郭淑娟，王琮民

(1.邯鄲市中心醫(yī)院老年病科,河北邯鄲 056001；2.河北工程大學附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,河北邯鄲 056001)

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局灶性腦缺血再灌注大鼠腦損傷與半暗帶鋅離子水平的關(guān)系研究*

郭淑娟1，王琮民2

(1.邯鄲市中心醫(yī)院老年病科,河北邯鄲 056001；2.河北工程大學附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,河北邯鄲 056001)

[摘要]目的檢測局灶性腦缺血大鼠在再灌注不同時間窗腦梗死體積及皮質(zhì)半暗帶區(qū)鋅離子(Zn2+)的水平，分析討論Zn2+對缺血性腦卒中大鼠腦組織損傷的影響及機制。方法健康雄性SD大鼠120只分為假手術(shù)組(SHAM組，n=40)、大腦中動脈栓塞組(MCAO組，n=40)、Zn2+螯合劑+MCAO組(TPEN+MCAO組，n=40)。線栓法制備大鼠腦缺血再灌注模型，于灌注后0、3、12、24 h將大鼠斷頭取腦，冷凍切片，行2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色、LOZEX-F圖像掃描確定腦梗死體積；采用新型熒光探針FLOUZin-3檢測缺血后再灌注不同時間點時大鼠腦內(nèi)皮質(zhì)半暗帶區(qū)Zn2+的陽性細胞數(shù)及熒光強度；采用Pearson法分析Zn2+水平與腦梗死體積間的相關(guān)性。結(jié)果(1) SHAM組大鼠未出現(xiàn)腦梗死，MCAO組大鼠腦梗死體積隨再灌注時間的增加而增大，與MCAO組大鼠相比，TPEN+MCAO組的腦梗死體積顯著減少(P<0.05)；(2) FLOUZin-3染色顯示，SHAM組大鼠皮質(zhì)半暗帶區(qū)未出現(xiàn)Zn2+染色陽性細胞，MCAO組皮質(zhì)半暗帶區(qū)Zn2+陽性細胞數(shù)隨再灌注時間的增加而增多，與MCAO組大鼠相比,TPEN+MCAO組的Zn2+染色陽性細胞顯著減少(P<0.05)。(2)Pearson相關(guān)分析顯示,MCAO組大鼠皮質(zhì)半暗帶區(qū)FLOUZin-3染色陽性細胞數(shù)與腦梗死體積之間呈高度正相關(guān)(r=0.921，P<0.05)。結(jié)論較高濃度Zn2+可能為內(nèi)源神經(jīng)毒物在缺血性腦卒中腦損傷過程中發(fā)揮了重要作用。

[關(guān)鍵詞]腦缺血；創(chuàng)傷和損傷；鋅；再灌注；腦損傷；半暗帶；鋅離子螯合劑

缺血性腦卒中亦稱腦梗死，一般指由于腦動脈粥樣硬化而引起的血管內(nèi)腔狹窄或完全閉塞而形成的一種腦血管意外性疾病，致殘和病死率比較高，且治療技術(shù)一直沒有重大突破[1-2]。鋅在人體內(nèi)的含量僅次于鐵，游離態(tài)鋅離子(Zn2+)聚集在中樞神經(jīng)的突觸小泡中，常與酶和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，對人體的正常生長發(fā)育、蛋白質(zhì)代謝、免疫等過程發(fā)揮重要作用[3]。有研究指出，神經(jīng)系統(tǒng)受損時，Zn2+會從突觸前神經(jīng)元軸突末端大量涌入突觸后神經(jīng)元[4-5]。也有報道指出，Zn2+在腦缺血介導的腦神經(jīng)元死亡過程中作用突出[6]。這些研究主要集中在海馬CA1區(qū)，本實驗采用線栓法制作大鼠中動脈栓塞缺血(MCAO)再灌注模型，并在MCAO前30 min腹腔注射Zn2+螯合劑(TPEN，20 mg/kg)。用2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色法測定再灌注不同時間點的腦梗死體積，并用新型熒光探針FLOUZin-3檢測缺血后再灌注不同時間點時大鼠腦內(nèi)皮質(zhì)半暗帶區(qū)Zn2+的水平和熒光強度，探討Zn2+對缺血性腦卒中腦損傷的影響及其作用機制，為尋找臨床治療腦卒中的新策略提供實驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料TPEN(sigma公司，美國)、FLOUZin-3(sigma公司，美國)、TTC(上海恒遠生物科技有限公司)、手術(shù)顯微鏡(MOELLER-WEDEL公司，德國)、TDA-8301H 溫度顯示調(diào)節(jié)儀(Olympus 公司，日本)、OCT包埋劑(SAKURA公司，美國)、手動臺式冷凍切片機MTC(SLEE公司，德國)、BH-2 顯微鏡(Phillip公司日本)，大鼠呼吸機(美國CWE公司)。

表1　不同時間點腦梗死體積比較±s，%)

a：P<0.05、b：P<0.01，與再灌注0 h比較；c：P<0.01，與再灌注3 h比較；d：P<0.05，與再灌注12 h比較。

1.2方法

1.2.1實驗動物分組及模型制備健康雄性SD大鼠120只，體質(zhì)量250～300 g，實驗動物許可證號SYXK(冀)2014-0038，清潔級。采用抽簽方法分為3組：假手術(shù)組(SHAM組，n=40)、MCAO組(n=40)、TPEN+MCAO組(n=40)。TPEN+MCAO組于MCAO前30 min腹腔注射TPEN，其他兩組注射等量的生理鹽水。大鼠于缺血90 min后行再灌注術(shù)，分為4個時間點：0、3、12、24 h，每次10只。本實驗采用線栓法制備MCAO模型[7]，試驗中特別注意了插入深度和栓線的粗細，保證既要阻斷血流，又不能刺破血管。MCAO過程檢測大鼠的肛溫、動脈壓、心率，使3項生理指標保持正常。

1.2.2腦梗死體積計算缺血90 min再灌注不同時間點時大鼠用水合氯醛(10%)麻醉處死，立即斷頭取腦，生理鹽水沖洗干凈，放于蠟槽中，在-24 ℃冰箱中冷凍全腦30 min，從額極至枕極把大腦切成2 mm厚度的冠狀切片6個，將切片快速置于2%TTC染色液中，在37 ℃條件下，避光孵育20 min。除第5個切片，其他切片順序擺放在藍色背景平板上，拍照。照片輸入Imageplus5.0系統(tǒng)，分析計算腦梗死體積。腦梗死體積百分比為(A-B)/A×100%。其中，A：健側(cè)大腦半球體積=(A1+A2+...+A6)×h，B:梗死側(cè)非梗死區(qū)大腦半球體積=(B1+B2+...+B6)×h。Ai為第i片切片健側(cè)腦組織面積，Bi代表第i片梗死側(cè)非梗死區(qū)腦組織面積梗死體積，h表示切片厚度[8-9]。

1.2.3FLOUZin-3染色分析取上步各大鼠第5片冠狀切片進行連續(xù)冷凍，進一步切為20 μm 10片，加入FLOUZin-3進行染色，終濃度為10 mol/L。37 ℃環(huán)境，避光孵育30 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3遍，在熒光顯微鏡下觀察腦切片內(nèi)缺血半暗帶區(qū)Zn2+水平(半暗帶區(qū)范圍為病灶旁5 mm區(qū)域)。每張切片隨機選取4個不同角度，在同等放大倍數(shù)和參數(shù)下拍照，用專業(yè)圖像分析軟件NIS Element確定皮質(zhì)半暗帶區(qū)FLOUZin-3 Zn2+陽性細胞數(shù)和平均熒光強度,熒光強度平均值為總熒光強度值和FLOUZin-3陽性細胞數(shù)比值[10-11]。

2結(jié)果

2.1不同時間點各組大鼠腦梗死體積比較經(jīng)TTC染色，SHAM組大鼠未見腦梗死，MCAO組大鼠再灌注不同時間點均現(xiàn)梗死灶，隨再灌注時間增加，梗死體積也顯著增加(P<0.05)。單因素方差分析顯示，再灌注各不同時間點TPEN+MCAO組的腦梗死體積顯著小于MCAO組(P<0.05)，見表1、圖1。圖中紅色為正常組織，白色為病變組織。

圖1　再灌注不同時間點TTC染色結(jié)果(×500)

2.2FLOUZin-3染色分析SHAM組大鼠缺血再灌注各時間點未現(xiàn)FLOUZin-3染色Zn2+陽性細胞，但MCAO組大鼠在再灌注的個時間點皮層半暗帶均出現(xiàn)FLOUZin-3染色Zn2+陽性細胞，高倍鏡下胞體現(xiàn)綠色熒光，突起清晰，再灌注0 h到3 h，12 h到24 h，F(xiàn)LOUZin-3染色Zn2+陽性細胞數(shù)顯著增加(P<0.05)，但從再灌注后3 h到12 h，F(xiàn)LOUZin-3染色Zn2+陽性細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。單因素方差分析顯示，再灌注各不同時間點TPEN+MCAO組的FLOUZin-3染色Zn2+陽性細胞數(shù)顯著小于MCAO組(P<0.05)。各時間點之間的平均熒光強度值相差無統(tǒng)計學意義，見表2、圖2。

2.3腦梗死體積與Zn2+水平的相關(guān)性分析MATLAB進行Pearson分析，結(jié)果顯示，MCAO組大鼠缺血半暗帶區(qū)的FLOUZin-3染色陽性細胞和不同時間點的腦梗死體積之間呈高度正相關(guān)(r=0.921，P<0.05)，見圖3。

表2　不同時間點FLOUZin-3染色Zn2+陽性細胞數(shù)比較

a：P<0.05、b：P<0.01，與再灌注0 h比較；c：P<0.01，與再灌注3 h比較；d：P<0.05，與再灌注12 h比較。

圖2再灌注不同時間點FLOUZin-3染色結(jié)果(×500)

圖3　Zn2+和梗死體積的相關(guān)性分析

3討論

鋅在人體內(nèi)的水平僅次于鐵，是腦神經(jīng)生長發(fā)育的必需元素，Zn2+在中樞神經(jīng)細胞內(nèi)聚集在突觸小泡內(nèi)，生理濃度的Zn2+對神經(jīng)元有保護作用,但Zn2+在體內(nèi)濃度過高或過低會對身體造成傷害[1]。在接受刺激尤其是腦缺血時，大腦皮層中的Zn2+會從突觸小泡和神經(jīng)元內(nèi)大量釋放并涌入突觸后神經(jīng)元。有報道指出，大鼠全腦缺血24 h后，海馬CA1區(qū)的錐體細胞會出現(xiàn)延遲性神經(jīng)元死亡，而且錐體細胞內(nèi)Zn2+水平逐漸增加，但如果大鼠在缺血后用Zn2+阻斷劑處理，則錐體細胞內(nèi)Zn2+水平降低，而且海馬CA1區(qū)的錐體細胞的神經(jīng)元損傷減輕，說明高濃度的Zn2+可能參與了神經(jīng)元的死亡過程[12]。以上的研究主要觀察了海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的Zn2+濃度和腦損傷的關(guān)系，未關(guān)注缺血半暗帶區(qū)Zn2+的變化情況，缺血半暗帶區(qū)已成為急性缺血性腦卒中治療的新靶點。

FLOUZin-3是一種新型的Zn2+熒光探針，發(fā)光強度大，波動性小，抗其他金屬離子干擾性強，可檢測聚集到突觸后神經(jīng)元的Zn2+流[13]。本實驗在MCAO過程中檢測了大鼠的肛溫、動脈壓和心率指標，3組大鼠的生理參數(shù)都在正常范圍，據(jù)此可以忽略手術(shù)過程對實驗過程的影響。由實驗結(jié)果可知，腦缺血誘導了Zn2+在突觸后神經(jīng)元的集聚。但如用Zn2+螯合劑進行預處理，則半暗帶區(qū)的FLOUZin-3 Zn2+陽性染色細胞明顯減少，各個時間點大鼠的腦梗死體積也明顯降低。有文獻[16]指出，在動物腦缺血模型中用TPEN預處理，可以降低大鼠的病死率[14]。有文獻提示，大鼠在腦缺血再灌注1 h時，腦梗死區(qū)域未現(xiàn)凋亡神經(jīng)元，但在再灌注3～24 h內(nèi),凋亡神經(jīng)元進行性增多[15]。這些發(fā)現(xiàn)說明Zn2+的集聚可能是引起腦組織損傷的1個重要因素，移除多余的Zn2+可以對腦缺血再灌注損傷起到保護作用。實驗結(jié)果表明，再灌注0 h時，腦梗死體積約8%，梗死體積較小，F(xiàn)LOUZin-3染色陽性細胞數(shù)也較少，提示Zn2+從再灌注開始便參與了腦組織的損傷過程，但Zn2+參與大鼠腦缺血再灌注損傷的生理機制還沒有完全搞清。文獻[16]指出，Zn2+大量聚集可能會影響線粒體功能，抑制線粒體腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)生成，刺激活性氧(ROS)生成。并且，細胞內(nèi)Zn2+聚集會放大凋亡通路，增加細胞的凋亡率。本實驗和這個結(jié)論基本相似，故推測高濃度的Zn2+會作為內(nèi)源性毒素作用于腦組織，誘發(fā)腦組織神經(jīng)元損傷或死亡。

本實驗結(jié)果表明，缺血再灌注不同時間窗的熒光強度值差異不明顯，這可能是因為單個細胞內(nèi)結(jié)合狀態(tài)的Zn2+迅速釋放使細胞內(nèi)的游離態(tài)Zn2+快速飽和，致使熒光強度增加不明顯。本實驗發(fā)現(xiàn)，Zn2+和腦梗死體積之間呈高度正相關(guān)，這也進一步表明了Zn2+參與了腦缺血損傷并發(fā)揮著重要作用。

綜上所述，腦缺血再灌注大鼠腦內(nèi)Zn2+水平隨灌注時間進行性增加，且與腦梗死體積顯著正相關(guān)，故推測較高濃度的Zn2+可能會作為內(nèi)源性毒素參與腦損傷過程，為臨床研究缺血性腦病的治療技術(shù)提供新依據(jù)。

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doi:論著·基礎(chǔ)研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.15.008

*基金項目：國家自然科學基金資助項目(81400934)。

作者簡介：郭淑娟(1979-)，主任醫(yī)師，博士，主要從事神經(jīng)病學研究。

[中圖分類號]R741.02

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)15-2055-03

(收稿日期：2015-11-15修回日期：2016-02-16)

Relationship between focal cerebral ischemia reperfusion injury of rats and level of Zinc ions in penumbra*

Guo Shujuan1,Wang Congmin2

(1.DepartmentofGeriatrics,HandanCentralHospital,Handan,Hebei056001,China;2.DepartmentofNeurology,HebeiEngineeringUniversity,Handan,Hebei,056001,China)

[Abstract]ObjectiveTo detect the cerebral infarct volume and the contents of Zinc ions in the penumbra of rats with focal cerebral ischemia and reperfusion in different time,and to analyse the effect of Zinc ions on brain tissue damage in rats with ischemic stroke.MethodsA total of 120 healthy male SD rats were divided into SHAM operation group (SHAM group,n=40),middle cerebral artery occlusion group (MCAO group,n=40) and TPEN+MCAO group(n=40).Through drawing method,rat cerebral ischemia reperfusion model was established by suture method.After perfusion 0 h,3 h,12 h and 24 h,the brain were removed and stained by TTC to determine the volume of cerebral infarction by LOZEX-F image scanning;the positive Zinc ions cell number and fluorescence intensity were detected by fluorescent probes FLOUZin-3.Results(1) Cerebral infarction were not found in SHAM group；the volume of cerebral infarction in MCAO group was increased with reperfusion time extension；compared with MCAO group,TPEN+MCAO group significantly reduced cerebral infarction volume(P<0.05).(2)FLOUZin-3 cells were not found in SHAM group;a drastic increase of FLOUZin-3 cells was observable in the penumbra of MCAO group;compared with group MCAO group,TPEN+MCAO group significantly reduced FLOUZin-3 cells(P<0.05).(3)There was positive correlation between the FLOUZin-3 positive cell numbers and the volume of cerebral infarction in MCAO group(r=0.921，P<0.05).ConclusionHigher concentrations of Zinc ions as endogenous nerve poison might play an important role in the process of brain injury in ischemic stroke.

[Key words]cerebral ischemia；wounds and injuries；Zinc；reperfusion；brain tissue damage；penumbra；Zn2+chelation