陳海英 張如玉 蔡阿明

1. 莆田學(xué)院醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，福建 莆田 351100 2. 莆田學(xué)院護(hù)理學(xué)院， 福建 莆田 351100 3. 莆田學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院， 福建 莆田 351100

神經(jīng)因素對(duì)骨代謝和生長(zhǎng)的直接性調(diào)節(jié)在臨床觀察和實(shí)驗(yàn)已得到證實(shí)，其中神經(jīng)肽降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene related peptide，CGRP)參與心血管系統(tǒng)的生理、病理過程[1]，CGRP陽(yáng)性神經(jīng)纖維在骨組織內(nèi)主要分布在骨膜的等骨代謝活躍區(qū)[2]，以直接或間接方式作用于相應(yīng)靶細(xì)胞來(lái)完成骨生長(zhǎng)、正常骨代謝調(diào)控過程[3]。糖尿病性骨病的關(guān)鍵在于骨組織的修復(fù)重建，而骨膜是受神經(jīng)支配的覆蓋在所有骨骼表面的成骨器官，高度血管化并含有骨祖細(xì)胞，是骨膜成骨及骨生成與改建的基礎(chǔ)[4]。外源性CGRP誘導(dǎo)糖尿病大鼠骨膜血管膜的修復(fù)以促進(jìn)骨重建國(guó)內(nèi)外未見報(bào)道。本研究通過建立糖尿病大鼠模型，觀察外源性CGRP 對(duì)糖尿病大鼠骨膜微血管結(jié)構(gòu)和骨祖細(xì)胞的影響，從改善微循環(huán)促進(jìn)膜性成骨的角度探討CGRP對(duì)骨質(zhì)疏松的修復(fù)作用。

1 材料和方法

1.1 大鼠糖尿病模型的建立

清潔級(jí)雄性4月齡成年SD大鼠，購(gòu)自福建醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物室(閩實(shí)動(dòng)質(zhì)準(zhǔn)第2002-0006號(hào))。STZ(美國(guó)SANLAN)誘發(fā)糖尿病。OneTouch測(cè)定血糖≥167 mmol/L即為糖尿病。隨機(jī)分為6組，對(duì)照組(CON1，2)；糖尿病組(DM1，2)，CGRP干預(yù)組(CGRP1，2)，每組20只，干預(yù)組在STZ造模前30 min尾靜脈注射CGRP (Peninsula)0.2 ml(100 μg/kg)，每天1次。正常對(duì)照組注射等體積的生理鹽水。分籠、普通塊料飼養(yǎng)，飲自來(lái)水。分別在5w和10 w進(jìn)行觀察。

1.2 病理標(biāo)本取材、切片及HE染色

25%的烏拉坦麻醉后取股骨，4%多聚甲醛固定，脫水脫脂，以10%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣，石蠟包埋(冠狀面)，酸處理，烘干，用多聚賴氨酸包被干燥。切片機(jī)(德國(guó)Leica RM2015)切片(厚度4 μm)。HE染色，光鏡(日本Olympus BX51T-PHD-J11)觀察。進(jìn)行200×和400×的顯微照相，編號(hào)、采集存盤。

骨膜厚度測(cè)定：鏡下置一標(biāo)尺，骨膜厚度應(yīng)垂直于骨長(zhǎng)軸方向進(jìn)行。每一標(biāo)本在不同的3個(gè)視野各測(cè)一次，取平均值。骨祖細(xì)胞數(shù)測(cè)定：鏡下計(jì)算每1 mm骨膜中骨祖細(xì)胞數(shù)量。不同視野各測(cè)一次，取平均值。

1.3 CGRP的放射免疫測(cè)定

外周血處理：麻醉后心臟取血4 ml，EP管(10% 依地酸二鈉30 μl，抑肽酶2 000 U)混勻后離心 (4℃, 4 500 r/min，10 min)，分離血漿，冰箱保存。嚴(yán)格按照試劑盒(普爾偉業(yè))說(shuō)明書步驟操作。200 ul CGRP標(biāo)準(zhǔn)品(20、60、150、300、600及1 200 pg/ml)待測(cè)樣品先后加入CGRP抗血清、免疫分離劑，分離出抗原抗體復(fù)合物，離心，取上清液，測(cè)定復(fù)合物的放射性(B)，計(jì)算各標(biāo)誰(shuí)管的結(jié)合率(B/B0%)，GC-1200型Y放射免疫計(jì)數(shù)器計(jì)算機(jī)自動(dòng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線、并標(biāo)示樣品濃度pg/ml，再換算成每單位CGRP的含量。

1.4 MVD測(cè)定(墨汁灌注組織學(xué)切片法)

各組取5只大鼠，25%的烏拉坦麻醉后暴露腹主動(dòng)脈下段并作動(dòng)脈插管，剪斷腹主靜脈。用肝素、生理鹽水混合液沖洗腹主靜脈至流出清亮液體，用墨汁右旋糖酐50 ml(3∶7)和明膠墨汁65 ml(明膠4 g、墨汁15 ml、蒸餾水50 ml)灌注。分別取出雙側(cè)股骨頭，4%多聚甲醛固定。標(biāo)本常規(guī)脫鈣，石蠟包埋，用滑動(dòng)切片機(jī)切片，片厚160 μm。微血管墨汁厚片3張,每張切片分別選擇生長(zhǎng)板測(cè)量5個(gè)視野，采用體視學(xué)方法,測(cè)量血管占其視野的相對(duì)面積，規(guī)定為血管相對(duì)密度，以評(píng)價(jià)微血管擴(kuò)張、滲漏和內(nèi)皮損傷的程度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 骨膜組織學(xué)觀察

CON1(圖1A)、CON2(圖1B)骨膜為厚薄均勻的致密纖維組織，外層為成熟的纖維組織，內(nèi)層的細(xì)胞形成層含較少的細(xì)胞成分。DM1早期骨膜組織疏松、水腫，纖維層間隙增大，成纖維細(xì)胞增多，細(xì)胞形成層的細(xì)胞數(shù)量增多、細(xì)胞體積增大，細(xì)胞形成層內(nèi)骨祖細(xì)胞呈多層排列(圖1C)。DM2可見骨膜退化，骨膜明顯變薄，纖維層間隙較大，骨膜纖維層膠原及成纖維細(xì)胞均減少，細(xì)胞形成層細(xì)胞較小，無(wú)規(guī)則排列(圖1D)。CGRP1骨膜結(jié)構(gòu)水腫、疏松(圖1E)。CGRP 2表現(xiàn)薄而均勻的成熟的纖維組織(圖1F)。

2.2 組織計(jì)量學(xué)指標(biāo)測(cè)定統(tǒng)計(jì)學(xué)

與正常組相比，DM1的骨祖細(xì)胞數(shù)明顯大于CON(P<0.01)，DM2的骨膜厚度和骨祖細(xì)胞數(shù)明顯低于CON(P<0.01)。與DM相比，CGRP1的骨膜厚度與DM1比較明顯增厚(圖2)。CGRP2骨膜厚度和骨祖細(xì)胞數(shù)均明顯大于DM2組(P<0.01) (圖3)。

圖2 骨膜厚度與正常組比較，*P<0.01，與糖尿病組比較，▲P<0.01Fig.2 The thickness of the periosteum, *P<0.01, compared with CON, ▲P<0.01, compared with DM.

圖3 骨祖細(xì)胞數(shù)與正常組比較，*P<0.01，與糖尿病組比較，▲P<0.01Fig.3 The number of osteogenitor cells, *P<0.01, compared with CON, ▲P<0.01, compared with DM.

2.3 外周血CGRP含量

各組外周血CGRP與CON組含量[(0.308±0.035，0.373±0.022)(pg/ml)]比較，DM1的外周血CGRP含量[(0.304±0.041)pg/ml]沒有明顯變化，DM2的外周血CGRP含量[(0.217±0.051)pg/ml]表達(dá)明顯降低(P<0.01)。CGRP1的外周血CGRP含量[(0.407±0.024)pg/ml]較DM1明顯升高(P<0.01)，CGRP2的外周血CGRP含量較DM2[(0.309±0.031)pg/ml]也升高(P<0.01) (圖4)。

圖4 外周血CGRP含量與正常組比較，*P<0.01，與糖尿病組比較，▲P<0.01Fig.4 Concentration of CGRP in plasma, *P<0.01, compared with CON, ▲P<0.01, compared with DM.

2.4 骨膜微血管形態(tài)變化及結(jié)果分析

CON1(圖5A)、CON2(圖5B)骨膜毛細(xì)血管呈網(wǎng)狀，連續(xù)性好，灌注飽滿，未見墨汁外滲。DM1骨膜血管豐富，交織成密網(wǎng)狀，明顯擴(kuò)張(圖5C)。DM2骨膜血管密度增大，部分血管模糊不清，外滲呈局部或團(tuán)塊狀黑染；另可見局灶性墨汁灌注缺損區(qū)微血管充盈不良(圖5D)。CGRP1血管擴(kuò)張交織成網(wǎng)狀，連續(xù)性較好(圖5E)，CGRP2骨膜毛細(xì)血管呈網(wǎng)狀，有少量外滲(圖5F)。

圖5 A：正常5周組骨膜微血管交織成密網(wǎng)狀，灌注全面，線條清晰，墨汁灌注，160 um切片，標(biāo)尺示20 μm；B：正常10周組骨膜微血管交織成密網(wǎng)狀,灌注全面，線條清晰，墨汁灌注，160 um切片，標(biāo)尺示20 μm；C：糖尿病5周組骨膜微血管密度較大，連續(xù)性較好，墨汁灌注，160 um切片，標(biāo)尺示20 μm；D：糖尿病10周組骨膜微血管密度較大，灌注不全且外滲，墨汁灌注，160 um切片，標(biāo)尺示20 μm；E：Gen High組5周組骨膜微血管交織成密網(wǎng)狀，線條清晰，墨汁灌注，160 um切片，標(biāo)尺示20 μm；F：Gen High組10周組骨膜微血管密度較大，灌注不全且有外滲現(xiàn)象，墨汁灌注，160 um切片，標(biāo)尺示20 μmFig.5 A: Blood vessels were abundant in network, well infused, and in clear shape in normal group at 5 weeks; B: Blood vessels were abundant in network, well infused, and in clear shape in normal group at 10 weeks; C: The microvascular density was enlarged and well connected in diabetic group at 5 weeks. D: The microvascular density was enlarged and not well infused in diabetic group at 10 weeks; E: Blood vessels were abundant in network, well infused, and in clear shape in Gen High group at 5 weeks; F: The microvascular density was enlarged and not well infused with leakage in Gen High group at 10 weeks. Infusion with ink, 160um slice, bar=20 μm.

DM1的微血管單位面積明顯大于CON組(P<0.01)，DM2的微血管單位面積明顯大于CON組(P<0.01)。CGRP1的微血管單位面積均明顯大于DM1組(P<0.01)。CGRP2的微血管單位面積和與DM2比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖6)。

Fig.6 The unit area of microvascular,*P<0.01, compared with CON,▲P<0.01, compared with DM.

3 討論

已有研究證實(shí)Ⅰ型糖尿病存在血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌障礙，并參與一系列的臨床病理過程。糖尿病時(shí)葡萄糖氧化過程，內(nèi)皮細(xì)胞缺少葡萄糖誘導(dǎo)的自動(dòng)調(diào)節(jié)的反應(yīng)功能[5]，使內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)葡萄糖與代謝中產(chǎn)物的持續(xù)性增高，損傷內(nèi)皮細(xì)胞，加上激活非酶促蛋白糖基化等擴(kuò)大內(nèi)皮的損傷[6]，出現(xiàn)微循環(huán)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)病變。而墨汁灌注連續(xù)切片，能清晰地反映組織微血管結(jié)構(gòu)變化及其損傷情況，包括血管空間分布、走行、形態(tài)聯(lián)系和過渡關(guān)系。另外，周圍神經(jīng)釋放的神經(jīng)肽CGRP是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的內(nèi)源性擴(kuò)血管肽，具有很強(qiáng)的血管調(diào)節(jié)活性[7]，能刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)血管生成。對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有減少損傷和保護(hù)作用，CGRP 拮抗或緩解的微血管破裂出血。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示DM1骨膜微血管尚未出現(xiàn)病變，DM2骨膜微血管的內(nèi)皮損傷，微血管滲漏，CGRP1骨膜的微血管未出現(xiàn)病變，而CGRP2骨膜的微血管內(nèi)皮，血管滲漏得到緩解，血管連續(xù)性較好。CGRP可以通過促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放VEGF等血管因子的表達(dá)的循環(huán)調(diào)節(jié)途徑[8]，改善微循環(huán)、增加組織血流灌注量。

DM1機(jī)體的代謝紊亂和糖毒作用，組織缺血缺氧的低氧環(huán)境能誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞將線粒體中Ca2+釋放于基質(zhì),同時(shí)刺激骨祖細(xì)胞分化，進(jìn)一步表明短時(shí)間的低氧刺激，激活骨祖細(xì)胞增殖，這可能是骨膜成骨活性的一個(gè)重要的因素。DM2骨膜血供不足，代謝低下，骨祖細(xì)胞分化停滯，骨膜水腫、變薄。由于高血糖狀態(tài)引起代謝紊亂，導(dǎo)致組織缺血缺氧，CGRP神經(jīng)纖維減少，CGRP隨之釋放減少[9]，又進(jìn)一步加重骨膜血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。另應(yīng)激所引起的機(jī)體CGRP改變可以刺激成骨細(xì)胞自分泌IGF-1，間接地影響成骨細(xì)胞的活性，影響成骨效應(yīng)[10]。CGRP通過骨組織局部血流量的增加來(lái)增強(qiáng)骨代謝，促進(jìn)成骨、抑制破骨等通路在骨組織正常代謝及骨創(chuàng)傷修復(fù)過程中發(fā)揮著重要的作用。CGRP1表現(xiàn)出CGRP升高，骨膜厚度和骨祖細(xì)胞數(shù)增多。說(shuō)明外源性CGRP與內(nèi)源性CGRP的分布水平相一致。CGRP2加大骨膜微循環(huán)血流灌注量，減輕糖尿病骨膜組織的病理?yè)p傷程度，在骨修復(fù)過程中起重要作用[11]。說(shuō)明外源性CGRP也分布于骨膜等成骨活躍的區(qū)域[12-13]，適時(shí)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的活性。以及外源性CGRP早期的表達(dá)水平高于晚期的動(dòng)態(tài)變化，主要在成骨的早期發(fā)揮作用。由此可見外源性CGRP在骨組織修復(fù)中起到了主要的調(diào)節(jié)作用。