包艷存， 李書華， 李 霞，李 芳

(山東省濰坊市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物所，山東濰坊 261041)

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蘆筍“冠軍”花藥培養(yǎng)愈傷組織的誘導(dǎo)

包艷存， 李書華， 李 霞，李 芳

(山東省濰坊市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物所，山東濰坊 261041)

摘要[目的]研究蘆筍“冠軍”花藥培養(yǎng)技術(shù)。[方法]以雜交一代品種“冠軍”為試驗材料，研究花藥組培過程中影響愈傷組織誘導(dǎo)的因素及生長調(diào)節(jié)劑對愈傷分化成苗的影響。[結(jié)果]采用0.1%升汞滅菌5 min，再接種在添加NAA 0.8 mg/L+6-BA 2.0 mg/L的 MS固體培養(yǎng)基上先暗培養(yǎng)10 d，再光照培養(yǎng)，花藥愈傷組織誘導(dǎo)率較高,達(dá)16.5%左右。[結(jié)論]建立了蘆筍“冠軍”花藥培養(yǎng)技術(shù)體系，為開展蘆筍全雄育種奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞蘆筍“冠軍”；花藥培養(yǎng)；愈傷誘導(dǎo)

蘆筍學(xué)名石刁柏(Asparagus officinalisL.)，具有豐富的營養(yǎng)價值和藥用價值，被列為世界“十大名菜”之一，在國際市場上享有“蔬菜之王”的美稱[1]。蘆筍雌雄異株，常規(guī)品種中雌雄株比例為1∶1。而雄株與雌株相比，具有高產(chǎn)、抗病的優(yōu)點(一般雄株的產(chǎn)量比雌株高 20%～30%)，因此，培育全雄系品種成為目前國內(nèi)外蘆筍育種的主要研究方向[2-3]。

獲得超雄株(MM)是蘆筍全雄育種工作的前提和關(guān)鍵。目前，超雄株的獲得主要有兩性株自交選擇和花藥培養(yǎng)2個途徑。研究利用蘆筍兩性株培育超雄株純系，需要連續(xù)自交 6 代以上，耗時耗力。而采用雄株花藥培養(yǎng)，能得到來源于花粉的單倍體植株，經(jīng)染色體加倍后可以得到純合的純雄系，一代即可純合，大大節(jié)約了選育時間[4-5]。Pelltier等[6]從蘆筍花粉離體培養(yǎng)的愈傷組織中觀察到 n=10 的單倍體細(xì)胞。Dore[7-8]通過蘆筍花藥培養(yǎng)，首次得到超雄株，并用于蘆筍育種。研究表明，蘆筍花藥培養(yǎng)存在誘導(dǎo)率低、芽分化率低等問題，筆者選用雜交一代品種“冠軍”為試材，研究花藥組培過程中影響愈傷組織誘導(dǎo)的因素及生長調(diào)節(jié)劑對愈傷分化成苗的影響，旨在為開展蘆筍全雄育種奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料及處理供試材料為山東濰坊市農(nóng)業(yè)科學(xué)院種質(zhì)資源圃中的“冠軍”一代雜交種雄株花序。選取標(biāo)準(zhǔn)： 5月上中旬8:00～10:00采摘定植第二年的健康“冠軍”單株花蕾作為試驗材料，且花蕾采用1～2mm大小[9-14]。將花蕾先在4 ℃冰箱進(jìn)行低溫預(yù)處理4d[15-17]。

1.2試驗方法

1.2.1不同滅菌方式。在超凈工作臺上將花蕾先用 75%乙醇溶液浸泡 10～25s后，用無菌水沖洗3遍，再加入 0.1%的升汞溶液浸泡3～10min，用無菌水沖洗6次，最后在超凈工作臺上剝?nèi)』ㄋ幗臃N于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。接種密度為每 200mL玻璃瓶接種 40個花藥，每個處理接種至少5瓶。培養(yǎng)溫度為 (26±1)℃，光照強度2 000lx，光照時間14h/d。培養(yǎng)基均附加5g/L瓊脂，蔗糖40g/L，pH調(diào)至 5.8。

1.2.2不同培養(yǎng)基形態(tài)。采用固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)2種培養(yǎng)基，兩者唯一的區(qū)別是液體培養(yǎng)基中不添加凝固劑。

1.2.3不同基本培養(yǎng)基類型。采用MS、1/2MS、1/4MS3種基本培養(yǎng)基。

1.2.4不同生長調(diào)節(jié)劑濃度配比。以MS為基本培養(yǎng)基，通過對 6-BA、NAA這2種生長調(diào)節(jié)劑不同濃度的相互配比，共設(shè)置8個組合。

1.2.5不同培養(yǎng)條件。接種后分別置于光照培養(yǎng)、暗培養(yǎng)10d再光照培養(yǎng)、全暗條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.6花藥愈傷組織的增殖和分化 。取 0.2～0.3cm大小的愈傷組織，將其接種至含有6-BA、NAA不同濃度組合的分化培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖分化培養(yǎng)。其中，6-BA設(shè)置 1.0、0.8、0.5mg/L3個濃度，NAA則采用 0.20、0.10、0.05mg/L3個濃度，對其進(jìn)行單獨和交叉組合的形式進(jìn)行試驗，調(diào)查愈傷組織的增殖分化情況。

2結(jié)果與分析

蘆筍花藥接種在培養(yǎng)基上，整個花藥壁逐漸變成黃褐色，培養(yǎng)20d左右開始出現(xiàn)愈傷組織。愈傷組織出現(xiàn)的時間和形態(tài)特征表現(xiàn)不同。有的愈傷組織結(jié)構(gòu)致密，有的愈傷組織結(jié)構(gòu)疏松(圖1)；顏色也表現(xiàn)不同，有的呈白色，有的呈黃白色，還有的呈淡綠色。

2.1不同滅菌方式對外植體的影響由表1可知，用75%乙醇滅菌，處理時間的長短對材料污染、死亡影響不明顯，但污染數(shù)略有下降，死亡數(shù)有所增加，其中以用75%乙醇處理10s的效果較好，誘導(dǎo)率高。而用0.1%升汞滅菌，隨著消毒時間的延長，初代培養(yǎng)物的污染率下降，消毒5min時，污染數(shù)較低。但死亡數(shù)隨消毒時間的延長而上升，當(dāng)消毒時間為10min時死亡率明顯上升，可能是花藥受到汞離子的毒害而死亡。

注：A.質(zhì)地堅硬致密的愈傷組織，B.質(zhì)地疏松的愈傷組織。Note:A.Callus with hard and tight texture,B.Callus with loose texture.圖1　愈傷組織形態(tài)Fig.1　Callus morphology

綜合考慮，蘆筍花藥滅菌的適宜方法應(yīng)選擇以75%乙醇浸10s后，用無菌水沖洗3遍，再用0.1%升汞浸泡5min后，無菌水沖洗6遍為宜。

2.2不同培養(yǎng)基形態(tài)對愈傷組織誘導(dǎo)的影響由表2可知，固體培養(yǎng)基愈傷組織的形成時間比液體培養(yǎng)基早4d，且其愈傷誘導(dǎo)率達(dá) 16.16%，是液體培養(yǎng)基誘導(dǎo)率的 2 倍多，兩者間差異極顯著。同時，固體培養(yǎng)產(chǎn)生的愈傷組織致密(后期發(fā)現(xiàn)，致密的愈傷增殖分化率優(yōu)于疏松的愈傷組織)。由此可知，固體培養(yǎng)比液體培養(yǎng)更適合蘆筍花藥愈傷組織的誘導(dǎo)。

表1　不同消毒時間組合的愈傷誘導(dǎo)率

表2　不同培養(yǎng)基類型對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

注：同列不同小寫字母表示培養(yǎng)基類型間差異顯著(P<0.05),不同大寫字母表示培養(yǎng)基類型間差異極顯著(P<0.01)。

Note:Differentlowercasesandcapitallettersinthesamecolumnstandforsignificantdifference(P<0.05)andextremelysignificantdifference(P<0.01)amongculturemediumtypes.

2.3不同培養(yǎng)條件對愈傷組織誘導(dǎo)的影響 由表3可知，培養(yǎng)條件不僅影響蘆筍花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率，也影響花藥愈傷組織的啟動時間及顏色與質(zhì)地等。暗培養(yǎng)10d后再轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)，誘導(dǎo)率最高，達(dá)16.9%。而一直處于暗培養(yǎng)條件下的誘導(dǎo)率達(dá)15.8%，顯著高于光培養(yǎng)下的誘導(dǎo)率6.5%。同時，暗培養(yǎng)的愈傷啟動誘導(dǎo)時間較光培養(yǎng)條件早 9d，表明暗光培養(yǎng)有利于愈傷組織的誘導(dǎo)。

同時也發(fā)現(xiàn)，一直處于暗培養(yǎng)條件下所形成的愈傷組織結(jié)構(gòu)疏松，在后期分化培養(yǎng)過程中，分化率低，且易出現(xiàn)玻璃化和黃化死亡現(xiàn)象。因此，適當(dāng)?shù)墓庹沼欣谛纬少|(zhì)地致密的愈傷組織。由此可知，先進(jìn)行10d左右的暗啟動培養(yǎng)，再進(jìn)行14h/d、2 000lx強度的光照培養(yǎng)，有利于花藥愈傷組織的誘導(dǎo)。

2.4不同基本培養(yǎng)基對愈傷組織誘導(dǎo)的影響以MS為基本培養(yǎng)基，花藥愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達(dá) 18.5%，極顯著高于1/2MS和 1/4MS培養(yǎng)基。其愈傷組織開始形成時間由早到晚依次為MS、1/2MS、1/4MS。以MS為基本培養(yǎng)基，愈傷組織質(zhì)地致密，多呈黃綠色，褐化少；以1/4MS和 1/2MS為基本培養(yǎng)基，愈傷組織質(zhì)地多疏松，部分褐化。由此可知，MS基本培養(yǎng)適宜蘆筍花藥愈傷組織的誘導(dǎo)。

表3不同培養(yǎng)條件對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

Table3Theimpactofdifferentcultureconditionsoncallusinduction

培養(yǎng)條件Mediumconditions愈傷組織形成時間Callusformationtime∥d愈傷組織誘導(dǎo)率Callusinductionrate∥%愈傷形態(tài)Callusform暗培養(yǎng)Darkculture2515.8愈傷疏松,多乳白色暗10d+光Dark10d+light2716.9愈傷致密,黃色光培養(yǎng)Lightculture346.5愈傷致密,淡綠色

表4不同基本培養(yǎng)基對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

Table4Theimpactofdifferentbasicmediumsoncallusinduction

培養(yǎng)基類型Mediumconditions愈傷組織形成時間Callusformationtime∥d愈傷組織誘導(dǎo)率Callusinductionrate∥%愈傷形態(tài)CallusformMS2418.5aA愈傷質(zhì)地致密,黃綠色1/2MS289.5bB愈傷稍顯疏松,淡黃綠色1/4MS315.5cC質(zhì)地疏松,淡黃色或乳白色

注：同列不同小寫字母表示不同培養(yǎng)基類型間差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示不同培養(yǎng)基類型間差異極顯著(P<0.01)。

Note:Differentlowercasesinthesamecolumnstandforsignificantdifferenceamongvariousculturemediums,differentcapitallettersstandforextremelysignificanceamongvariousculturemediums.

2.5不同生長調(diào)節(jié)劑濃度配比對愈傷組織誘導(dǎo)的影響由表5可知，在處理⑦即NAA0.8mg/L+6-BA2.0mg/L的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，花藥愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達(dá) 16.86%，且其愈傷質(zhì)量良好，呈致密的黃綠色。另外，2個因素的不同水平之間差異顯著，而6-BA是影響花藥愈傷組織形成的主要因子。當(dāng)6-BA濃度在1.0～2.0mg/L時，誘導(dǎo)率隨6-BA濃度的增加而增加。而在6-BA濃度相同的情況下，NAA濃度為0.8mg/L時形成的愈傷組織比NAA濃度為0.5mg/L的結(jié)構(gòu)更致密。

表5不同生長調(diào)節(jié)劑濃度配比對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

Table5Theimpactofdifferentgrowthregulatorcombinationsoncallusinduction

處理Treatment6-BAmg/LNAAmg/L愈傷組織誘導(dǎo)率Callusindu-ctionrate∥%①1.00.57.53②1.00.87.86③1.50.59.33④1.50.89.8⑤1.51.08.73⑥2.00.515.32⑦2.00.816.86⑧2.01.012.33

2.6愈傷組織的增殖分化 結(jié)果表明，MS+0.5mg/L6-BA+0.2mg/LNAA是適合花藥愈傷組織繼代分化的培養(yǎng)基。將上述疏松和致密的2種愈傷組織均接種至分化培養(yǎng)基上，在溫度(26±1)℃、光照強度2 000lx、光照時間16h/d下培養(yǎng)，疏松型愈傷組織玻璃化程度高且分化率低，致密型愈傷組織分化率高，分化苗正常(圖2)。

注：A.松散型；B.致密型。Note: A. Loose type; B.Compactness. 圖2　繼代增殖情況Fig.2　The subculture proliferation situation

3結(jié)論與討論

該試驗以優(yōu)良的雜交一代品種“冠軍”雄株花序為試材，對室內(nèi)花藥誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)條件進(jìn)行試驗，研究了滅菌方式、培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)條件和生長調(diào)節(jié)劑配比對愈傷組織誘導(dǎo)的影響。結(jié)果表明，采用0.1%升汞滅菌5min，再接種至添加NAA0.8mg/L+6-BA2.0mg/L的MS固體培養(yǎng)基上先暗培養(yǎng)10d，再光照培養(yǎng)，花藥愈傷誘導(dǎo)率較高，達(dá)16.5%左右。

根據(jù)前人經(jīng)驗，選用為5月上中旬8:00～10:00采摘定植第二年的健康“冠軍”單株花蕾作為試驗材料，且花蕾統(tǒng)一采用1～2mm大小。先將花蕾在4 ℃冰箱中低溫預(yù)處理4d，可提高愈傷誘導(dǎo)成功率。試驗過程中發(fā)現(xiàn)，形成的愈傷組織有疏松和致密2種類型。在分化培養(yǎng)過程中，松散型愈傷組織易出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，且分化率低。致密型愈傷組織分化率高，分化苗正常。后期對蘆筍花藥愈傷組織分化的綠芽進(jìn)行了莖尖細(xì)胞染色體數(shù)目檢測，發(fā)現(xiàn)其染色體數(shù)目呈多樣性，變化范圍大，有單倍體、二倍體、四倍體和非整倍體等，其中分化的二倍體占絕大多數(shù)?；ㄋ幣囵B(yǎng)中二倍體植株的出現(xiàn)可能是來源于體細(xì)胞愈傷組織的干擾，也可能是花藥培養(yǎng)中花粉植株染色體的自然加倍形成的[18-19]。因此，后期還應(yīng)培育再生植株并對再生植株進(jìn)行倍性和雌雄性別鑒定，明確來源于雄核發(fā)育的雄性單倍體植株，以便應(yīng)用于蘆筍的全雄育種。

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作者簡介包艷存(1979- )，女，湖北隨州人，農(nóng)藝師，從事蘆筍育種與栽培研究。

收稿日期2016-04-23

中圖分類號S 603.6

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611(2016)16-157-03

TheCallusInductionofAsparagus“Champion”AntherCulture

BAOYan-cun,LIShu-hua,LIXiaetal

(InstituteofBiology,WeifangAcademyofAgriculturalSciences,Weifang,Shandong261041)

Abstract[Objective] The aim was to study asparagus “champion” anther culture technique. [Method] Using the F1 hybrid asparagus variety “champion” as the test material, callus induction in tissue culture process and effects of growth regulator on callus differentiation were studied. [Result] The results showed that using 0.1% mercuric chloride sterilization 5 min, inoculated on the MS solid medium by adding NAA0.8 mg/L + 6-BA 2.0 mg/L of darkness first 10 days, and then light culture, anther callus induction rate reached about 16.5%. [Conclusion] The asparagus “champion” anther culture technical system is established, which will lay a foundation for carrying out asparagus all male breeding.

Key wordsAsparagus officinalis“Champion”; Anther culture; Callus induction