李春英，鄒金海

(河北省滄州市中心醫(yī)院消化內(nèi)一科　061001)

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腹水CD64、外周血mCD14在肝硬化合并自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎中的變化及其意義

李春英，鄒金海

(河北省滄州市中心醫(yī)院消化內(nèi)一科061001)

[摘要]目的探討腹水CD64、外周血mCD14在肝硬化合并自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎(SBP)中的變化及其意義。方法選取該院肝硬化合并腹水患者174例，根據(jù)是否合并SBP將患者分為研究組(合并SBP，88例)和對(duì)照組(未合并SBP，86例)。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腹水CD64與外周血mCD14，全部患者均采用頭孢他啶聯(lián)合氧氟沙星抗菌治療。結(jié)果與對(duì)照組相比，研究組的外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)[(4.41±1.05) ×109/L]、腹水中性粒細(xì)胞CD64平均熒光強(qiáng)度(16 421.35±289.37)和腹水CD64指數(shù)(182.34±16.31)均顯著升高(P<0.05)，而淋巴細(xì)胞的外周血mCD14陽(yáng)性表達(dá)率[(2.71±0.07)%]、外周血mCD14平均熒光強(qiáng)度(45.62±14.07)、外周血mCD14指數(shù)(115.24±24.15)及腹水CD64平均熒光強(qiáng)度(86.47±10.24)則均顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與治療無(wú)效/死亡患者相比，治療有效/生存患者的腹水中性粒細(xì)胞CD64平均熒光強(qiáng)度(574.34±114.01)和腹水CD64指數(shù)(52.33±11.25)均顯著降低(P<0.05)，而外周血mCD14平均熒光強(qiáng)度(130.11±15.31)、外周血mCD14指數(shù)(289.01±30.11)和腹水淋巴細(xì)胞CD64平均熒光強(qiáng)度(131.06±20.33)則顯著升高，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；此外，與腹水CD64、外周血mCD14單項(xiàng)檢測(cè)相比，二者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)治療效果和預(yù)后的預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確度顯著升高，比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論腹水CD64與外周血mCD14檢測(cè)可以提示肝硬化是否合并SBP，二者聯(lián)合檢測(cè)在對(duì)肝硬化合并SBP的診斷和治療效果判定中有顯著的臨床意義。

[關(guān)鍵詞]腹水；肝硬化；淋巴細(xì)胞；CD64；mCD14；自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎

自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎(spontaneous bacterial peritonitis, SBP)是在非腹腔臟器穿孔和損傷的情況下出現(xiàn)的腹膜急性感染，是一種常發(fā)生的臨床并發(fā)癥，常繼發(fā)于肝硬化失代償期。SBP的發(fā)生可能和機(jī)體的免疫力降低、感染機(jī)會(huì)增多、腸道屏障功能減弱及腸道細(xì)菌異位有關(guān)。由于缺乏典型的早期臨床癥狀和體征，SBP難以早期診斷和治療，因而，SBP感染是肝硬化患者死亡的最主要原因之一[1]。在部分細(xì)菌感染性疾病中，腹水中性粒細(xì)胞CD64分子增高顯著，而在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、病毒性感染性疾病、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等中變化不明顯[2]。外周血mCD14主要分布在單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞的細(xì)胞表面，是一種55×103的糖蛋白(白細(xì)胞分化抗原)，在病原菌入侵后機(jī)體的免疫反應(yīng)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。有研究表明，細(xì)菌感染性疾病患者的外周血mCD14表達(dá)水平與患者病情程度密切相關(guān)，患者病情越嚴(yán)重其外周血mCD14表達(dá)水平越低[3]。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于肝硬化SBP中腹水CD64、外周血mCD14的臨床意義報(bào)道較少，本研究旨在通過(guò)聯(lián)合檢測(cè)肝硬化SBP中腹水CD64、外周血mCD14的表達(dá)水平，為肝硬化合并SBP的診斷和治療提供科學(xué)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料選取2014年1月至2016年1月本院消化內(nèi)一科收治的肝硬化合并腹水患者174例。根據(jù)臨床癥狀、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果明確是否合并SBP，并將患者分為研究組(合并SBP)和對(duì)照組(未合并SBP)。研究組88例，其中男68例，女20例；年齡34～68歲，平均(51.34±7.05)歲；肝功能(Child-Pugh)評(píng)分(10.28±2.01)分。對(duì)照組86例，其中男70例，女16例；年齡34～69歲，平均(50.75±7.14)歲；Child-Pugh評(píng)分(10.04±1.49)分。兩組患者疾病類(lèi)型如下。乙型肝炎病毒性肝硬化：研究組24例，對(duì)照組24例；丙型肝炎病毒性肝硬化：研究組14例，對(duì)照組12例；酒精性肝硬化：研究組10例，對(duì)照組12例；乙型/丙型肝炎病毒合并酒精性肝硬化：研究組24例，對(duì)照組24例；隱源性肝硬化：研究組4例，對(duì)照組4例；膽汁性肝硬化：研究組6例，對(duì)照組6例；肝硬化合并肝細(xì)胞癌：研究組6例，對(duì)照組4例。研究組和對(duì)照組間年齡、性別、肝功能分級(jí)和疾病類(lèi)型等一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

納入標(biāo)準(zhǔn)：患者診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《肝臟疾病預(yù)防與治療指南》，腹水中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)大于或等于250×106/L。排除標(biāo)準(zhǔn)：完善體格檢查、血液細(xì)菌培養(yǎng)、胸部X線片、CT等檢查結(jié)果排除腹腔感染、其他系統(tǒng)感染及近期使用過(guò)抗感染藥的患者。研究組符合SBP的診斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)局部腹膜炎癥狀表現(xiàn)為腹部壓痛、腹痛、腹瀉、嘔吐和腸梗阻等；(2)發(fā)熱、畏寒、呼吸急促、外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)異常；(3)肝功能惡化；(4)消化道出血；(5)急進(jìn)性腎損傷；(6)無(wú)明確原因的肝性腦?。?7)休克；(8)腹水細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果為陽(yáng)性；(9)腹水中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)大于或等于250×106/L、血清腹水白蛋白梯度(SAAG)≥11 g/L。其中符合(9)可確診為肝硬化合并SBP。對(duì)照組排除SBP的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1檢測(cè)方法(1)試劑與儀器：同型免疫球蛋白、溶血素和紅細(xì)胞裂解液由上海生工生物工程有限公司提供；CD64抗體試劑盒和異硫氰酸熒光素標(biāo)記性MCD14單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)CST公司；CANTO-Ⅱ流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；Eppendorf 5810R高速冰凍離心機(jī)、System XT-2000i血常規(guī)儀、Stago-Compact 血凝功能分析儀、HITACHI7600型全自動(dòng)生化分析儀、Cobase411電化學(xué)發(fā)光儀。(2)標(biāo)本采集方法：采集所有受試者在應(yīng)用抗感染藥物前的清晨空腹外周血，進(jìn)行血常規(guī)、凝血功能、肝功能和腎功能等檢查。腹水檢測(cè)包括腹水常規(guī)和細(xì)菌培養(yǎng)，無(wú)菌條件下行腹腔穿刺術(shù)，抽取腹水10～15 mL，送檢至常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)或其他檢測(cè)，標(biāo)本于-70 ℃冰箱保存。(3)腹水CD64檢測(cè)和外周血mCD14檢測(cè)采用流式細(xì)胞術(shù)。腹水CD64檢測(cè)方法：取上述采集的患者腹水適量經(jīng)離心、過(guò)濾、腹水CD64抗體孵育染色、紅細(xì)胞裂解液溶血及洗滌后，采用流式細(xì)胞儀測(cè)定腹水CD64平均熒光強(qiáng)度。外周血mCD14檢測(cè)方法：取上述采集的患者外周全血適量經(jīng)與外周血mCD14抗體孵育、紅細(xì)胞溶解、離心、PBS緩沖液清洗等一系列操作后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)、觀察外周血mCD14陽(yáng)性表達(dá)率及其外周血mCD14平均熒光強(qiáng)度，采用同型免疫球蛋白對(duì)照。

1.2.2觀察指標(biāo)研究組均給予頭孢他啶聯(lián)合氧氟沙星抗菌藥物治療1周，1周后對(duì)治療效果進(jìn)行評(píng)估。療效評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)[4]如下。(1)有效：腹水細(xì)菌培養(yǎng)為陰性，腹水中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)小于250×108/L，炎癥性癥狀得到緩解；(2)無(wú)效：腹水細(xì)菌培養(yǎng)為陽(yáng)性，腹水中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)大于或等于250×108/L，炎癥性癥狀無(wú)改善甚至惡化。此外，對(duì)治療有效和治療無(wú)效患者的生存和死亡、腹水CD64及外周血mCD14進(jìn)行分析比較，并用受試者工作特征曲線(ROC曲線)測(cè)試腹水CD64與外周血mCD14單獨(dú)檢測(cè)及二者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)治療效果和預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值。腹水中性粒細(xì)胞CD64平均熒光強(qiáng)度、腹水淋巴細(xì)胞CD64平均熒光強(qiáng)度和外周血mCD14平均熒光強(qiáng)度的正常參考范圍分別為：<5 000、>100、>80。腹水CD64指數(shù)=腹水中性粒細(xì)胞CD64平均熒光強(qiáng)度/腹水淋巴細(xì)胞CD64平均熒光強(qiáng)度；外周血mCD14指數(shù)=外周血mCD14陽(yáng)性表達(dá)率×外周血mCD14平均熒光強(qiáng)度×外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)/10 000。

2結(jié)果

2.1兩組腹水CD64比較174例患者的腹水CD64的檢測(cè)結(jié)果顯示，研究組腹水中性粒細(xì)胞CD64平均熒光強(qiáng)度和腹水CD64指數(shù)均明顯高于對(duì)照組(P<0.05);而淋巴細(xì)胞CD64平均熒光強(qiáng)度則顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1　兩組患者腹水CD64比較

2.2兩組外周血mCD14比較研究組外周血mCD14陽(yáng)性表達(dá)率、外周血mCD14平均熒光強(qiáng)度和mCD14指數(shù)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，而外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)則明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2　兩組外周血mCD14比較

2.3治療有效和無(wú)效患者腹水CD64、外周血mCD14比較研究組中治療有效患者60例，治療無(wú)效患者28例，經(jīng)檢驗(yàn)，兩組基線資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療有效患者的腹水中性粒細(xì)胞CD64平均熒光強(qiáng)度和腹水CD64指數(shù)均顯著低于治療無(wú)效患者(P<0.05)，而外周血mCD14指數(shù)、外周血mCD14平均熒光強(qiáng)度和腹水淋巴細(xì)胞CD64平均熒光強(qiáng)度則明顯高于治療無(wú)效患者(P<0.05)，見(jiàn)表3。

2.4生存和死亡患者腹水CD64、外周血mCD14比較研究組隨訪6個(gè)月，共隨訪86例，隨訪率為97.73%，其中生存54例，死亡32例。經(jīng)檢驗(yàn)，兩組基線資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。生存患者的腹水中性粒細(xì)胞CD64平均熒光強(qiáng)度和腹水CD64指數(shù)顯著低于死亡患者(P<0.05)，而生存患者的外周血mCD14指數(shù)、腹水CD64平均熒光強(qiáng)度和外周血mCD14平均熒光強(qiáng)度則顯著高于死亡患者(P<0.05)，見(jiàn)表4。

2.5腹水CD64與外周血mCD14聯(lián)合檢測(cè)對(duì)治療效果和預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值ROC曲線顯示，腹水CD64和外周血mCD14單項(xiàng)檢測(cè)均對(duì)治療效果和預(yù)后的狀況有重要的預(yù)測(cè)作用，但二者聯(lián)合檢測(cè)較單獨(dú)腹水CD64、外周血mCD14檢測(cè)更準(zhǔn)確，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1～2、表5。

表3　治療有效和無(wú)效患者腹水CD64、外周血mCD14比較

表4　生存和死亡患者腹水CD64、外周血mCD14比較

表5　腹水CD64與外周血mCD14聯(lián)合檢測(cè)對(duì)治療效果和預(yù)后狀況的預(yù)測(cè)價(jià)值

a：P<0.05，與腹水CD64、外周血mCD14指數(shù)聯(lián)合比較。

圖1　腹水CD64、外周血mCD14指數(shù)對(duì)治療效果的ROC曲線

圖2　腹水CD64、外周血mCD14指數(shù)對(duì)預(yù)后狀況的ROC曲線

3討論

由于晚期肝硬化患者的免疫力明顯降低，在臨床上約20%的肝硬化患者容易形成SBP。外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)在肝硬化合并細(xì)菌性感染性疾病患者中減少，但在肝硬化合并其他疾病患者中同樣會(huì)降低[5]，因此用白細(xì)胞計(jì)數(shù)診斷肝硬化合并SBP的準(zhǔn)確度較低。此外，外周血中性粒細(xì)胞比例、外周血白細(xì)胞、血清C反應(yīng)蛋白、紅細(xì)胞沉降率和降鈣素原等是臨床上診斷細(xì)菌感染的常用指標(biāo)，但其在腫瘤轉(zhuǎn)移浸潤(rùn)、外科術(shù)后等其他狀況下也會(huì)發(fā)生顯著變化[6]，因此特異性較差。細(xì)菌感染的金標(biāo)準(zhǔn)是腹水細(xì)菌培養(yǎng)，但其有歷時(shí)長(zhǎng)和靈敏度低等局限。CD64是免疫球蛋白超家族成員之一，是免疫球蛋白G(IgG)的Fc受體，主要分布于巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞表面、中性粒細(xì)胞中表達(dá)水平較低。中性粒細(xì)胞CD64分子在機(jī)體受到病原菌入侵等應(yīng)激性作用下會(huì)迅速升高，因此，可作為細(xì)菌感染性疾病早期診斷的依據(jù)[7]。在重癥感染性疾病的發(fā)生和發(fā)展中，單核細(xì)胞發(fā)揮重要作用。有研究稱，重癥胰腺炎外周血mCD14指數(shù)、外周血mCD14陽(yáng)性表達(dá)率和外周血mCD14平均熒光強(qiáng)度顯著低于陰性對(duì)照組，上述指標(biāo)在存活患者中呈逐漸升高趨勢(shì)，而在死亡患者中的表達(dá)水平較低，這提示外周血mCD14低水平表達(dá)提示患者預(yù)后欠佳[8]。外周血mCD14陽(yáng)性表達(dá)率呈降低傾向時(shí)處于免疫抑制，預(yù)后欠佳。有研究者在重癥感染患者住院24 h內(nèi)對(duì)患者進(jìn)行外周血mCD14測(cè)定，其結(jié)果顯示患者外周血mCD14表達(dá)水平顯著高于健康人群，這可能是由于短期內(nèi)免疫亢進(jìn)現(xiàn)象引起的。炎癥免疫亢進(jìn)現(xiàn)象消失后，患者的外周血mCD14平均熒光強(qiáng)度顯著低于健康人群[9]。但關(guān)于腹水CD64和外周血mCD14在肝硬化SBP中的變化及其臨床意義研究罕見(jiàn)。

本研究結(jié)果顯示，研究組的外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)和腹水中性粒細(xì)胞CD64平均熒光強(qiáng)度明顯增高，而腹水淋巴細(xì)胞CD64平均熒光強(qiáng)度明顯降低，結(jié)合本研究結(jié)果，研究組腹水CD64指數(shù)顯著增高，與相關(guān)報(bào)道一致[10]。同時(shí)，與對(duì)照組相比，研究組外周血mCD14陽(yáng)性表達(dá)率和外周血mCD14平均熒光強(qiáng)度均明顯降低，因此，研究組外周血mCD14指數(shù)顯著降低，外周血mCD14指數(shù)反映每單位外周血mCD14相對(duì)總數(shù)，提示肝硬化合并SBP患者處于免疫抑制狀態(tài)。另一方面，本研究發(fā)現(xiàn)治療有效患者的腹水CD64指數(shù)顯著降低，外周血mCD14指數(shù)顯著增高，聯(lián)合檢測(cè)患者腹水CD64和

外周血mCD14指數(shù)對(duì)治療效果的預(yù)測(cè)價(jià)值顯著優(yōu)于單獨(dú)腹水CD64、外周血mCD14指數(shù)檢測(cè)；與死亡患者相比，生存患者的腹水CD64指數(shù)明顯降低，其外周血mCD14指數(shù)則明顯升高，聯(lián)合檢測(cè)腹水CD64和外周血mCD14指數(shù)對(duì)患者預(yù)后的判定價(jià)值明顯優(yōu)于單獨(dú)腹水CD64、外周血mCD14指數(shù)檢測(cè)；二者聯(lián)合參數(shù)較單獨(dú)腹水CD64、外周血mCD14參數(shù)更準(zhǔn)確。現(xiàn)今尚無(wú)有效指標(biāo)預(yù)測(cè)治療效果和預(yù)后狀況，結(jié)合該研究結(jié)果揭示，腹水CD64在肝硬化合并SBP中顯著增高，外周血mCD14在肝硬化合并SBP中顯著降低，二者均對(duì)治療效果和預(yù)后狀況具有重要的預(yù)測(cè)作用。

但目前仍缺乏對(duì)外周血mCD14表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)方法。由于實(shí)驗(yàn)室處理樣本方法及其規(guī)范不同，采用的流式細(xì)胞儀與抗體均具有明顯差異，可能影響檢測(cè)結(jié)果。本研究采用平均熒光強(qiáng)度用于反映外周血單核細(xì)胞膜表面mCD14水平，容易受檢測(cè)過(guò)程的影響。因此，需要標(biāo)準(zhǔn)化方法用于定量測(cè)定外周血單核細(xì)胞膜表面mCD14水平，以增加外周血mCD14對(duì)肝硬化合并SBP預(yù)測(cè)價(jià)值的可信度。

綜上所述，腹水CD64與外周血mCD14檢測(cè)可以作為肝硬化是否合并SBP的判斷依據(jù)，二者聯(lián)合檢測(cè)在對(duì)硬化合并SBP的診斷和治療效果判定中有顯著的臨床意義。

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作者簡(jiǎn)介：李春英(1976-)，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事胃腸、肝膽胰腺疾病的診斷治療研究。

doi:論著·臨床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.15.017

[中圖分類(lèi)號(hào)]R657.31

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-8348(2016)15-2084-03

(收稿日期：2015-11-29修回日期：2016-02-22)

The change and significance of ascites CD64 and peripheral mCD14 combined detection for hepatocirrhosis with SBP

Li Chunying，Zou Jinhai

(theFirstDigestionDepartment，CangzhouCentralHospitalofHebeiProvince,Cangzhou,Hebei061001)

[Abstract]ObjectiveTo study the change and significance of ascites CD64 and peripheral mCD14 combined detection for hepatocirrhosis with SBP.MethodsA total of 174 cases hepatocirrhosis with ascites were selected and divided into research group (combined SBP, 88 cases) and control group (none SBP,86 cases).Ascites CD64 and peripheral blood mCD14 were detected by flow cytometry. All patients were treated with ceftazidime and ofloxacin.Resultsneutrophil CD64 average fluorescence intensity(1 642.35±289.3),CD64 index(182.34±16.31) and peripheral blood leukocyte count[(4.41±1.05)×109/L] of research group were significantly higher than those of control group(P<0.05);lymphocyte CD64 average fluorescence intensity(86.47±10.24),mCD14 positive expression rate[(2.71±0.07)%],monocyte mCD14 average fluorescence intensity(45.62±14.07) and mCD14 index(115.24±24.15) were significantly lower than those of control group (P<0.05).CD64 average fluorescence intensity(574.34±114.01) and neutrophil CD64 index(52.33±11.25) of effective treatment/survival group were significantly lower than those of ineffective treatment/death group;lymphocyte CD64 average fluorescence intensity(131.06±20.33),monocyte mCD14 average fluorescence intensity(130.11±15.31) and mCD14 index(289.01±30.11) of effective treatment/survival group were significantly higher than those of ineffective treatment/death group(P<0.05).The area under the ROC curve,critical value,sensitivity and speciality rate of ascites CD64 and peripheral blood mCD14 combined detection for therapeutic effect and prognosis prediction were significantly higher than those of CD64,mCD14 single detection(P<0.05).ConclusionAscites CD64 and peripheral blood mCD14 combined detection predicts therapeutic effect and prognosis for hepatocirrhosis with SBP significantly.

[Key words]ascites；liver cirrhosis；lymphocytes；CD64；mCD14；spontaneous bacterial peritonitis