鄧高毅，彭 宇，王遠(yuǎn)亮（.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院/食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 408；.湖南中煙技術(shù)中心，湖南 長(zhǎng)沙 4004）

降煙堿解淀粉芽孢桿菌和邊緣假單胞菌原生質(zhì)體融合選育高效降煙堿菌株

鄧高毅1，彭 宇2，王遠(yuǎn)亮1
（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院/食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南中煙技術(shù)中心，湖南 長(zhǎng)沙 410014）

獲取1株高效降解煙堿的融合子，以解淀粉芽孢桿菌T11和邊緣假單胞菌作為親本菌株，使用溶菌酶破除親株細(xì)胞壁后以40%PEG-6000誘導(dǎo)解淀粉芽孢桿菌T11原生質(zhì)體和已熱力滅活的邊緣假單胞菌原生質(zhì)體進(jìn)行融合，并檢測(cè)了融合子的降煙堿能力。對(duì)融合子利用青霉素抗性初篩獲得了176株再生融合子，利用煙堿降解率為指標(biāo)進(jìn)行降煙堿復(fù)篩實(shí)驗(yàn)后獲得5株煙堿降解能力較高的融合子。根據(jù)融合子遺傳穩(wěn)定性分析及與親本菌株煙堿降解效率的對(duì)比，獲得了1株煙堿降解率比親本菌株更強(qiáng)的融合子A2。獲得的高效降解融合子A2在第5天后其煙堿降解率基本穩(wěn)定在93%。

解淀粉芽孢桿菌T11；邊緣假單胞菌；原生質(zhì)體；融合子；煙堿

鄧高毅，彭宇，王遠(yuǎn)亮.降煙堿解淀粉芽孢桿菌和邊緣假單胞菌原生質(zhì)體融合選育高效降煙堿菌株［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，43 （6）：143-148.

煙堿含量是評(píng)價(jià)煙葉品質(zhì)好壞的重要指標(biāo)之一?？緹煹臒焿A含量一般要求在1.5%～3.5%，然而近年研究發(fā)現(xiàn)，我國(guó)部分地區(qū)種植的煙草煙堿含量偏高，特別是煙草上部煙葉，有的煙堿平均含量在4%以上［1-2］，這不僅嚴(yán)重影響了煙葉品質(zhì)，而且過(guò)高的煙堿含量會(huì)對(duì)廣大吸煙者的神經(jīng)產(chǎn)生更強(qiáng)的刺激作用，進(jìn)而危害身心健康。傳統(tǒng)種植工藝通過(guò)改善種植條件或采用優(yōu)化打頂技術(shù)等手段，以期降低煙草中過(guò)高的煙堿含量，但是效果不佳［3-4］。

利用微生物降低煙草中過(guò)高的煙堿含量既經(jīng)濟(jì)又環(huán)保。國(guó)內(nèi)外學(xué)者已從煙草生長(zhǎng)環(huán)境中分離出多種具有降煙堿能力的微生物，且國(guó)外在利用微生物降解煙葉煙堿方面已開(kāi)展了大量的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究［5-7］，如Newton等［8］使用假單胞菌菌液降解煙絲中的煙堿，18 h后煙絲煙堿含量由2.0%下降至0.8%。目前國(guó)內(nèi)對(duì)微生物應(yīng)用于降解煙堿研究起步較晚且缺乏系統(tǒng)連續(xù)性的研究［9］。

本試驗(yàn)前期已從健康煙葉和煙草種植土壤中分離得到1株降煙堿解淀粉芽孢桿菌T11和1株邊緣假單胞菌，其煙堿降解率分別為80.6%、76.3%［11-12］，擬利用原生質(zhì)體融合技術(shù)進(jìn)一步提高其煙堿降解能力。原生質(zhì)體融合是指通過(guò)人為操作的方法，將遺傳性狀不同的兩個(gè)細(xì)胞的原生質(zhì)體進(jìn)行融合，以此獲得兼有雙親遺傳性狀的穩(wěn)定重組子的一種基因重組技術(shù)。這種技術(shù)打破了微生物的種界界限，不僅在種內(nèi)、種間，而且在親緣很遠(yuǎn)的兩個(gè)物種之間都可能進(jìn)行融合，能擴(kuò)大融合頻率和幅度，是一種常見(jiàn)的微生物育種方法。原生質(zhì)體融合與常規(guī)雜交相比有很多優(yōu)勢(shì)，不但能顯著提高重組頻率，而且具有定向育種的含義，目前該技術(shù)已成為細(xì)胞生物學(xué)迅速發(fā)展的方向之一［10］。因此，本研究以解淀粉芽孢桿菌T11和邊緣假單胞菌為親本菌株進(jìn)行原生質(zhì)體融合，以期選育高效降解煙堿的融合子。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 降煙堿細(xì)菌 解淀粉芽孢桿菌T11（對(duì)青霉素敏感），由本實(shí)驗(yàn)室從煙葉內(nèi)部分離、鑒定及保存［11］；邊緣假單胞菌（可抗青霉素），由本實(shí)驗(yàn)室從煙草土壤中分離、鑒定及保存［12］。

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基 （1）液體完全培養(yǎng)基：酵母提取物5 g，蛋白胨10 g，葡萄糖5 g，氯化鈉10 g，水1 000 mL，pH7.0，添加2%瓊脂即為固體完全培養(yǎng)基。

（2）高滲液體再生培養(yǎng)基：于（1）中加入0.5 mol/L蔗糖，調(diào)節(jié)pH值至7.0，100～115℃滅菌15 min，溫度過(guò)高易使蔗糖發(fā)生焦糖化反應(yīng)，添加2%瓊脂即為高滲固體再生培養(yǎng)基。

（3）高滲融合子固體篩選培養(yǎng)基：于（2）中加入青霉素，使其終濃度為100 U/mL。

（4）原生質(zhì)體穩(wěn)定液（SMM）：0.5 mol/L蔗糖，0.02 mol/L氯化鎂，0.02 mol/L順丁烯二酸，使用Tris緩沖液配制，調(diào)節(jié)pH值至6.5。

（5）0.01 mol/L Tris緩沖液，調(diào)pH值至6.5。

（6）高滲Tris緩沖液：于（5）中加入0.5 mol/L蔗糖，0.01 mol/L氯化鈣。

（7）6 U/mL青霉素溶液：生理鹽水配制，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌。

（8）4 mg/mL甘氨酸溶液：蒸餾水配制，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌。

（9） 0.1 mol/L EDTA溶液：蒸餾水配制，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌。

（10）4 mg/mL溶菌酶液：SMM配制，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌。

（11）促融合劑PEG液：40%PEG-6000，使用（6）液配制，120℃滅菌21 min。

（12）液體煙堿培養(yǎng)基：0.5 mL微量溶液（0.4 g MnSO4·7H2O，0.2 g CaC12·2H2O，0.2 g FeSO4·7H2O，用0.1 mol/L鹽酸定容至100 mL），1 g煙堿，13.3 g K2HPO4·3H20，4 g KH2PO4，0.2 g MgSO4·7H2O，蒸餾水定容至1 000 mL［13］。添加2%瓊脂粉即為固體煙堿培養(yǎng)基。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 分析天平（湘儀天平有限公司）、DK-BD型電熱恒溫水槽（上海一恒科技有限公司）、SW-CJ-1FD型超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、GZX250型生化培養(yǎng)箱（天津瑪福爾生化培養(yǎng)）、TDL-5000bR型冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）、紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)（日本島津有限公司）、OLMPUS顯微鏡、AJ50585型微量移液器（法國(guó)）、手持精密pH計(jì)（美國(guó)）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 煙堿含量的測(cè)定 取2 mL液體煙堿發(fā)酵液于10 000 r/min下離心10 min，取上清液0.25 mL 于50 mL 容量瓶中，用0.05 mol/L鹽酸定容，搖勻。以不加入煙堿的發(fā)酵液液作為空白對(duì)照，于259 nm波長(zhǎng)下測(cè)各發(fā)酵液中煙堿的吸光值［14］。并依據(jù)煙堿標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出煙堿含量，計(jì)算液體煙堿發(fā)酵液中煙堿的降解率。

1.2.2 解淀粉芽孢桿菌T11原生質(zhì)體的制備 制備解淀粉芽孢桿菌T11生長(zhǎng)曲線，按制備生長(zhǎng)曲線的條件培養(yǎng)其至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期，加入終濃度為6 U/mL的青霉素溶液和4 mg/mL的甘氨酸溶液后培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，7 000 r/min離心5 min，棄上清液，使用Tris緩沖液洗滌菌體3次，懸浮于9 mL預(yù)熱至35℃高滲Tris緩沖液中，添加預(yù)熱至35℃的溶菌酶溶液使其終濃度為4 mg/mL，置于恒溫水浴鍋中35℃保溫酶解，30 min后取樣鏡檢觀察破壁情況，每隔10 min取樣鏡檢觀察，當(dāng)絕大部分菌體破壁形成原生質(zhì)體時(shí)離心，停止酶解，棄上清后使用高滲Tris緩沖液洗滌3次，將原生質(zhì)體懸浮于SMM中并置于冰箱保存、備用。原生質(zhì)體形成率、再生率的計(jì)算參照文獻(xiàn)［15］進(jìn)行。

1.2.3 邊緣假單胞菌原生質(zhì)體的制備 制備邊緣假單胞菌的生長(zhǎng)曲線，按制備生長(zhǎng)曲線的條件培養(yǎng)其至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，7 000 r/min離心5 min，棄上清液，使用Tris緩沖液洗滌菌體3次，懸浮于9 mL的預(yù)熱至35℃高滲Tris緩沖液中，加入用高滲Tris緩沖液配制并預(yù)熱至35℃的EDTA，使其終濃度為0.1 mol/L，添加預(yù)熱至35℃的溶菌酶溶液使其終濃度為4 mg/mL，置于恒溫水浴鍋中35℃保溫酶解，30 min后取樣鏡檢觀察破壁情況，每隔10 min取樣鏡檢觀察，適時(shí)停止酶解，離心棄上清后使用高滲Tris緩沖液洗滌菌體3次，將原生質(zhì)體懸浮于SMM中并置于冰箱保存、備用。原生質(zhì)體形成率、再生率的計(jì)算參照文獻(xiàn)［15］進(jìn)行。

1.2.4 邊緣假單胞菌原生質(zhì)體的熱力滅活 取若干管同等數(shù)量級(jí)（5 mL/管，濃度為109cfu/mL）保存于冰箱的邊緣假單胞菌原生質(zhì)體懸液轉(zhuǎn)移至50 mL的三角瓶中，置于65℃恒溫水浴鍋中分別保溫0、5、10、15、20、25、30、35、40 min 后，各取100 μL菌液涂布于高滲固體再生培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5～7 d，計(jì)算再生菌落數(shù)。以熱力滅活時(shí)間為橫坐標(biāo)、滅活率為縱坐標(biāo)作熱力滅活曲線。

熱力滅活率（%）=（滅活前每100 μL菌液涂布后的菌落數(shù)-滅活后每100 μL菌液涂布后的菌落數(shù)）/滅活前每100 μL菌液涂布后的菌落數(shù)×100

1.2.5 PEG-6000誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合及融合子的再生、篩選 取解淀粉芽孢桿菌T11（對(duì)青霉素敏感）原生質(zhì)體和已經(jīng)熱力滅活的邊緣假單胞菌（可抗青霉素）原生質(zhì)體懸液各1 mL，小心混勻后于4℃、3 000 r/min下離心10 min，棄去上清液，加入40%PEG促融劑1 mL，于35℃恒溫水浴鍋中保溫促融3 min。于4℃、3 000 r/min下再次離心10 min，棄上清，使用SMM穩(wěn)定液經(jīng)10倍系列稀釋后各取100 μL涂布于高滲融合子固體篩選培養(yǎng)基上，35℃培養(yǎng)2～3 d，觀察并計(jì)算菌落總數(shù)及融合率。因?yàn)檫吘壖賳伟煽骨嗝顾兀獾矸垩挎邨U菌T11對(duì)青霉素極其敏感，所以只有當(dāng)已被熱力滅活的邊緣假單胞菌原生質(zhì)體和解淀粉芽孢桿菌T11原生質(zhì)體發(fā)生了真正的融合，才能在高滲融合子固體篩選培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。

融合率（%）=滅活后高滲融合子固體篩選培養(yǎng)基上平均菌落數(shù)（個(gè)/100 μL ）/滅活前再生培養(yǎng)基上平均菌落數(shù)（個(gè)/100 μL）×100

1.2.6 融合子降煙堿能力的遺傳穩(wěn)定性 將篩選得到的融合子全部轉(zhuǎn)接至煙堿固體培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)3～5 d，對(duì)能在煙堿固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出來(lái)的融合菌株進(jìn)行降煙堿能力檢測(cè)。挑取降煙堿能力最強(qiáng)的5個(gè)融合子進(jìn)行傳代試驗(yàn)，傳接10代并測(cè)定每次傳代后其降煙堿能力，操作方法為每次挑取1環(huán)菌體加入到5 mL液體煙堿培養(yǎng)基（煙堿濃度為1 g/L）中，5 d后于10 000 r/min下離心10 min，根據(jù)1.2.1方法測(cè)出煙堿降解率。

1.2.7 融合子與親株間降煙堿能力的比較 選取降煙堿能力且遺傳穩(wěn)定性最好的融合子菌株與出發(fā)菌株解淀粉芽孢桿菌T11、邊緣假單胞菌進(jìn)行降煙堿能力的檢測(cè)與對(duì)比。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin8.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙堿標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照煙堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法配制一系列濃度的煙堿標(biāo)準(zhǔn)溶液，波長(zhǎng)259 nm下測(cè)定其吸光度值，以煙堿濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，使用Origin8.0軟件作煙堿標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。

圖1 煙堿濃度與吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 解淀粉芽孢桿菌T11與邊緣假單胞菌的生長(zhǎng)曲線

解淀粉芽孢桿菌T11及邊緣假單胞菌接種培養(yǎng)后，于13 h之前每隔1 h在波長(zhǎng)600 nm下測(cè)定吸光度值，13 h后每隔2 h測(cè)定1次，使用Origin8.0軟件作生長(zhǎng)曲線，如圖2所示。

圖2 解淀粉芽孢桿菌T11和邊緣假單胞菌的生長(zhǎng)曲線

微生物的生長(zhǎng)階段分為遲緩期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期和衰亡期，每個(gè)階段的菌體對(duì)環(huán)境的敏感度存在較大差別。對(duì)于細(xì)菌而言，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的菌體，其細(xì)胞壁更容易被溶菌酶破壞結(jié)構(gòu)而達(dá)到破壁的效果，此時(shí)原生質(zhì)體的制備率更高，而處于其他生長(zhǎng)階段的菌體細(xì)胞壁對(duì)溶菌酶的敏感性較差。由圖2可看出，解淀粉芽孢桿菌T11在接種4 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期，11 h開(kāi)始進(jìn)入穩(wěn)定期；而邊緣假單胞菌則是接種3 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期，11 h達(dá)到穩(wěn)定期。因此，試驗(yàn)選擇解淀粉芽孢桿菌T11在接種5 h時(shí)（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期）加入青霉素及甘氨酸后繼續(xù)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期（10 h時(shí)），邊緣假單胞菌培養(yǎng)至10 h時(shí)取出離心制備原生質(zhì)體。

2.3 酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體形成率和再生率的影響

酶解時(shí)間對(duì)解淀粉芽孢桿菌T11和邊緣假單胞菌原生質(zhì)體的形成率、再生率的影響如圖3所示。對(duì)于解淀粉芽孢桿菌T11而言，其原生質(zhì)體形成率隨酶解時(shí)間的增加而升高，而再生率則在酶解時(shí)間為60 min后急劇下降，當(dāng)酶解時(shí)間為90 min時(shí)形成率雖然達(dá)到了最大值98.7%，可再生率卻由酶解時(shí)間為60 min時(shí)的83.7%下降到40.5%，導(dǎo)致再生率下降的原因是隨著時(shí)間的推移解淀粉芽孢桿菌T11原生質(zhì)體脫水較為嚴(yán)重，從而失去了再生能力。邊緣假單胞菌于酶解60 min前，原生質(zhì)體形成率和再生率均呈上升趨勢(shì)，分別達(dá)到了68.2%和62.3%，而再生率緊接著出現(xiàn)了大幅度下降，在90 min時(shí)下降至30.1%。綜合考慮上述影響因素，解淀粉芽孢桿菌T11和邊緣假單胞菌細(xì)胞壁的最佳酶解時(shí)間均應(yīng)控制在60 min。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體形成率和再生率的影響

2.4 邊緣假單胞菌原生質(zhì)體熱滅活對(duì)滅活率的影響

原生質(zhì)體熱力滅活只是使邊緣假單胞菌原生質(zhì)體失去單獨(dú)存活于再生培養(yǎng)基上的能力，但其染色體仍然保留復(fù)制及與其他原生質(zhì)體染色體重組等能力［16］。試驗(yàn)表明，保溫溫度為60℃時(shí)，邊緣假單胞菌原生質(zhì)體的滅活率在5～20 min之間由10.3%增至92%，在25 min時(shí)滅活率達(dá)到100%。因此，邊緣假單胞菌原生質(zhì)體的滅活試驗(yàn)時(shí)間選擇為25 min。

2.5 PEG-6000促融時(shí)間對(duì)融合率的影響

試驗(yàn)以40%PEG-6000為促融劑、45℃下誘導(dǎo)解淀粉芽孢桿菌T11和已熱力滅活的邊緣假單胞菌原生質(zhì)體進(jìn)行融合。在不同促融時(shí)間下測(cè)定了原生質(zhì)體的融合率，結(jié)果表明，促融時(shí)間1、2、3、5、7、9 min時(shí)，融合率分別為2.4×10-6、3.9×10-6、4.7×10-6、3.5×10-6、2.2×10-6、6.7×10-7。可見(jiàn)，促融時(shí)間1～3 min之間，融合率呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，3 min時(shí)達(dá)最大值4.7×10-6，但隨著促融時(shí)間的延長(zhǎng)原生質(zhì)體的融合率反而下降，9 min比7 min時(shí)的融合率降低了一個(gè)數(shù)量級(jí)。這說(shuō)明在較短的時(shí)間內(nèi)（1～3 min）PEG-6000起到了較好的促融效果，但由于PEG-6000的存在對(duì)原生質(zhì)體具有較大毒性作用［17］，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)反而不利于融合子的再生。因此，促融時(shí)間以3 min為宜。

2.6 融合子遺傳穩(wěn)定性的檢測(cè)

經(jīng)初步篩選，共獲得了176株再生融合子，利用煙堿選擇性培養(yǎng)基進(jìn)一步復(fù)篩，得到5株降煙堿能力較強(qiáng)的融合子。對(duì)降煙堿能力最強(qiáng)的5個(gè)融合子進(jìn)行傳代試驗(yàn)，分別標(biāo)記為融合子A1、A2、A3、A4、A5，每個(gè)融合子每次傳代后檢測(cè)降煙堿能力，均設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)，分析結(jié)果見(jiàn)表1。經(jīng)單因素方差分析（表2），融合子A1、A3、A4、A5不同世代對(duì)煙堿降解率的差異極顯著，而融合子A2不同世代對(duì)煙堿降解率的差異不顯著，即其煙堿降解率的穩(wěn)定性好。從表1可以看出，第1代融合子A1、A3、A5的煙堿降解率分別為94%、93.8%和95.7%，均高于第1代融合子A2的92.1%煙堿降解率。但是除了融合子A1第4代的93.2%菌株煙堿降解率略高于相應(yīng)代數(shù)融合子A2的91.8%煙堿降解率外，融合子A1、A3、A5后續(xù)傳代的菌株煙堿降解率均低于融合子A2相應(yīng)代數(shù)的菌株煙堿降解率。從表2可以看出，融合子A2連續(xù)傳10代的煙堿降解率較為穩(wěn)定。融合子A4的第1代菌株煙堿降解率僅為90%，傳至第10代時(shí)已降至77.2%，故也不適合作為理想降煙堿的融合子。綜上，選擇A2作為理想的降煙堿融合子進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表1 融合子煙堿降解率（%）遺傳穩(wěn)定性分析結(jié)果

表2 融合子煙堿降解率遺傳穩(wěn)定性的方差分析

圖4 融合子A2與親株降煙堿能力的對(duì)比

2.7 融合子A2與親株降煙堿能力的對(duì)比

將融合子A2與解淀粉芽孢桿菌T11、邊緣假單胞菌進(jìn)行降煙堿能力檢測(cè)，通過(guò)7 d連續(xù)降解來(lái)對(duì)比其降煙堿的效果。每個(gè)菌株設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)，每天分別測(cè)定不同菌株的降煙堿效率，取其均值作圖（圖4）。從圖4可以看出，融合子A2在1～7 d之間的煙堿降解率均高于相應(yīng)降解天數(shù)的解淀粉芽孢桿菌T11、邊緣假單胞菌的煙堿降解率。第5天融合子A2、解淀粉芽孢桿菌T11及邊緣假單胞菌的煙堿降解率分別為92.9%、74.27% 和73.73%，第6天、第7天各菌株煙堿降解率與第5天的煙堿降解率基本持平，融合子A2的煙堿降率基本維持在93%左右。這說(shuō)明融合子A2的降解率雖然最高，但未能完全降解煙堿培養(yǎng)基中的煙堿，這可能是因?yàn)槟撤N中間代謝產(chǎn)物達(dá)到了一定的濃度后會(huì)抑制融合子A2降煙堿關(guān)鍵酶的酶活性。經(jīng)方差分析，第1～5天3種菌株煙堿降解率隨時(shí)間變化的差異極顯著，融合子A2煙堿降解率比解淀粉芽孢桿菌T11和邊緣假單胞菌強(qiáng)。而相同條件下重復(fù)融合子A2、解淀粉芽孢桿菌T11和邊緣假單胞菌降煙堿能力測(cè)定試驗(yàn)3次，它們最終的煙堿降解率差異不顯著，這說(shuō)明融合子A2煙堿降解能力比親株強(qiáng)是具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，利用40%PEG-6000誘導(dǎo)單親滅活的邊緣假單胞桿菌和解淀粉芽孢桿菌T11原生質(zhì)體進(jìn)行融合是可行的，經(jīng)穩(wěn)定性遺傳分析得到1株穩(wěn)定降解煙堿的融合子A2，其在第5 天后的煙堿降解率達(dá)到92.9%，降煙堿能力比親株高10%，為進(jìn)一步研究提高微生物降煙堿能力提供基礎(chǔ)方法，為構(gòu)建應(yīng)用于大田降解煙葉中含量偏高的煙堿提供技術(shù)基礎(chǔ)。此外，還可應(yīng)用此高效降煙堿融合子降解煙草廢棄物中的煙堿，以降低煙堿對(duì)環(huán)境的污染，應(yīng)用價(jià)值較大。

國(guó)內(nèi)外已分離得到多種能夠降解煙堿的微生物。張娟等［14］分離得到的摩氏摩根氏菌（細(xì)菌）發(fā)酵14 d后才降解了相同濃度下87.51%的煙堿，降解效率明顯比本研究得到的融合菌株低。丁懷宇等［18］使用除蟲(chóng)鏈霉菌（放線菌）處理白肋煙煙片，煙堿降解率為74.77%，該放線菌是從煙片上分離得到的，具有更能適應(yīng)存活于煙葉上的遺傳特性，本試驗(yàn)獲取的融合子A2融合了存活于煙草中兩種細(xì)菌的遺傳特性，因此具有較大優(yōu)勢(shì)，有望將其直接降解大田煙葉中含量過(guò)高的煙堿。Raman等［19］分離得到了1株降煙堿變形假單胞菌TND35，并對(duì)其發(fā)酵代謝物進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)了新的煙堿降解途徑。本研究的融合子A2遺傳了親株的部分遺傳特性，但其降解煙堿的具體中間代謝物還需進(jìn)一步的研究。

目前，國(guó)內(nèi)采用原生質(zhì)體融合等傳統(tǒng)成熟的生物技術(shù)手段進(jìn)一步提高降煙堿能力的研究鮮有報(bào)道。因此，利用生物技術(shù)獲取高效降解煙堿新資源的研究有待深入研究，以加快其運(yùn)用到煙草大田中去解決煙葉煙堿含量過(guò)高的問(wèn)題。對(duì)于未來(lái)應(yīng)用融合子去降解煙葉中的煙堿，需要評(píng)價(jià)其是否會(huì)對(duì)煙葉品質(zhì)造成影響，因此對(duì)融合子A2的煙堿降解途徑也有待進(jìn)一步研究探討。

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（責(zé)任編輯 崔建勛）

Protoplast fusion between nicotine-degrading Bacillus amyloliquefaciens and Pseudomonas marginalis to breed efficient nornicotine strain

DENG Gao-yi1，PENG Yu2，WANG Yuan-liang1
（1.College of Food Science and Technology，Hunan Agricultural University/Hunan Provincial Key Laboratory of Food Science and Biotechnology，Changsha 410128，China；2.Technology Center of China Tobacco Hunan Industrial Co.Ltd.，Changsha 410014，China）

In order to acquire fusant with high nicotine-degrading ability，Bacillus amyloliquefaciens T11 and Pseudomonas marginalis were used for parent strains.After using lysozyme to break the cell walls of parent strains，the Bacillus amyloliquefaciens T11 protoplast and heat-inactivated Pseudomonas marginalis protoplast were induced by 40% PEG-6000 for protoplast fusion experiment，then the nicotine-degrading ability of fusant was measured.Through preliminary screening，176 fusion strains were obtained.After rescreening by nicotine selective culture medium，5 fusion strains with higher nicotine-degrading ability were acquired.Genetic stability analysis of the 5 fusion strains and comparision with parent strains’ nicotine-degrading rate were further measured.A better fusant A2 with higher nicotinededrading ability than parent strains was obtained finally，93% nicotine in culture medium was degraded in five days.

Bacillus amyloliquefaciens T11；Pseudomonas marginalis；protoplast；fusant；nicotine

S182

A

1004-874X（2016）06-0143-06

10.16768/j.issn.1004-874X.2016.06.025

2015-11-18

湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司（KY2012Y C0001）

鄧高毅（1989-），男，在讀碩士生，E-mail∶610715556@qq.com

王遠(yuǎn)亮（1976-），男，博士，教授，E-mail∶408083310@qq.com