張立華，王 丹，宮文哲，唐婷婷（.棗莊學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，山東 棗莊 7760；.棗莊市環(huán)保局，山東 棗莊 77800）

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棗核木醋液化學(xué)成分分析及其抑菌活性

張立華1，王 丹1，宮文哲2，唐婷婷1
（1.棗莊學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，山東 棗莊 277160；2.棗莊市環(huán)保局，山東 棗莊 277800）

為了充分利用棗核資源，采用干餾法（150～400 ℃）制得棗核木醋液，并采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析其化學(xué)成分，通過對(duì)大腸桿菌、青霉菌及石榴干腐病菌的抑菌實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)其抑菌活性。結(jié)果顯示，棗核木醋液中含有35 種化合物，主要為酚類、酮類、有機(jī)酸類、醛類和雜環(huán)化合物等，其中含量最多的是酚類、酮類化合物和有機(jī)酸，三者占總檢出成分的71.01%。棗核木醋液對(duì)大腸桿菌、青霉菌及石榴干腐病菌均有抑制作用，并呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)，對(duì)3 種菌的最小抑菌濃度分別為1.25%、2.5%和0.625%。表明棗核木醋液具有較強(qiáng)的抑菌活性，初步分析酚類物質(zhì)和有機(jī)酸是其抑菌的主要有效成分。

棗核；木醋液；化學(xué)成分；抑菌活性

木醋液是含纖維素、半纖維素的植物材料干餾時(shí)收集的液體混合物經(jīng)靜置并分離出木焦油后的澄清紅褐色液體，具有醋酸的酸味和煙熏氣味［1］。木醋液在國(guó)外已獲得廣泛應(yīng)用，采取不同的精制方法得到的木醋液，作為醫(yī)藥原料、食品添加劑、染料原料、脫臭劑、農(nóng)藥原料、土壤改良劑等，還開辟了飲料添加劑、沐浴添加劑等用途［2］。木醋液作為抑菌劑的應(yīng)用也相當(dāng)廣泛，早在1957年日本國(guó)家研究會(huì)就進(jìn)行過控制腐生菌的實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)木醋液對(duì)抑制腐生菌有效，木醋液稀釋液（酸度0.1%）殺菌效果與0.03%烏斯普龍溶液和0.08%西力生溶液相同。1994年，日本學(xué)者［3-4］實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)木醋液對(duì)腐霉屬、青霉屬、絲核菌、核盤菌屬、鐮刀菌屬等多類病原菌有抑制作用。

棗（Ziziphus jujuba Mill.），鼠李科植物，落葉灌木或小喬木。在國(guó)內(nèi)廣為栽培，被稱為“鐵桿作物”。其成熟果實(shí)紅棗是一種藥食同源食品，隨著人們對(duì)紅棗營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值的深入認(rèn)識(shí)，紅棗也被加工成各種食品，如去核即食棗、紅棗汁［5］、紅棗酒等［6］。在紅棗加工中會(huì)產(chǎn)生副產(chǎn)物棗核，研究表明，棗核中含有酚類［7-8］、類黃酮［9］及總皂苷［10］等活性物質(zhì)，具有開發(fā)利用價(jià)值。但棗核的木質(zhì)化程度高、質(zhì)地堅(jiān)硬，通常被大量廢棄，未能得到充分利用，造成資源浪費(fèi)。

木醋液的組分、性質(zhì)與用途隨原料的種類及制作工藝的不同而存在差別［11］，除各種木材制取木醋液外［12-14］，也有一些果殼被制成木醋液，如核桃殼［11］和苦杏殼木醋液［15］。目前，對(duì)以棗核為原料制取木醋液及其化學(xué)成分和抑菌活性的研究鮮見報(bào)道，本研究以棗核為原料，采用干餾法制取棗核木醋液，分析了其化學(xué)成分及抑菌活性，以期為棗核資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

棗核為棗莊山亭區(qū)店子鎮(zhèn)產(chǎn)長(zhǎng)紅棗棗核，洗凈后自然風(fēng)干。

大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC25922、青霉菌（Penicillium glaucum）CGMCC1842、石榴干腐病菌（Coniella granati）Zy06 棗莊學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。

無水乙醇、氫氧化鈉、氯化鈉、無水乙醚、硫酸銅、無水硫酸鈉均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2000型紫外-可見分光光度計(jì) 尤尼柯上海儀器有限公司；干餾釜 南京林業(yè)大學(xué)林產(chǎn)化工學(xué)院；SPX-300B型生化培養(yǎng)箱 廣州市海輝實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；7000B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 棗核木醋液的制取

參考吳哲洙等［16］方法，將風(fēng)干棗核放入干餾釜中，以1 kW的功率持續(xù)加熱，溫度控制在150～400 ℃范圍，在冷凝裝置中通入冷卻水，冷凝干餾時(shí)產(chǎn)生的氣體，收集餾出液，靜置30 d，木醋液分離為3 層，上層為少量油狀物，中層澄清液，底層為黏稠的木焦油等雜質(zhì)。用虹吸法取中層的澄清液，并與5%的活性炭粉末混合，攪拌10 min，靜置3 d，過濾得精制棗核木醋液。

1.3.2 總酚含量測(cè)定

取精制的棗核木醋液用蒸餾水稀釋200 倍，然后采用Folin-酚法［17］測(cè)定其總酚含量，以鄰苯二酚為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3.3 總酮含量測(cè)定

取精制的棗核木醋液用蒸餾水稀釋20 倍，然后采用Al（NO3）3-NaNO2比色法［18］測(cè)定其總酮含量，以甲基環(huán)戊烯醇酮為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3.4 有機(jī)酸含量測(cè)定

采用酸堿滴定法，有機(jī)酸含量以醋酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)［19］。

1.3.5 棗核木醋液的有機(jī)成分分析

1.3.5.1 棗核木醋液的預(yù)處理

參照史冠昭等［11］方法預(yù)處理?xiàng)椇四敬滓?，取精制木醋?0 mL，每次用10 mL乙醚，萃取6 次，合并乙醚萃取液，加入2.0 g無水硫酸鈉吸收其中的水分，過濾后使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醚，萃取液濃縮至3 mL，用作氣相色譜-質(zhì)譜待測(cè)樣品。

1.3.5.2 氣相色譜-質(zhì)譜測(cè)定

采用直接進(jìn)樣法［11］對(duì)棗核木醋液萃取濃縮液成分用氣相色譜-質(zhì)譜法進(jìn)行分析，具體氣相色譜條件：進(jìn)樣口溫度220 ℃，柱溫60 ℃，恒溫2 min后，以6.0 ℃/min速率升溫至240 ℃，恒溫8 min；分流進(jìn)樣80∶1；載氣流速1.0 mL/min。電子電離源，電子能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍35～400 u，質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)庫NIST11。

1.3.6 抑菌實(shí)驗(yàn)

1.3.6.1 大腸桿菌和青霉菌抑菌實(shí)驗(yàn)

采用濾紙片法測(cè)定大腸桿菌和青霉的抑菌圈直徑［20］。大腸桿菌菌種在LB液體培養(yǎng)基中于37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h；將已經(jīng)活化的青霉菌菌株，選取4 環(huán)菌苔，用無菌水制成含菌數(shù)約107～109CFU/mL的菌懸液。LB固體培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基滅菌后倒在直徑9 cm的培養(yǎng)皿中，取100 μL上述菌液加在凝固的培養(yǎng)基上，并涂布均勻。將棗核木醋液原液用無菌水分別稀釋2、4、8 倍，并標(biāo)記為M1、M2、M3，把直徑7 mm的濾紙圓片放置在上述3 種體積分?jǐn)?shù)的棗核木醋液中浸泡。取浸泡好的濾紙片貼于已涂菌的培養(yǎng)基表面，每個(gè)體積分?jǐn)?shù)設(shè)5個(gè)重復(fù)，另用滅菌水代替樣品設(shè)置空白對(duì)照，大腸桿菌以效價(jià)10 U/mL的慶大霉素作為陽性對(duì)照，青霉菌以5% CuSO4溶液作為陽性對(duì)照。37 ℃倒置培養(yǎng)，大腸桿菌培養(yǎng)24 h，青霉菌培養(yǎng)72 h，十字交叉法測(cè)量其抑菌圈直徑，以抑菌圈的大小表示抑菌活性。抑菌率的計(jì)算公式如下：

1.3.6.2 石榴干腐病菌抑菌實(shí)驗(yàn)

采用菌絲生長(zhǎng)速率抑制法［21］測(cè)定石榴干腐病菌的菌落直徑。將PDA培養(yǎng)基熔化冷卻至50 ℃倒入培養(yǎng)皿（規(guī)格為6 cm），每皿10 mL，冷卻凝固后，用移液槍取50 μL不同體積分?jǐn)?shù)（M1、M2、M3）木醋夜于培養(yǎng)皿中，用涂布棒均勻涂開，另用滅菌水代替樣品作為空白對(duì)照，以5% CuSO4溶液作為陽性對(duì)照。用滅菌打孔器取直徑6 mm的圓形菌片，移到制備好的含各處理樣液的平板上，每個(gè)處理重復(fù)5 次，最后將各皿放入28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，取出后測(cè)定其菌落直徑。抑菌率的計(jì)算公式如下：

1.3.7 最小抑菌濃度測(cè)定

采用2 倍稀釋法［22］，將精制的棗核木醋液原液用10%吐溫-80稀釋至體積分?jǐn)?shù)100%～3.125% 6 個(gè)梯度，然后吸取1 mL加入9 mL馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中，振蕩充分混勻倒平板，使培養(yǎng)基中木醋液最終體積分?jǐn)?shù)為10%、5%、2.5%、1.25%、0.625%及0.312 5%。待培養(yǎng)基冷卻后，用預(yù)先培養(yǎng)好的菌懸液劃線接種，分別按前述條件培養(yǎng)，每一體積分?jǐn)?shù)均做3 組平行實(shí)驗(yàn)。觀察結(jié)果，從無菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)皿中找出最小抑菌濃度的培養(yǎng)皿，即為提取液的最小抑菌濃度。以10%吐溫-80作為對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 棗核木醋液中總酚、總酮及有機(jī)酸含量

分別分析得到棗核木醋液中總酚含量為26.3 mg/mL，總酮含量為25.8 mg/mL，有機(jī)酸含量為7.81%。徐社陽等［23］報(bào)道工業(yè)品木醋液中有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)占到5.13%，其他有機(jī)成分的相對(duì)含量為4.97%。史冠昭等［11］所制核桃殼木醋液中有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高為6.31%，并認(rèn)為干餾溫度越高有機(jī)酸含量越低。相比較，本研究所制棗核木醋液有機(jī)酸含量相對(duì)較高。

2.2 棗核木醋液氣相色譜-質(zhì)譜分析結(jié)果

圖1 棗核木醋液氣相色譜-質(zhì)譜總離子流圖Fig.1 GC-MS total ion chromatogram of the pyroligneous acid

如圖1所示，經(jīng)Origin 8.0和人工解析確定物質(zhì)種類，根據(jù)峰面積歸一法確定物質(zhì)的相對(duì)含量，共檢出35 種成分，具體成分見表1。

表1 精制棗核木醋液氣相色譜-質(zhì)譜分析結(jié)果Table1 Results of GC-MS analysis of the pyroligneous acid

由表2可以看出，棗核木醋液的乙醚萃取物中，含量最多的是酚類化合物，共9 種，總含量為35.93%；其次是酮類化合物，共14 種，總含量為26.88%；呋喃類衍生物4 種，占13.41%；有機(jī)酸3 種，總含量為8.20%，其中主要是乙酸，占6.40%；酯類化合物共3 種，占7.76%；此外，還含有少量的醇類、烷類和含氮有機(jī)化合物。酚類和酮類化合物含量達(dá)到62.81%，是棗核木醋液中的主要成分。

2.3 棗核木醋液抑菌作用

2.3.1 對(duì)大腸桿菌抑制效果

表2 不同 體積 分?jǐn)?shù) 精制 棗核 木醋 液對(duì) 大腸 桿菌 的抑 制效 果Table 2 Antibacterialactivityaga in st E.c oli of the pyrolign eousacid at differentc on centrati on s

由表2可以看出，3 種體積分?jǐn)?shù)的棗核木醋液對(duì)大腸桿菌均有抑制作用，其中，M1對(duì)供試大腸桿菌的抑制作用略高于陽性對(duì)照，M2也具有顯著的抑菌效果，M3的抑菌效果相對(duì)較差。棗核木醋液對(duì)大腸桿菌的抑制作用表現(xiàn)明顯的劑量依賴效應(yīng)。

2.3.2 對(duì)青霉菌抑制效果

表3 不同 體積 分?jǐn)?shù) 棗核 木醋 液對(duì) 青霉 菌的 抑制 效果Table 3 Antimicrobiala ctivityaga in stP enici llium glaucum of the py rol ign eou sa cid at differentc on centrati on s

由表3可以看出，3 種體積分?jǐn)?shù)的棗核木醋液對(duì)青霉菌均有一定的抑制作用，其中，M2的抑菌作用與陽性對(duì)照相同，M1的抑菌作用最強(qiáng)，效果顯著優(yōu)于5% CuSO4溶液陽性對(duì)照，M3的抑菌作用相對(duì)較弱。棗核木醋液的稀釋倍數(shù)與抑菌活性呈反相關(guān)。

2.3.3 對(duì)石榴干腐病菌抑制效果

表4 不同體積分?jǐn)?shù)棗核木醋液對(duì)石榴干腐病菌的抑制效果Table 4 Antimicrobial activity against Coniellagranatio f the pyroligneous acid at different concentrations

如表4所示，采用生長(zhǎng)速率抑制法評(píng)價(jià)抑菌活性，菌落直徑越小表示抑菌效果越明顯?？梢钥闯?，M1、M2和M3對(duì)石榴干腐病菌均有一定的抑制作用。其中M1的抑菌作用最強(qiáng)，效果要明顯好于5% CuSO4溶液陽性對(duì)照，且存在顯著差異，M2的抑菌作用與陽性對(duì)照相當(dāng)，M3的抑菌作用相對(duì)較弱。棗核木醋液對(duì)石榴干腐病菌的抑制作用也表現(xiàn)明顯的劑量依賴效應(yīng)。

2.3.4 最小抑菌濃度測(cè)定結(jié)果

棗核木醋液對(duì)3 種供試菌株均有抑菌效果，但對(duì)不同供試菌的最小抑菌濃度有差別，對(duì)石榴干腐病菌有較好的效果，最小抑菌濃度為0.625%，對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度為1.25%，對(duì)青霉菌的抑菌作用相對(duì)較弱，其最小抑菌濃度為2.5%，和上述抑菌實(shí)驗(yàn)的結(jié)果有一致性。

3 討論與結(jié)論

采用常規(guī)化學(xué)分析的方法測(cè)定出棗核木醋液中總酚含量為26.3 mg/mL，總酮含量為25.8 mg/mL，有機(jī)酸體積分?jǐn)?shù)為7.81%。進(jìn)一步通過氣相色譜-質(zhì)譜分析其成分及相對(duì)含量，其中含量最多的是酚類化合物，其次為酮類和有機(jī)酸，三者含量占總檢出成分的71.01%，兩種結(jié)果相互印證。本研究從棗核木醋液中共檢出35 種化合物，除酚類、有機(jī)酸類、酮類外，還有呋喃類雜環(huán)化合物、醇類、酯類和含氮有機(jī)化合物。毛巧芝等［24］在170～370 ℃溫度段苦杏殼木醋液中檢出化合物27 種，王元等［25］在90～190、190～300 ℃及300～480 ℃ 3 個(gè)溫度段的核桃殼木醋液中分別檢出13、42 種和37 種物質(zhì)。對(duì)比分析，不同植物材料的木醋液中化合物的類別基本相同，主要是酸類、酚類、醛類、酮類、醇類、呋喃和酯類等，具體物質(zhì)所占的比例存在差別，如本研究檢出棗核木醋液中酚類化合物相對(duì)含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為35.93%，酮類化合物為26.88%，有機(jī)酸為8.20%；而已有研究［24］苦杏殼木醋液中酚類物質(zhì)相對(duì)含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為42.83%，酸類為23%，酮類為6.23%。王元等［25］發(fā)現(xiàn)核桃殼木醋液中乙酸的相對(duì)含量隨收集溫度的升高逐漸減少。說明不同植物材料、不同干餾工藝會(huì)影響所制木醋液的化學(xué)成分。

抑菌實(shí)驗(yàn)和最小抑菌濃度實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均表明，棗核木醋液對(duì)細(xì)菌、霉菌及植物致病菌均具有抑制作用，且表現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。木醋液中的乙酸是典型的抑菌物質(zhì)，此外，酚類物質(zhì)一般具有較強(qiáng)的抗菌活性，簡(jiǎn)單的酚類化合物如石炭酸（苯酚），是人們熟知的一種常用殺菌劑。棗核木醋液中酚類物質(zhì)含量較高，因此，可以推測(cè)棗核木醋液中酚類化合物是抑菌的主要成分。當(dāng)然，抑菌作用也可能為多種物質(zhì)的協(xié)同作用結(jié)果。

棗核木醋液作為天然抗菌劑，在食品、醫(yī)藥、環(huán)境保護(hù)及農(nóng)業(yè)病害防治等方面具有進(jìn)一步開發(fā)利用的價(jià)值。尤其近年來設(shè)施農(nóng)業(yè)在我國(guó)得到快速發(fā)展，在給農(nóng)業(yè)帶來可觀經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)，由于保護(hù)設(shè)施內(nèi)特殊的微生態(tài)環(huán)境，極易發(fā)生由霉菌和細(xì)菌引起的病害，使用化學(xué)農(nóng)藥雖然可以收到良好的防治效果，但容易造成農(nóng)藥殘留，木醋液作為一種天然的植物源殺菌劑，無疑具有很大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

綜上所述，棗核木醋液所含化學(xué)成分比較豐富，對(duì)細(xì)菌和真菌具有較強(qiáng)的抑菌活性，利用棗核生產(chǎn)木醋液可以為棗核資源的利用開辟新途徑，提高資源利用率，也為農(nóng)業(yè)病害防治提供安全環(huán)保的產(chǎn)品。

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Chemical Constituents and Antimicrobial Activities of Pyroligneous Acid from Jujube Pit

ZHANG Lihua1， WANG Dan1， GONG Wenzhe2， TANG Tingting1
（1.College of Life Science， Zaozhuang University， Zaozhuang 277160， China；2.Zaozhuang Municipal Environmental Protection Bureau， Zaozhuang 277800， China）

To achieve the comprehensive utilization of jujube pit， pyroligneous acid was prepared by pyrolyzing jujube pit at 150 to 400 ℃ to analyze its chemical constituents by gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） and test its antimicrobial activities against Escherichia coli， Penicillium glaucum and Coniella granati.The results showed that a total of 35 compounds were detected by GC-MS analysis from the pyroligneous acid， mainly phenols， ketones， organic acids，aldehydes， heterocyclic compounds， etc.Among them， the most abundant were phenols， ketones and organic acid， which accounted for 71.01% of the total amount of compounds detected.All pyroligneous acids with three different concentrations showed significant antimicrobial activities in a dose-dependent manner.The minimum inhibitory concentrations （MIC） of the pyroligneous acid against Escherichia coli， Penicillium glaucum and Coniella granati were 1.25%， 2.5% and 0.625%，respectively.These results preliminarily suggested that phenols and organic acids were the active components responsible for the antimicrobial activity of pyroligneous acid.

jujube pit； pyroligneous acid； chemical constituents； antimicrobial activity

10.7506/spkx1002-6630-201614021

S482.2

A

1002-6630（2016）14-0123-05

張立華， 王丹， 宮文哲， 等.棗核木醋液化學(xué)成分分析及其抑菌活性［J］.食品科學(xué)， 2016， 37（14）: 123-127.DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201614021. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Lihua， WANG Dan， GONG Wenzhe， et al.Chemical constituents and antimicrobial activities of pyroligneous acid from jujube pit［J］.Food Science， 2016， 37（14）: 123-127.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614021. http://www.spkx.net.cn

2015-11-01

山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ZR2013BL018）

張立華（1969—），男，教授，博士，研究方向?yàn)橹参镔Y源開發(fā)及采后生理。E-mail：chinazhanglh@163.com