陳麗梅，康穎娜，程紅平，李貴春，方　科△

(1.江西省鷹潭市人民醫(yī)院腫瘤科　335000；2.湖南省婁底市中心醫(yī)院腫瘤科　417000)

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HOXB9和E2F1在結(jié)腸癌中的表達(dá)及其意義

陳麗梅1，康穎娜2，程紅平1，李貴春1，方科1△

(1.江西省鷹潭市人民醫(yī)院腫瘤科335000；2.湖南省婁底市中心醫(yī)院腫瘤科417000)

[摘要]目的探討同源盒基因9(HOXB9)和E2F1在結(jié)腸癌中的表達(dá)及其是否存在相關(guān)性。方法采用免疫組織化學(xué)染色法和Western blot法檢測(cè)江西省鷹潭市人民醫(yī)院2012年1月至2015年1月65例結(jié)腸癌術(shù)后病理標(biāo)本中結(jié)腸癌組織和正常結(jié)腸組織中HOXB9和E2F1蛋白的表達(dá)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果HOXB9和E2F1在結(jié)腸癌組織中均高表達(dá)(P<0.05)，HOXB9在結(jié)腸癌中的表達(dá)程度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期呈正相關(guān)(均P<0.05)；而E2F1在結(jié)腸癌中的表達(dá)程度與浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期呈正相關(guān)(均P<0.05)；HOXB9和E2F1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論HOXB9和E2F1與結(jié)腸癌的發(fā)生相關(guān)，并且在其侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

[關(guān)鍵詞]結(jié)直腸腫瘤；基因，同源盒；HOXB9；E2F1；侵襲與轉(zhuǎn)移

結(jié)腸癌是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，近些年其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。盡管隨著新型腹腔鏡手術(shù)方式的開(kāi)展和新型靶向藥物的應(yīng)用，結(jié)腸癌患者5年生存率已經(jīng)有了很大改善，但病死率仍高。主要死亡原因?yàn)槟[瘤的復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因有血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、WNT5α和KITENIN，但目前能應(yīng)用于臨床治療的靶向藥物主要靶點(diǎn)只有Ras基因和VEGF[1]。

HOXB9是HOX家族中的成員，包括39個(gè)基因，分為4個(gè)基因簇，分別是HOX A、B、C和D，并且分布在4條不同染色體上。HOX基因家族在胚胎發(fā)育過(guò)程中起著重要作用，近些年的研究表明HOX基因家族在腫瘤中有表達(dá)，包括白血病、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌和卵巢癌[2]。研究表明，HOXB9是WNT/T細(xì)胞因子4(TCF4)信號(hào)通路的靶基因，WNT/TCF4信號(hào)通路參與了細(xì)胞增殖、分化、胚胎分割和四肢形成等過(guò)程[3]。HOXB9還可通過(guò)上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)途徑促進(jìn)新生血管形成和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移從而促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展[4]。研究表明，HOXB9蛋白在乳腺癌中表達(dá)上調(diào)并促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，并且在乳腺癌中的研究顯示E2F1可以與HOXB9基因的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，上調(diào)HOXB9的表達(dá)[5]。在實(shí)體標(biāo)本中免疫組織化學(xué)結(jié)果也證實(shí)HOXB9和E2F1表達(dá)存在顯著的相關(guān)性(P<0.01)。但在胃癌中表達(dá)卻下降，低表達(dá)的HOXB9與胃癌的不良預(yù)后有關(guān)[6]。

但在結(jié)腸癌中的觀點(diǎn)有分歧，Zhan等[2]認(rèn)為HOXB9在分化良好的結(jié)腸癌患者組織中高表達(dá)，并且與較長(zhǎng)的生存時(shí)間相關(guān)，并且體外實(shí)驗(yàn)顯示HOXB9過(guò)表達(dá)可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移。但Huang等[1]卻認(rèn)為HOXB9在結(jié)腸癌組織中過(guò)表達(dá)，并且與轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān)(P<0.05)。在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中發(fā)現(xiàn)HOXB9高表達(dá)，下調(diào)HOXB9表達(dá)后可以抑制癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，而增強(qiáng)HOXB9的表達(dá)卻能加強(qiáng)癌細(xì)胞的侵襲和遷移。筆者為了證實(shí)HOXB9在結(jié)腸癌中是否高表達(dá)，是否與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，開(kāi)展了本研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料選取江西省鷹潭市人民醫(yī)院2012年1月至2015年1月經(jīng)病理確診的結(jié)腸癌術(shù)后新鮮標(biāo)本和石蠟包埋的病理標(biāo)本65例，分別選擇結(jié)腸癌陰性切緣(正常結(jié)腸組織，距腫瘤組織5～8 cm)和結(jié)腸癌組織進(jìn)行切片。

1.2主要試劑免疫組織化學(xué)一抗為美國(guó)Molecular Tag公司原裝進(jìn)口；多聚賴氨酸、SP二抗試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購(gòu)自鎮(zhèn)江厚普生物科技有限公司進(jìn)口分裝；Western blot一抗為兔抗人HOXB9多克隆抗體、兔抗人E2F1多克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體均購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司。

1.3方法

1.3.1免疫組織化學(xué)法采用免疫組織化學(xué)染色SP法檢測(cè)人結(jié)腸癌術(shù)后標(biāo)本中腫瘤組織和陰性切緣中HOXB9和E2F1的表達(dá)部位及強(qiáng)度。操作步驟：切片4 μm，60 ℃烤片過(guò)夜；常規(guī)脫蠟水化，水洗；高溫、高壓修復(fù)5 min；滴加一抗4 ℃過(guò)夜；滴加二抗；滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液37 ℃，20 min；DAB顯色；蘇木素復(fù)染；顯微鏡觀察；圖像分析。

1.3.2Western blot法取術(shù)后新鮮病理標(biāo)本，在腫瘤組織和陰性結(jié)腸切緣進(jìn)行取材，將組織剪碎，使用細(xì)胞裂解液提取蛋白。用蛋白質(zhì)定量試劑盒(BCA)法進(jìn)行蛋白水平測(cè)定。取75～100 μg蛋白在100 g/L進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，后轉(zhuǎn)移至硝基纖維素濾膜，50 g/L脫脂奶37 ℃封閉1 h，加入兔抗人一抗，于4 ℃孵育過(guò)夜；加入羊抗兔二抗常溫孵育1 h，在凝膠1次成像儀內(nèi)曝光成像，以β-actin為內(nèi)參照。

1.3.3結(jié)果判定HOXB9和E2F1染色陽(yáng)性信號(hào)為細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒，每張切片選取5個(gè)高倍鏡視野(細(xì)胞計(jì)數(shù)200)，觀察陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度并計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞百分率。首先按照染色強(qiáng)度計(jì)分：0分為無(wú)染色，1分為淺黃色，2分為黃色，3分為棕黃色；再按照陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分：陽(yáng)性細(xì)胞小于5%為0分；5%～<25%為1分，25%～<50%為2分，50%～<75%為3分，大于或等于75%為4分。二者相乘為最后得分[7]。并采用最后得分作為染色程度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。免疫組織化學(xué)結(jié)果為等級(jí)資料，采用配對(duì)Wilcoxon秩和檢驗(yàn)；病理學(xué)參數(shù)和免疫組織化學(xué)數(shù)據(jù)為等級(jí)資料，他們之間的相關(guān)性分析采用兩變量之間的Spearman秩相關(guān)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)。

2結(jié)果

2.1HOXB9和E2F1在結(jié)腸癌中高表達(dá)HOXB9和E2F1在正常結(jié)腸組織和結(jié)腸癌中的免疫組織化學(xué)染色圖片，見(jiàn)圖1～4。從圖1、2的比較可以看出HOXB9在結(jié)腸癌細(xì)胞的細(xì)胞核中深染，呈棕黃色。在正常結(jié)腸組織細(xì)胞核中淡染。同一個(gè)視野下染色細(xì)胞數(shù)量較正常結(jié)腸組織中多，可以認(rèn)為HOXB9在結(jié)腸癌中高表達(dá)；同樣，從圖3、4的比較可以看出E2F1在結(jié)腸癌細(xì)胞胞核中深染，在正常結(jié)腸組織中淡染，并且同一個(gè)視野下染色細(xì)胞較正常結(jié)腸組織明顯多。Western blot 結(jié)果也顯示腫瘤組織中HOXB9和E2F1高表達(dá)，正常結(jié)腸組織中少量表達(dá)，與免疫組織化學(xué)結(jié)果相符(圖5)。以免疫組織化學(xué)最后評(píng)分代表HOXB9和E2F1的免疫組織化學(xué)染色程度，其值的高低表示HOXB9和E2F1的表達(dá)程度高低。對(duì)正常結(jié)腸組織和結(jié)腸癌組織中HOXB9和E2F1免疫組織化學(xué)染色評(píng)分進(jìn)行配對(duì)樣本W(wǎng)ilcoxon秩和檢驗(yàn)，HOXB9在結(jié)腸癌和正常結(jié)腸組織中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-6.943,P<0.05)，在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)。E2F1在結(jié)腸癌組織中也處于高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-7.023，P<0.05)，見(jiàn)表1。

圖1　HOXB9在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)(SP,×100)

圖2　HOXB9在正常結(jié)腸組織中的表達(dá)(SP,×100)

圖3　E2F1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)(SP,×400)

圖4　E2F1在正常結(jié)腸組織中的表達(dá)(SP，×100)

圖5　HoxB9和E2F1的Western blot 成像結(jié)果

項(xiàng)目n免疫組織化學(xué)染色評(píng)分1分2分3分4分6分8分9分ZP正常結(jié)腸組織HOXB96594367000-6.9430.000結(jié)腸癌組織HOXB9650101537012正常結(jié)腸組織E2F165124265000-7.0230.000結(jié)腸癌組織E2F16500095015

2.2HOXB9的表達(dá)程度與結(jié)腸癌病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系將HOXB9在結(jié)腸癌的免疫組織化學(xué)染色評(píng)分結(jié)果與患者的性別、年齡、腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和病理分期(AJCC2003年版TNM分期)分別進(jìn)行Spearman秩相關(guān)分析，HOXB9在結(jié)腸癌中的表達(dá)與性別、年齡、分化程度、浸潤(rùn)深度無(wú)相關(guān)(P>0.05)，而HOXB9在結(jié)腸癌中的表達(dá)程度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期均呈正相關(guān)(r=0.406、0.550、0.475，P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2　HOXB9表達(dá)與結(jié)腸癌病理學(xué)參數(shù)的Spearman秩相關(guān)分析

2.3E2F1的表達(dá)程度與結(jié)腸癌病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系同樣，將E2F1在結(jié)腸癌的免疫組織化學(xué)染色評(píng)分結(jié)果與患者的性別、年齡、腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和病理分期分別進(jìn)行Spearman秩相關(guān)分析，E2F1在結(jié)腸癌中的表達(dá)與性別、年齡、分化程度均無(wú)相關(guān)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而E2F1在結(jié)腸癌中的表達(dá)程度與浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期呈正相關(guān)(r=0.295、0.387、0.542、0.375，P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3　E2F1表達(dá)與結(jié)腸癌病理學(xué)參數(shù)的Spearman秩相關(guān)分析

2.4HOXB9與E2F1在結(jié)腸癌中的表達(dá)關(guān)系將HOXB9與E2F1在結(jié)腸癌中的表達(dá)程度作Spearman檢驗(yàn)，HOXB9、E2F1在結(jié)腸癌和正常結(jié)腸組織中的表達(dá)均無(wú)相關(guān)性(P>0.05)；而HOXB9和E2F1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.356，P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4　HOXB9與E2F1在結(jié)腸癌中表達(dá)的Spearman秩相關(guān)分析

3討論

結(jié)腸癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，也是美國(guó)癌癥相關(guān)病死率中位于第2位，每年全球也有將近120萬(wàn)新發(fā)結(jié)腸癌患者[8]。Ⅰ、Ⅱ、ⅢA期結(jié)腸癌手術(shù)治療效果好，轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌治療以化療為主，近幾十年以表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、VEGF等靶點(diǎn)的分子靶向治療取得了很大進(jìn)步。但這些靶向藥物通常需聯(lián)合化療，單獨(dú)應(yīng)用效果不佳，通常只能作為二、三線方案，或不適合化療的患者。因此更多的治療靶點(diǎn)有待挖掘。

HOXB9在多種腫瘤組織中高表達(dá)，并且與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān)。研究顯示E2F1可以結(jié)合到HOXB9基因啟動(dòng)子-404至-392核苷酸區(qū)域，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄，HOXB9可以活化TGFβ-ATM軸，引起細(xì)胞周期檢查點(diǎn)活化和啟動(dòng)基因修復(fù)，從而使細(xì)胞從G1期到S期，啟動(dòng)細(xì)胞增殖[5]。本研究結(jié)果顯示，HOXB9和E2F1在結(jié)腸癌組織中均高表達(dá)，在正常結(jié)腸組織中低表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而且HOXB9和E2F1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)程度與在相應(yīng)正常結(jié)腸組織中的表達(dá)程度無(wú)相關(guān)性(P>0.05)，也就是說(shuō)在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)并不受正常結(jié)腸組織中表達(dá)程度的影響?？梢哉J(rèn)為HOXB9和E2F1在結(jié)腸癌形成過(guò)程中發(fā)揮作用。

HOXB9在結(jié)腸癌中的表達(dá)程度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期均呈正相關(guān)(P<0.05)。結(jié)腸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度越高，HOXB9蛋白表達(dá)越高，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者HOXB9表達(dá)越高，TNM分期越晚，其表達(dá)程度越高。而E2F1在結(jié)腸癌中的表達(dá)程度與浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期均呈正相關(guān)(P<0.05)。同樣，結(jié)腸癌浸潤(rùn)越深、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度越高，E2F1表達(dá)程度越高，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者E2F1表達(dá)程度也越高，以及TNM分期越晚，其表達(dá)程度也越高。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期正是結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的病理學(xué)參數(shù)，結(jié)合本研究結(jié)果，可以看出HOXB9和E2F1可能在結(jié)腸癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用。并且在結(jié)腸癌組織中，HOXB9和E2F1的表達(dá)也呈正相關(guān)(P<0.05)，這與他們之間的相互作用關(guān)系有關(guān)。正是由于E2F1可以結(jié)合到HOXB9啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，如果能阻斷這一相互作用，就能有效抑制結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移過(guò)程。

總之，HOXB9和E2F1在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，可能參與了結(jié)腸癌的形成過(guò)程，并且與結(jié)腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。但是否能針對(duì)HOXB9與E2F1研究有效的治療藥物還需要進(jìn)行阻斷這一相互作用的藥物進(jìn)行結(jié)腸癌動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)。

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作者簡(jiǎn)介：陳麗梅(1984-)，主治醫(yī)師，本科，主要從事消化系統(tǒng)腫瘤研究。 △通訊作者，E-mail:fangkeqq88@163.com。

doi:·經(jīng)驗(yàn)交流·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.15.023

[中圖分類(lèi)號(hào)]R735.1

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]B

[文章編號(hào)]1671-8348(2016)15-2104-03

(收稿日期：2015-11-28修回日期：2016-02-06)