唐宏宇 郭承 董路玨 周馳 霍少川 陳建發(fā) 劉勇 王海彬

廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院骨科中心，廣州 510405 廣州中醫(yī)藥大學國家重點骨科實驗室，廣州 510405

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis, PMOP)屬于原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥之一，是絕經(jīng)后婦女由于卵巢功能衰退，雌激素水平下降等原因?qū)е碌囊环N全身代謝性疾病，患者主要是圍絕經(jīng)期到70歲的婦女[1]，其給中老年婦女帶來的肉體和精神上的痛苦，以及家庭和社會的沉重負擔隨著人口老齡化日趨嚴重。近幾十年來從遺傳因素，生活方式和營養(yǎng)狀況，激素水平以及細胞分子水平對骨質(zhì)疏松發(fā)病機制進行了大量的研究[2]，但確切機制仍未統(tǒng)一。

組蛋白修飾是表觀遺傳學機制之一，組蛋白甲基化是組蛋白修飾的一種方式，主要發(fā)生在組蛋白H3或H4的賴氨酸(lysine, K)和精氨酸(arginine, R)殘基上，又以H3的賴氨酸甲基化最常見。組蛋白修飾與基因的失活、X染色體失活、基因印記等基因沉默現(xiàn)象以及DNA修復有關(guān)[3]。由于存在去甲基化酶，甲基化修飾也是一種可逆的過程。隨著對表觀遺傳學認識的不斷深入，近年來表觀遺傳學在腫瘤性疾病、心血管疾病以及免疫性疾病的預防、診斷和治療中得到了廣泛研究。關(guān)于表觀遺傳如何實現(xiàn)對骨質(zhì)疏松的調(diào)控，目前國內(nèi)外研究不多，但已有從成骨分化著手的相關(guān)細胞和動物實驗研究報道。本研究期望通過比較絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者與非骨質(zhì)疏松骨骼標本，探討絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者組蛋白去甲基化酶JMJD家族(JMJD2A、JMJD2B)、組蛋白甲基化(H3K9me3、H3K36me3)表達水平的差異，以期從表觀遺傳機制找到骨質(zhì)疏松癥新的調(diào)控靶點，為下一步從表觀遺傳機制干預骨質(zhì)疏松提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選擇2014年10月至2014年12月廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院骨科因髖關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎住院行髖關(guān)節(jié)置換的絕經(jīng)后女性病人，年齡為50-70歲。清晨空腹采取靜脈血行血常規(guī)、生化、肝腎功能等檢查，檢測血清25-(OH)VitD水平，雙能X線骨密度儀檢測正位腰椎(L2-4)骨密度。根據(jù)受試者骨密度測量結(jié)果及納入、排除標準，分為骨質(zhì)疏松組(實驗組)和正常組(對照組)。所有入組人員均簽署知情同意書，本研究所取標本為手術(shù)截下之股骨頭，不牽涉?zhèn)惱韱栴}。

1.1.1納入標準：實驗組納入標準：①年齡50～70歲②女性自然絕經(jīng)(停經(jīng)1年以上)③符合原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥診斷標準及中國人骨質(zhì)疏松癥建議診斷標準[4,5]④BMD≤-2.0 SD。

對照組納入標準：①年齡50～70歲②女性自然絕經(jīng)(停經(jīng)1年以上)③不符合骨質(zhì)疏松癥的診斷。

1.1.2共同排除標準：①年齡小于50歲或大于70歲②患精神病或老年癡呆者③合并心腦血管等系統(tǒng)嚴重原發(fā)性疾病者④肝腎功能不全患者者⑤有導致繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥相關(guān)疾病病史，如甲狀旁腺功能亢進、類風濕性關(guān)節(jié)炎等⑥糖皮質(zhì)類激素應(yīng)用史⑦患者半年內(nèi)服用可能影響骨代謝的藥物者。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1主要試劑 H3K9me3、H3K36me3一抗購自英國Abcam公司，JMJD2A、JMJD2B一抗購自美國CST公司，免疫組化聚合物檢測系統(tǒng)試劑盒(包括通用二抗、H2O2工作液、蛋白阻斷劑、DAB顯色劑、DAB顯色增強劑、蘇木素染色劑)購自德國Leica公司，Simple Western 試劑套裝(內(nèi)含分離膠母液、濃縮膠母、抗體稀釋液、抗兔和抗鼠的二抗過氧化物酶結(jié)合試劑、1M DTT、熒光標準品和生物素標記的Ladder、Matrix Removal buffer、Wash buffer、Running Buffer)購自ProteinSimple公司，RIPA裂解液、PMSF、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天公司。

1.2.2主要儀器：雙能X射線骨密度儀(法國MEDILINK公司)，自動脫水機、石蠟包埋機、石蠟切片機購自德國Leica公司，Simon全自動蛋白質(zhì)表達分析系統(tǒng)購自美國ProteinSimple公司。

1.3 骨密度測定方法

依據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO) 2004年發(fā)布的骨質(zhì)疏松癥的診斷標準制定的《中國人骨質(zhì)疏松癥診斷標準專家共識(第三稿·2014版)》[5]，采用法國MEDILINK公司雙能X射線骨密度儀檢測患者腰椎(L2-L4)正位骨密度，骨密度≤-2.0 SD為骨質(zhì)疏松，骨密度>-1.0s為正常。

1.4 指標檢測方法

1.4.1免疫組織化學檢測松質(zhì)骨標本JMJD2A、JMJD2B、H3K9me3、H3K36me3表達。

標本收集及處理：髖關(guān)節(jié)置換術(shù)中，無菌骨刀鑿取股骨頭內(nèi)松質(zhì)骨顆粒，大小約1×1×0.5 cm，立即放入10%甲醛溶液，常溫下固定24 h。再置于PLANK脫鈣液脫鈣2-3 d，期間換脫鈣液1次，隔段時間用注射器針頭針刺骨標本以檢查脫鈣效果，至針頭能輕松扎入骨組織而沒有明顯阻力即脫鈣完成。脫鈣完成后自來水流水沖洗12 h。系列酒精脫水、TO透明劑透明、浸蠟，石蠟包埋。Leica病理切片機切成厚度4 μm的蠟片，將蠟片展于標記的防脫載玻片上，60℃烤箱烤片2 h使標本貼片牢固。

實驗步驟：經(jīng)脫蠟，抗原修復，封閉，一抗、二抗孵育，DAB顯色，蘇木素復染，脫水，封片，顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

結(jié)果判定：通過顯微鏡觀察顯示JMJD2A、JMJD2B、H3K9me3、H3K36me3均定位于細胞核，顯微鏡下每張切片隨機觀察5個200倍視野，觀察核染色程度(0、1、2、3分分別為陰性著色、淡黃色、棕黃色、棕褐色)和陽性范圍評分(1、2、3、4分分別為0-10%、11-50%、51-80%、>80%)，兩分數(shù)相乘:0分為陰性，1-4分為弱陽性，>4分為強陽性，本實驗采取分值高低比較陽性率水平。

圖1 實驗組和對照組基本情況差異比較直方圖與對照組比較,**P<0.05.Fig.1 Comparison of basic information between the 2 groups (n=10,

1.4.2免疫印跡法檢測松質(zhì)骨標本JMJD2A、JMJD2B、H3K9me3、H3K36me3表達。

標本收集及處理：上髖關(guān)節(jié)置換術(shù)中，無菌骨刀鑿取股骨頭內(nèi)松質(zhì)骨顆粒，立即裝入1.5 ml無菌凍存管，放入液氮中，轉(zhuǎn)運至-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用碧云天全蛋白提取試劑盒提取骨組織總蛋白樣品，BCA法測定蛋白濃度，分裝置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

實驗步驟：蛋白檢測使用美國Simon全自動蛋白質(zhì)表達分析系統(tǒng)，按照Simple Western試劑套裝操作指南，將一抗及內(nèi)標β-Action按照1∶50稀釋，蛋白樣品濃度按照1.5 mg/ml稀釋，小心將各樣品依次加入微孔板，避免產(chǎn)生氣泡，上樣完成后，按照軟件操作指南上機點擊運行，機器自動完成樣品跑膠、抗體孵育及染色成像。約5 h后，機器運行結(jié)束，生成結(jié)果。結(jié)果判定根據(jù)Graph view下面的Peaks表格中目的蛋白“峰面積”數(shù)值來計算蛋白表達量。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較

10例骨質(zhì)疏松癥患者(實驗組)和10例非骨質(zhì)疏松癥患者 (對照組)比較,平均年齡、身高、體重、BMI之間無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，實驗組BMD、外周血血清25-(OH)VitD低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)?；举Y料見表1，直方圖見圖1。

組別Group實驗組Experimental group對照組Control groupt值t-valueP值P-value例數(shù)Case(number)1010--年齡(歲)Age(year)59.40±5.8360.70±4.73-0.5470.591身高(cm)High(cm)157.4±5.68155.0±4.131.080.294體重(kg)Weight(kg)59.80±1.5457.80±5.201.1650.259體重指數(shù)(kg/m2)BMI(kg/m2)24.19±1.3823.76±2.550.3020.76625-羥基維生素D25-(OH)VitD(ng/mL)18.51±4.2325.56±3.21-5.150.000骨密度(g/cm2)BMD(g/cm2)-3.6±0.63-0.62±1.35-6.0310.000

注：經(jīng)t檢驗，兩組患者年齡、身高、體重、BMI差異無統(tǒng)計學意義(P>0.005)， BMD、25-(OH)VitD差異有統(tǒng)計學意義(P<0.005)。
Through Student’s test，there was no significant difference between the two group，when comparing their age,hight,weight,BMI(P>0.005), When cames to BMD, 25-(OH)VitD,there was significant difference(P<0.005).

2.2 實驗組和對照組JMJD2A、JMJD2B、H3K9me3、H3K36me3表達水平差異。

兩組JMJD2A表達均為弱陽性(低表達)，組間差別具有統(tǒng)計意義(P<0.05)；實驗組JMJD2B表達水平低于對照組，組間差異具有統(tǒng)計意義(P<0.05)；實驗組H3K9me3、H3K36me3表達水平高于對照組，組間差異具有統(tǒng)計意義(P<0.05)(免疫組化結(jié)果見圖2、統(tǒng)計結(jié)果見表2、圖3；WB結(jié)果見圖4，統(tǒng)計結(jié)果見表3、圖5)。

圖2 免疫組化檢測實驗組和對照組JMJD2A、JMJD2B、H3K9me3、H3K36me3表達，表達部位均位于細胞核，陽性表達為核黃染。(400×視野)Fig.2 Comparison of expression of immunohistochemical staining of JMJD2A, JMJD2B, H3K9me3, and H3K36me3 between the 2 groups.The nucleus positive expression was in yellow.(400×).

指標Index實驗組Experimental group對照組Control groupt值t-valueP值P-valueJMJD2A2.00±1.153.5±0.67-3.5460.002JMJD2B3.2±0.566.06±0.58-11.2820.000H3K9me38.76±0.665.59±1.277.010.000H3K36me37.64±0.834.82±0.877.4030.000

注：經(jīng)t檢驗，兩組患者JMJD2A、JMJD2B、H3K9me3、H3K36me3差異有統(tǒng)計學意義(P<0.005)
Through Student’s test，there was significant difference between the two group，when comparing their JMJD2A、JMJD2B、H3K9me3、H3K36me3(P<0.005)

圖3 實驗組和對照組免疫組化結(jié)果差異比較直方圖與對照組比較,**P<0.05.Fig.3 Comparison of immunohistochemical staining between the 2 groups (n=10,

圖4 WB檢測實驗組和對照組JMJD2A、JMJD2B(上)和H3K9me3、H3K36me3(下)表達Fig.4 Comparison of the expression of JMJD2A and JMJD2B WB (upper) and H3K9me3 and H3K36me3 (below) between the 2 groups (n=10,

指標Index實驗組Experimental group對照組Control groupt值t-valueP值P-valueJMJD2A286.5±41.98363.8±29.52-4.7630.000JMJD2B365.5±32.99643.8±140.43-6.1010.000H3K9me31150.6±205.90634.7±194.545.7590.000H3K36me31037.6±158.57595.1±175.645.9140.000

注：經(jīng)t檢驗，兩組患者JMJD2A、JMJD2B、H3K9me3、H3K36me3差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.005)
Through Student’s test，there was significant difference between the two group，when comparing their JMJD2A、JMJD2B、H3K9me3、H3K36me3(P<0.005)

圖5 實驗組和對照組WB結(jié)果差異比較直方圖與對照組比較,**P<0.05Fig.5 Comparison of WB results between the 2 groups

3 討論

絕經(jīng)后婦女伴隨卵巢功能衰退、雌激素缺乏，骨質(zhì)疏松癥多發(fā)，在目前全球約2億的骨質(zhì)疏松癥患者中，每年約有150萬發(fā)生骨質(zhì)疏松性骨折，在絕經(jīng)后婦女，與骨質(zhì)疏松性骨折相關(guān)的死亡率已超過乳腺癌、宮體癌和宮頸癌總和[6]。骨質(zhì)疏松癥在威脅患者生命的同時，給家庭、整個社會帶來巨大的經(jīng)濟負擔。隨著人均壽命的延長和人口結(jié)構(gòu)的改變，預計到2050年，因質(zhì)疏松癥誘發(fā)的骨折將增加1倍，與之相伴的是醫(yī)療費用的驚人的增長速度[7]。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。

表觀遺傳學(epigenetics)是指在沒有發(fā)生基因DNA序列改變的情況下，基因功能發(fā)生的遺傳信息變化，并最終導致可遺傳的表型變化。其主要內(nèi)容包括DNA甲基化、染色質(zhì)重塑、組蛋白修飾以及非編碼RNA調(diào)控。表觀遺傳學以其獨特的研究視角，把遺傳特性和環(huán)境因素結(jié)合起來，認為復雜的基因組生物學系統(tǒng)不僅具有強大的穩(wěn)定性，并且具有精確的反應(yīng)性和強大的適應(yīng)性。組蛋白甲基化是一種組蛋白修飾方式，主要發(fā)生在組蛋白H3或H4的賴氨酸(lysine, K)和精氨酸(arginine, R)殘基上，又以H3的賴氨酸甲基化最常見，如4位(H3K4)、9位(H3K9)、27位(H3K27)、36位(H3K36)、79位(H3K79)等，且這些位置的賴氨酸殘基不僅存在有單甲基化修飾，甚至還有二甲基化和三甲基化修飾[8]。之前認為甲基化是一種穩(wěn)定的修飾，近年來由于去甲基化酶的發(fā)現(xiàn)，說明甲基化修飾也是一種可逆的過程。

目前已發(fā)現(xiàn)兩類組蛋白去甲基化酶：賴氨酸特異性去甲基化酶(lysine specific demeth- ylase, LSD)和含Jumonji家族結(jié)構(gòu)域的組蛋白去甲基化酶(Jumonji domain- containning histone demethylase,JMJD)。它們都可催化組蛋白單或雙甲基化賴氨酸去甲基化，而后者還可催化三甲基化賴氨酸去甲基化[9]。JMJD家族目前已鑒定多個成員，JMJD2A和JMJD2B是其成員之一。研究表明，JMJD2能夠同時移去H3K9me3和H3K36me3上的甲基[10]。

隨著對表觀遺傳學認識的深入，近年來表觀遺傳學在腫瘤性疾病、心血管疾病以及免疫性疾病的預防、診斷和治療中得到了廣泛研究。關(guān)于表觀遺傳如何實現(xiàn)對骨質(zhì)疏松的調(diào)控，目前國內(nèi)外研究不多，但已有從成骨分化著手的相關(guān)細胞和動物實驗研究報道。本研究以人松質(zhì)骨標本為研究對象，期望以組蛋白去甲基化酶JMJD2家族為切入點，找到甲基化與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)性。

本研究結(jié)果顯示，兩組患者JMJD2A表達均為弱陽性，而JMJD2B表達陽性到強陽性不等，骨質(zhì)疏松組JMJD2A、JMJD2B均低于非骨質(zhì)疏松組；與之相應(yīng)的H3K9me3、 H3K36me3表達陽性程度不等，骨質(zhì)疏松組H3K9me3、H3K36me3均高于非骨質(zhì)疏松組。關(guān)于組蛋白去甲基化酶及組蛋白甲基化與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的關(guān)系，本研究初步認為，JMJD2A、JMJD2B可作為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的預測指標，其表達水平和H3K9me3、H3K36me3相反相成，JMJD2A、JMJD2B越低，患者骨密度越低，患骨質(zhì)疏松癥風險越高。其機制可能是JMJD2A、JMJD2B降低導致部分抗骨質(zhì)疏松的相關(guān)基因失活，因第9位賴氨酸的甲基化與基因的失活有關(guān)[11]，而JMJD2A、JMJD2B催化組蛋白H3三甲基化的第9位點賴氨酸去甲基化；同時JMJD2A降低導致了部分促骨質(zhì)疏松的相關(guān)基因激活，因第36位賴氨酸的甲基化與基因的激活相關(guān)[11]，而JMJD2A催化組蛋白H3三甲基化的第36位點賴氨酸去甲基化。關(guān)于JMJD2A、JMJD2B對H3K9me3、H3K36me3的脫甲基作用及其脫甲基催化強度，本課題未能從分子機制深入探討。

總之，本研究證實了絕經(jīng)后女性組蛋白去甲基化酶JMJD2與骨密度的正相關(guān)性，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者JMJD2水平降低，為從表觀遺傳學角度診治骨質(zhì)疏松提供新的思路。然本研究存在一定局限，沒能從分子層面深入探討其具體作用方式，下一步需要在此基礎(chǔ)之上開展更深層次、多方位的研究。