、百里香酚乙酸酯和對(duì)聚傘花素的抑制效果較差，濃度為MIC時(shí)，抑制率都小于50%。說(shuō)明江香薷揮發(fā)油中抑制金黃色葡萄球菌BF形成的主要成分是香荊芥酚、香荊芥酚乙酸酯、α-石竹烯和3-蒈烯。

圖2 揮發(fā)油和8 種化合物對(duì) B B F 形成的抑制作用Fig.2 Inhibition of Staphylococcus aureus biofilm formation by the essential oil and its eight major components

2.2.3 供試藥物對(duì)成熟金黃色葡萄球菌BF的清除作用

圖3 供試藥物對(duì)成熟BBF的清除作用Fig.3 Scavenging effect of the essential oil and its eight major components on mature Staphylococcus aureus biofilm

按照1.3.4.4節(jié)中2）的操作步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，由2.2.2節(jié)可知，BF的量與吸光度的大小呈正比，從而計(jì)算得各供試藥物對(duì)成熟金黃色葡萄球菌BF的清除率。如圖3所示，江香薷揮發(fā)油和8 個(gè)對(duì)照品對(duì)成熟金黃色葡萄球菌BF都有一定的清除作用，而且江香薷揮發(fā)油、百里香酚乙酸酯和對(duì)聚傘花素對(duì)成熟金黃色葡萄球菌BF的清除作用效果較好，其濃度為1/2 MIC時(shí)，清除率大于30%；其中揮發(fā)油的濃度為4 MIC時(shí)，其對(duì)金黃色葡萄球菌BF的清除率為78.5%；而香荊芥酚、香荊芥酚乙酸酯、α-石竹烯、3-蒈烯、百里香酚和γ-松油烯的清除效果則較差，濃度為MIC時(shí)，清除率仍然低于30%。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)首先利用GC-MS的方法對(duì)江香薷揮發(fā)油的化學(xué)成分進(jìn)行分析，檢出59 個(gè)峰，鑒定了其中的29 個(gè)峰，占揮發(fā)油總量的99.316%。與已有文獻(xiàn)［18，24］對(duì)比發(fā)現(xiàn)，相對(duì)含量較高的百里香酚、香荊芥酚、對(duì)聚傘花素、香荊芥酚乙酸酯、百里香酚乙酸酯和α-石竹烯與文獻(xiàn)一致，本實(shí)驗(yàn)新鑒定出了9 個(gè)揮發(fā)油成分，它們分別是3-蒈烯、樅油烯、桉油精、反-4-側(cè)伯醇、（Z）-β-法尼烯、順-β-法尼烯、（Z，E）-α-法尼烯、γ-依蘭油烯和3，7-桉葉二烯。另有30 種化合物未檢出，其原因是參考文獻(xiàn)中的江香薷為鮮藥，而本實(shí)驗(yàn)使用的是江香薷飲片，在藥材炮制和貯存過(guò)程中，江香薷的揮發(fā)油成分發(fā)生了變化。

GC-MS分析結(jié)果顯示，江香薷揮發(fā)油中的主要成分是百里香酚、香荊芥酚、3-蒈烯、對(duì)聚傘花素、γ-松油烯、百里香酚乙酸酯、香荊芥酚乙酸酯和α-石竹烯，上述8 種化學(xué)成分占揮發(fā)油總量的95.492%。因此，本實(shí)驗(yàn)后續(xù)考察江香薷揮發(fā)油和這8 種化合物在2、1、1/2、1/4、1/8 MIC和1/16 MIC條件下對(duì)金黃色葡萄球菌BF的影響。

供試藥物與金黃色葡萄球菌共同培養(yǎng)24 h后，濃度為2 MIC時(shí)，江香薷揮發(fā)油、香荊芥酚、3-蒈烯、香荊芥酚乙酸酯、百里香酚乙酸酯和α-石竹烯對(duì)金黃色葡萄球菌BF的形成有明顯的抑制作用，抑制率都大于90%，這說(shuō)明以上幾種供試藥物在此濃度條件下，可大量殺死浮游狀態(tài)的金黃色葡萄球菌，從而使BF無(wú)法形成。但當(dāng)濃度降低到1/4 MIC時(shí)，僅有香荊芥酚、香荊芥酚乙酸酯、α-石竹烯和3-蒈烯的抑制率能達(dá)到80%以上，這幾種成分可能不是通過(guò)殺死浮游狀態(tài)的細(xì)菌，而是其他途徑（例如調(diào)控與BF形成相關(guān)的基因）抑制BF的形成。而百里香酚、γ-松油烯、百里香酚乙酸酯和對(duì)聚傘花素在所有濃度條件下，對(duì)金黃色葡萄球菌BF的形成抑制作用均較弱。

當(dāng)金黃色葡萄球菌已經(jīng)形成成熟的BF，再用藥物處理后發(fā)現(xiàn)，在所有實(shí)驗(yàn)濃度條件下，百里香酚、3-蒈烯和香荊芥酚乙酸酯的清除率都小于50%，香荊芥酚、γ-松油烯和α-石竹烯的清除率都小于10%。而揮發(fā)油、對(duì)聚傘花素和百里香酚乙酸酯，僅在濃度為2 MIC時(shí)的清除率大于50%，其他濃度條件下的清除率也都低于50%。這些數(shù)據(jù)反映出，BF的形成，顯著增強(qiáng)了金黃色葡萄球菌對(duì)抗菌藥物的耐受力，使得原本在低劑量時(shí)即可抑制BF形成的藥物，需要增加用量方可較為有效的清除已形成的BF。

綜上所述，江香薷揮發(fā)油是一種潛在的抗金黃色葡萄球菌BF藥物，其既可以在低劑量時(shí)顯著抑制金黃色葡萄球菌BF的形成，又可以在增加用量后清除已經(jīng)形成的成熟的金黃色葡萄球菌BF。

4 結(jié) 論

金黃色葡萄球菌是自然界中重要的致病菌之一，易引起食物中毒、肺炎、心包炎、局部化膿感染，甚至全身感染，而且金黃色葡萄球菌容易形成BF，從而使其致病性和耐藥性得以增強(qiáng)，進(jìn)而加大金黃色葡萄球菌感染的治療難度［25］。因此，目前亟需尋求到良好抗菌效果，特別是能夠抑制BBF形成的天然藥物，從而減少該菌的感染及傳播。

江香薷含有大量具有抗菌能力較強(qiáng)的揮發(fā)油，特別是對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果尤為明顯。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，江香薷揮發(fā)油不管是對(duì)金黃色葡萄球菌BF的形成的抑制作用還是對(duì)成熟的金黃色葡萄球菌BF的清除作用都比揮發(fā)油中單獨(dú)化學(xué)成分作用效果好。由此可知，多種揮發(fā)油化學(xué)成分混合可增強(qiáng)抑制作用，但是江香薷揮發(fā)油中的化學(xué)成分比較多，具體作用機(jī)制需進(jìn)一步研究，為研究揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌BF的形成的抑制作用還是對(duì)成熟的金黃色葡萄球菌BF的清除作用提供重要的依據(jù)。

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Chemical Composition Analysis of Essential Oil from Mosla chinensis Maxim.cv.Jiangxiangru and Inhibitory Activity of the Oil and Its Major Constituents on Biofilm Formation of Staphylococcus aureus

LI Zhimin1， WANG Mei2， PENG Liang1，*
（School of Pharmacy， Jiangxi Science and Technology Normal University， Nanchang 330013， China）

Objective: To analyze the chemical composition of the essential oil from Mosla chinensis Maxim.cv.Jiangxiangru and to examine the inhibition of the oil and its main components on the biofilm formation of Staphylococcus aureus.Methods: The chemical composition analysis was carried out by gas chromatography-mass spectrometry （GCMS）.The inhibitory effects of the essential oil and its eight main components were examined against the biofilm formation of Staphylococcus aureus.Results: A total of 29 chemical compositions were identified in the essential oil.Its main components were thymol， carvacrol， p-cymene， γ-terpenene， thymyl acetate， α-caryophyllene， 3-carene， and carvacryl acetate.The percentage inhibition of the biofilm formation of Staphylococcus aureus by the essential oil reached 91.3%，although scavenging only 78.5% of the mature biofilm of Staphylococcus aereus.Carvacrol， 3-carene， carvacryl acetate and α-caryophyllene showed obvious inhibition against the formation of Staphylococcus aureus biofilms.Among these， 3-carene was the most effective inhibitor with a percentage inhibition of 93.9%.On the other hand， both p-cymene and thymyl acetate were able to significantly scavenge the mature biofilm of Staphylococcus aureus.Conclusion: The essential oil from Mosla chinensis Maxim.cv.Jiangxiangru possessed a very strong inhibitory effect on the biofilm formation of Staphylococcus aureus.Moreover， it also could scavenge the mature biofilm of Staphylococcus aureus.This may be a result of the combined effects of several components in the essential oil.

Mosla chinensis Maxim.cv.Jiangxiangru； essential oil； gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）analysis； Staphylococcus aureus biofilms； inhibition

10.7506/spkx1002-6630-201614024

R93

A

1002-6630（2016）14-0138-06

李知敏， 王妹， 彭亮.江香薷揮發(fā)油的化學(xué)成分分析及其對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜的抑制作用［J］.食品科學(xué)， 2016，37（14）: 138-143.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614024. http://www.spkx.net.cn

LI Zhimin， WANG Mei， PENG Liang.Chemical composition analysis of essential oil from Mosla chinensis Maxim.cv.Jiangxiangru and inhibitory activity of the oil and its major constituents on biofilm formation of Staphylococcus aureus［J］.Food Science， 2016， 37（14）: 138-143.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614024.http://www.spkx.net.cn

2015-12-02

江西省青年科學(xué)基金項(xiàng)目（20122BAB215017）

李知敏（1980—），女，講師，碩士，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)。E-mail：Lzmin3026@163.com

*通信作者：彭亮（1980—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)。E-mail：pengliang8036@163.com