黃志榮 朱麗斌 吳海游 陳麗思 呂思敏 許碧蓮 崔燎 鄒麗宜* 吳鐵,,*

1. 廣東醫(yī)學院藥學院， 東莞 5238082 2. 廣東天然藥物研究與開發(fā)重點實驗室， 湛江 5240233 3. 廣東醫(yī)學院廣東潤和生物科技有限公司輔酶Q10聯(lián)合研究中心， 東莞 523808

輔酶Q10(coenzymeQ10, Co Q10)屬于脂溶性醌類化合物，廣泛存在于所有的生物膜中，參與到呼吸鏈電子傳遞、抗氧化、代謝調(diào)節(jié)、細胞分化調(diào)節(jié)等過程中，同時輔酶Q10是一種具有強大的清除自由基作用的抗氧化劑[1]。本課題組之前已經(jīng)[2]在30 mg·kg-1·d-1這一個劑量探究過Co Q10對環(huán)磷酰胺模型的大鼠股骨的顯微結構的改變，對骨量有一定的改善作用。維生素E(vitamin E, VE)是高效的抗氧化劑和自由基清除劑，維生素E與Co Q10都是抗氧化劑，本課題組[3]已經(jīng)證明250mg/kg這一個劑量能有效預防衰老小鼠的骨丟失，因此以VE作為陽性對照藥。這次我們采用不同大劑量的Co Q10，同時以8月齡的小鼠作為研究對象，探究不同大劑量Co Q10對小鼠股骨的顯微結構的影響，并與維生素E(vitamin E, VE)聯(lián)合應用進行對比，為Co Q10抗骨質疏松的進一步研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物

35只SPF級8月齡雌性KM小鼠，由南方醫(yī)學大學實驗動物中心提供，體重(45.51±4.67)g，動物合格證：SCXK(粵)2011-0015。

1.2藥品與試劑

輔酶Q10(藥用原料藥)：由廣東潤和生物科技有限公司提供，少量的大豆卵磷脂(北京索萊寶科技有限公司，批號：714B023)作為表面活性劑，先讓其溶解在黑芝麻油(平輿康博匯鑫油脂有限公司)中，之后將2 500 mg和5 000 mg的輔酶Q10分別添加到50ml卵磷脂黑芝麻油中攪拌溶解即可得；維生素E軟膠囊(廣州白云山星群(藥業(yè))股份有限公司，批號：LE40017)；生理鹽水(東莞市普濟藥業(yè)有限公司，批號：14082501);Micro CT儀(viva CT40; SCANCO Medical AG);Mini Bionix型材料測試系統(tǒng)(MTS; USA)。

1.3實驗動物與分組

8月齡KM小鼠35只，適應性飼養(yǎng)2周后，按體重對等原則隨機分為5組，每組7只。A組為正常對照(CON)組，該組小鼠每天灌胃給予生理鹽水10 ml/(kg·d);B組為維生素E(VE)組，該組小鼠每天灌胃給予VE250 mg/(kg·d)；C組輔酶Q10(Co Q10L)低劑量組，該組小鼠每天灌胃給予Co Q10500 mg/(kg· d)；D組輔酶Q10(Co Q10H)高劑量組，該組小鼠每天灌胃給予Co Q101 000 mg/(kg·d)。E組輔酶Q10(Co Q10L)低劑量聯(lián)合維生素E(VE)組，該組小鼠每天灌胃給予Co Q10500 mg/(kg·d)和VE250 mg/(kg·d)。5組動物均自由飲水和進食。實驗共給藥10周，每隔1周稱取體重1次，實驗結束時，取右側股骨進行Micro-CT掃描和三維重建，取左側股骨進行生物力學檢測。

1.4骨生物力學檢測

檢測時，將-20℃保存的股骨常溫解凍，生理鹽水復濕。用858 Mini Bionix型材料測試系統(tǒng)監(jiān)測和分析小鼠左側股骨的生物力學性能。將股骨置于流變儀上分別進行三點彎曲實驗，加載速度為0.155mm/s，跨距 9mm。由載荷、橈度換算并繪制應力-應變曲線，從曲線上讀取及根據(jù)公式計算相應的指標：最大載荷(Maximum load)、最大位移(Maximum displacement)、彈性載荷(Elastic load)、彈性位移(Elastic displacement)、剛度(Stiffness)等。

1.5Micro-CT測量

將處理好的小鼠股骨放入Micro-CT儀，對股骨的近干骺段進行X射線掃描。掃描條件為：圖像矩陣為2048×2048,整合時間為200 ms，能量/強度為70 kVp、114 μA、8 W。以0°旋轉，進行掃描。掃描完成后，選取生長板遠端1.0 mm、層厚2.0 mm的骨組織為松質骨感興趣區(qū)域(region of interest，ROI)進行三維重組，最低閾值為160提取圖像信息。獲取重組圖像后，使用Micro-CT自帶的軟件進行定量分析。物理參數(shù)分析如下：骨密度(bone mineral density, BMD)、連接密度(connection density, Conn.D)、骨體積分數(shù)(bone volume/total volume, BV/TV)、結構模型指數(shù)(structure model index, SMI)、骨小梁數(shù)量(trabecular number, Tb.N)、骨小梁分離度(trabecular separation, Tb.Sp)、骨小梁厚度(trabecular thickness, Tb.Th)。

1.6數(shù)據(jù)處理

2 結果

2.1各組小鼠實驗前及實驗后的體重變化

如表所示，與CON組相比， Co Q10L、Co Q10H、VE組小鼠和Co Q10L聯(lián)合VE組的體重差異無顯著意義(P>0.05)，提示Co Q10和VE對小鼠的體重影響不大。

表1 各組小鼠實驗前及實驗后的體重變化Table 1 Changes of body weight in mice of different groups n=7)

注：CON為正常組、VE為維生素E組、Co Q10L為輔酶Q10低劑量組、Co Q10H為輔酶Q10高劑量組、Co Q10L+VE為輔酶Q10低劑量聯(lián)合維生素E組。

2.2各組小鼠股骨遠端松質骨Micro-CT定量參數(shù)的變化與CON組比較，Co Q10L組BV/TV明顯上升112.4%(P<0.05),連接密度明顯上升175.8%(P<0.01),骨密度BMD明顯上升112.45%(P<0.01),SMI明顯下降34.21%(P<0.01),但是Tb.N,Tb.Sp,Tb.Th沒有明顯變化。與CON組比較，Co Q10H組BV/TV上升75%,連接密度明顯上升200.3%(P<0.01),骨密度BMD上升76.9%(P>0.05),SMI明顯下降30.52%(P<0.05),同時Tb.N,Tb.Sp,Tb.Th沒有明顯變化。

與CON組比較，VE組BV/TV沒有明顯的變化,連接密度明顯上升158.8%(P<0.01),骨密度BMD明顯上升82.8%(P<0.01),SMI明顯下降36.84%(P<0.01)但是Tb.N,Tb.Sp,Tb.Th沒有明顯變化。Co Q10L組、Co Q10H組與分別與VE組比較，兩組間的參數(shù)均沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

與CON組比較，Co Q10L聯(lián)合VE組BV/TV上升了54.9%(P>0.05),連接密度明顯上升162.7%(P<0.01),骨密度BMD上升54.9%(P>0.05),但是SMI,Tb.N,Tb.Sp,Tb.Th沒有明顯變化。Co Q10L+VE組分別與VE組、Co Q10L組、Co Q10H比較，兩組間的參數(shù)均沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表 2。

表2 Micro CT測定的小鼠股骨骨密度，骨體積分數(shù)，連接密度，數(shù)量，分離度和厚度參數(shù)Table 2 Changes of microstructural parameters of distal femur in mice of different

*P<0.05,**P<0.01,vs CON 注：CON為正常組、VE為維生素E組、Co Q10L為輔酶Q10低劑量組、Co Q10H為輔酶Q10高劑量組、Co Q10L+VE為輔酶Q10低劑量聯(lián)合維生素E組。

2.3各組小鼠股骨遠端松質骨Micro-CT二維圖和三維圖

與CON組(圖1-A)比較，Co Q10L(圖1-C)骨小梁走向一致，結構緊密，區(qū)域出現(xiàn)更為明顯的網(wǎng)狀結構，保持完整的微觀構筑。同時Co Q10低劑量與VE組(圖1-B)較CON組要完整，主要表現(xiàn)為骨小梁增多，間隙變小，排列有序出現(xiàn)較多完整的骨小梁連接結構。Co Q10高劑量組(圖1-D)出現(xiàn)部分的網(wǎng)狀結構，但是較Co Q10低劑量組(圖1-C)要稀疏。Co Q10L+VE(圖1-E)組骨小梁數(shù)目稀疏，間隙變大。見圖1。

2.4各組小鼠股骨生物力學參數(shù)變化

與CON組比較，Co Q10L組的剛度明顯上升21.86%(P<0.05), 最大載荷上升27.23%(P>0.05)，說明Co Q10L組股骨韌性增加，脆性減弱，抗變形能力有所增強。與CON組比較，Co Q10H組的最大位移明顯上升46.67%(P<0.05)，但是彈性載荷明顯下降18.32%(P<0.05)。

圖1 各組小鼠遠端股骨的顯微結構圖Fig.1 Micrographs of the vertical section of distal femur in different groups of miceNote: A:CON; B:VE; C:Co Q10L; D:Co Q10H; E: Co Q10L+VE

圖2 各組小鼠遠端股骨的SEG三維重建圖注：圖2為SEG圖，反映骨小梁的數(shù)量Fig.2 Segmented(SEG) image ofmicro-CT of distal femur in mice in different groupsNote: A:CON; B:VE; C:Co Q10L; D:Co Q10H; E: Co Q10L+VE

圖3 各組小鼠遠端股骨的分離度的三維重建圖注：圖3為SP圖，反映骨小梁的分離度情況，從綠到紅，反映了骨分離度從小到大Fig.3 Trabecular separation image ofmicro-CT of distal femur in mice in different groupsNote: A:CON; B:VE; C:Co Q10L; D:Co Q10H; E: Co Q10L+VE

圖4 各組小鼠遠端股骨的厚度的三維重建圖注：圖4為TH圖，反映骨小梁的厚度分布情況，從綠到紅，反映了骨從薄到厚。Fig.4 Trabecular thickness image of micro-CT of distal femur in mice in different groupsNote: A:CON; B:VE; C:Co Q10L; D:Co Q10H; E: Co Q10L+VE

與CON組比較，VE組最大載荷、最大位移、彈性載荷、剛度有所上升，但變化沒有顯著性差別。Co Q10L組與VE組之間變化沒有差別。與CON組比較，Co Q10L聯(lián)合VE組沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表3。

3 討論

骨生物力學主要是研究骨組織在外界作用下的力學性能和骨在受力后的所產(chǎn)生的生物學效應，是評價藥物對骨質量的指標，骨量的減少以及骨質內(nèi)部結構的改變均能影響骨生物力學，可降低生物力學強度[4]。另外，Micro-CT通過X線掃描和三維重建，極大地解決了骨組織形態(tài)計量學測量方面存在切片方向的不固定性和二維平面的局限性的問題，成為研究分析骨微觀結構的新興技術，是理想的研究骨形態(tài)學的工具[5]。從小鼠股骨二維縱切面截圖和三維結構重建后的分割圖直接觀察骨小梁的結構形態(tài)，縱切面截圖能夠直觀表現(xiàn)骨小梁的結構形態(tài)，骨小梁分離度圖可反映骨小梁的距離情況，從綠到紅，反映了骨小梁之間的距離越來越大。骨小梁厚度圖除了可見骨小梁的結構和幾何信息外，還可接反映骨小梁的厚度分布情況，從綠到紅，反映了骨從薄到厚，給骨骼的結構參數(shù)及力學參數(shù)的定量數(shù)值，觀察骨微結構變化[6]。

表3 各組小鼠股骨的最大載荷，最大位移，彈性載荷，彈性位移，剛度Table 3 Changes of biomechanical peoperties of femur in mice of different

*P<0.05 vs CON 注：CON為正常組、VE為維生素E組、Co Q10L為輔酶Q10低劑量組、Co Q10H為輔酶Q10高劑量組、Co Q10L+VE為輔酶Q10低劑量聯(lián)合維生素E組。

3.1輔酶Q10對10月齡小鼠股骨顯微結構和生物力學的影響

由表2和表3結果可知，Co Q10對10月齡小鼠股骨的顯微結構有一定的改善作用。與CON組相比，Co Q10L組的剛度明顯增加，剛度反映抗變形能力，說明Co Q10L能增加小鼠股骨抗變形能力。另外，Co Q10L組SMI明顯下降，BV/TV、BMD和Conn.D明顯升高。SMI 是用于評價骨小梁的形態(tài)結構，定義骨小梁板狀和桿狀的程度，理想板狀結構為0，理想桿狀結構為3，發(fā)生骨質疏松時，骨小梁從板狀向桿狀轉變，SMI數(shù)值增加，說明Co Q10L組骨小梁結構有所改善。Co Q10L組能明顯增加BV/TV，BV/TV是描述松質骨結構的一個參數(shù)，能夠反映松質骨樣本內(nèi)骨組織體積的含量，提示Co Q10L能提高小鼠股骨的骨體積分數(shù)。Co Q10L組BMD和Conn.D明顯升高，BMD和Conn.D分別描述骨密度和連接密度，說明Co Q10L能明顯增加小鼠股骨骨密度，并使其結構相對緊密。Tb.Th、Tb.N和Tb.Sp分別描述厚度、骨小梁數(shù)目和分離度這三方面，雖然Co Q10L組這三個參數(shù)沒有明顯的統(tǒng)計學差異，但是Tb.Th、Tb.N有所上升和Tb.Sp有所下降。Co Q10L組BV/TV、BMD和Conn.D明顯升高說明輔酶Q10可能通過調(diào)節(jié)核因子-κB(RANKL)誘導的破骨細胞分化過程，從而抑制破骨細胞的活性[7]，破骨細胞吸收能力小于成骨細胞骨形成功能，使得吸收范圍減少，進而使其連接密度、骨小梁數(shù)目和骨體積增多，小鼠股骨松質骨網(wǎng)狀結構的完整性得以保存，這與生物力學的參數(shù)結果相符合，表明松質骨微結構的改變影響了骨承載能力，對生物力學性能產(chǎn)生影響。

與CON組相比，Co Q10H組彈性載荷和最大位移明顯增加，提示Co Q10H能夠改善小鼠股骨的韌性。另外，Co Q10H組BV/TV、SMI和Conn.D明顯上升，但是在Tb.Th和Tb.N并沒有改變，說明骨體積、骨結構和連接密度雖然有明顯的提高，但是骨小梁數(shù)目和骨的厚度并沒有提高，從而只是使股骨結構的韌性得到提高，提示了使用過高劑量的輔酶 Q10并不能改善小鼠股骨的顯微結構和骨生物力學，因為Co Q10在破骨細胞的生成的過程中會抑制抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、NFATc1的基因表達以及相關免疫球蛋白樣受體而使破細胞活性減低，但是其作用有與Co Q10的劑量呈一定的劑量相關性，在一定的濃度范圍內(nèi)才會使破骨細胞活性減低[7]。這提示了過大劑量的Co Q10并不能改善小鼠的骨微結構和生物力學性能，要在合適的劑量范圍內(nèi)才會產(chǎn)生作用，這也說明了之前我們課題組30 mg·kg-1·d-1Co Q10這一劑量太小，導致環(huán)磷酰胺模型的大鼠股骨的顯微結構和骨量只有一定的改善作用，并沒有很好的提高其骨密度和生物力學性能。

3.2維生素E對10月齡小鼠股骨顯微結構和生物力學的影響

維生素E是高效的抗氧化劑和自由基清除劑，它主要通過抗氧化清除自由基，減少成骨細胞的氧化傾向同時刺激成骨細胞的活性，從而促進骨健康[8-9]。由表2中可得，與CON組比較，VE組小鼠股骨的部分參數(shù)有所修復，BMD和Conn.D明顯增加，BV/TV有上升的趨勢，Tb.Th、Tb.N和Tb.Sp沒有明顯的統(tǒng)計學差異，這提示維生素E可能在Tb.Th、Tb.N和Tb.Sp三個方面的共同作用下使BMD增加。

3.3輔酶Q10低劑量聯(lián)合維生素E對10月齡小鼠股骨顯微結構和生物力學的影響

與CON組比較，由表2和表3結果可知，Co Q10L聯(lián)合VE組只有Conn.D明顯升高，其他參數(shù)并沒有太大的變化，生物力學方面參數(shù)沒有統(tǒng)計學差異。說明Co Q10L聯(lián)合VE組對小鼠股骨的顯微結構和骨生物力學改善作用有限，這同時說明了單一應用Co Q10或者VE都能一定的改善小鼠股骨的顯微結構和骨生物力學參數(shù)，但是聯(lián)合應用在一起卻沒有很好的效果，其中的原因可能是藥物的協(xié)同作用所致，有研究[10]指出在抗氧化的過程中Co Q10和VE有協(xié)同作用，Co Q10通過還原VE在清除自由基是產(chǎn)生的α-生育酚?；杂苫?，節(jié)約和再生VE，但是其中Co Q10和VE劑量大小的配伍，卻有待進一步的探討，同時說明了Co Q10L聯(lián)合VE組的劑量并不是合適的濃度。VE主要的機制是通過抗氧化清除自由基，減少成骨細胞的氧化傾向同時刺激成骨細胞的活性，從而促進骨健康。同時有文獻報道，輔酶Q10減少活性自由基表達的同時，抑制破骨細胞的形成，促進成骨細胞礦化[11]，這提示了輔酶Q10可參與調(diào)節(jié)骨代謝的過程，抑制骨質疏松的發(fā)生。近幾年來有文獻報道輔酶Q10有改善骨關節(jié)炎和骨退化的作用，其機制可能是通過調(diào)節(jié)一氧化氮和炎癥細胞因子[12]，因此Co Q10主要通過抑制破骨細胞的表達，兩者的作用機制不一樣，對骨的影響也是在不同的方面。

3.4小結

綜上所述，本實驗研究了500 mg/(kg·d)Co Q10在預防小鼠骨質疏松中的作用效果，已表現(xiàn)出了良好的效果，特別是其改善骨質量，增加骨生物力學性能的作用。這一現(xiàn)象提示Co Q10在抗骨疏松方面具有良好的應用前景，但是其具體的作用機制有待進一步的探究。