潘　宏，王凌志，陶岳峰，江　兵，曹燕慶，鄭　毅，章小軍

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬安慶醫(yī)院整形外科，安徽安慶 246003)

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電刺激迷走神經(jīng)和甲基潑尼松龍對(duì)兔脊髓損傷后TNF-α水平的影響*

潘宏，王凌志，陶岳峰，江兵，曹燕慶，鄭毅，章小軍

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬安慶醫(yī)院整形外科，安徽安慶 246003)

[摘要]目的探討迷走神經(jīng)刺激對(duì)兔脊髓損傷(SCI)后脊髓組織中腫瘤壞死因子-α (TNF-α)水平的影響，并與甲基潑尼松龍(MP)進(jìn)行比較。方法125只新西蘭大白兔分為假手術(shù)組(SHAM組，25只)、SCI組(25只)、迷走神經(jīng)刺激組(STM組，25只)、MP組(25只)和STM+MP組(25只)。采用改良Allen 打擊法制作兔脊髓損傷模型，STM組及STM+MP組于脊髓損傷后接受右側(cè)頸迷走神經(jīng)電刺激(5 V、2 ms和1 Hz，持續(xù)20 min)。術(shù)后1、4、8、12、24 h分別采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法及逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)法檢測(cè)各組脊髓組織中TNF-α蛋白水平及mRNA水平。結(jié)果與SCI組相比，STM組、MP組、STM+MP組的脊髓組織中TNF-α蛋白水平均有明顯下降，其中STM+MP組降低最為顯著；與SCI組和STM組相比較，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)MP組和STM+MP組的TNF-α mRNA水平下降明顯。結(jié)論迷走神經(jīng)刺激可降低兔急性脊髓損傷的促炎因子TNF-α蛋白水平，其效果接近于MP，且在抑制TNF-α蛋白表達(dá)方面與MP具有協(xié)同作用。

[關(guān)鍵詞]脊髓損傷；腫瘤壞死因子-α；甲基潑尼松龍；迷走神經(jīng)刺激

目前，全球的脊髓損傷(spinal cord injury，SCI) 的發(fā)病率約為14.5/10萬(wàn)～57.8/10萬(wàn)[1]，SCI在我國(guó)也屬于高發(fā)疾病，具有較高的致殘率和病死率。SCI的損傷機(jī)制包括各種致傷因素造成的原發(fā)性損傷，以及隨之而來(lái)的繼發(fā)性損傷。繼發(fā)性損傷可以破壞中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)的血腦屏障，導(dǎo)致脊髓組織出血、水腫，免疫細(xì)胞和抗體可以通過(guò)受損的血腦屏障侵入CNS，損傷局部而引起劇烈的免疫炎性反應(yīng)。炎性反應(yīng)是促使脊髓神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生變性壞死的重要環(huán)節(jié),而介導(dǎo)炎性反應(yīng)發(fā)生和發(fā)展的是一些重要的細(xì)胞因子，其中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)在SCI中的作用逐漸受到重視。TNF-α不僅可以對(duì)脊髓組織造成直接損害，還可以啟動(dòng)和上調(diào)多種炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子，誘發(fā)炎性反應(yīng)的級(jí)聯(lián)放大效應(yīng),進(jìn)一步加重繼發(fā)性損傷[2]。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn),刺激外周迷走神經(jīng)能夠顯著和快速地抑制TNF-α的釋放,減輕全身及局部的炎性反應(yīng)，從而提出了膽堿能抗炎通路 (cholinergic anti-inflammatory pathway,CAP)的理論[3]。本實(shí)驗(yàn)擬在兔SCI模型基礎(chǔ)上，觀察和比較電刺激迷走神經(jīng)及甲基潑尼松龍(methylprednisolone，MP)對(duì)兔SCI后炎癥性細(xì)胞因子TNF-α的影響作用，為治療SCI提供新的思路。

1材料與方法

1.1材料125只新西蘭大白兔，體質(zhì)量(2.4±0.2)kg，購(gòu)自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。分為5組：假手術(shù)組(SHAM組，25只)、SCI組(25只)、迷走神經(jīng)電刺激組(STM組，25只)、MP組(25只)、STM+MP組(25只)。

1.2方法

1.2.1SCI模型制作新西蘭兔以3%的戊巴比妥鈉耳緣靜脈注射麻醉，劑量約30 mg/kg(即1 mL/kg)。常規(guī)備皮、消毒，取俯臥位，行背部后正中切口，逐層切開。依據(jù)體表定位(確定第12肋)，分離并顯露T11～L2棘突，小心咬除T12～L1棘突及椎板，顯露相應(yīng)節(jié)段脊髓組織，注意不傷及硬膜囊。采用改良Allen打擊法建立兔SCI模型，用造模器自帶夾持器扣住T11和L2棘突，以固定脊柱，使用自制的打擊裝置打擊致傷脊髓組織，硬脊膜完好無(wú)破損。新西蘭兔雙后肢成軟癱，刺激無(wú)反應(yīng)后，逐層關(guān)閉切口。傷口撒以抗生素。

1.2.2實(shí)驗(yàn)過(guò)程及樣本采集(1)SHAM組僅行椎板切除，不損傷脊髓，僅暴露雙側(cè)迷走神經(jīng)，無(wú)其他特殊處理；(2)SCI組采用改良Allen打擊法建立SCI模型；(3)STM組對(duì)SCI模型先行雙側(cè)迷走神經(jīng)暴露并予以切斷，SCI后即刻采用電刺激治療儀(G6805-Ⅱ型，青島)予以右側(cè)迷走神經(jīng)遠(yuǎn)端持續(xù)電刺激(5 V、2 ms和1 Hz) 20 min[4]；(4)MP組對(duì)SCI模型即刻予以MP沖擊治療(給予15 min內(nèi)靜脈滴注30 mg/kg MP)，無(wú)后續(xù)特殊處理[5]；(5)STM+MP組對(duì)SCI模型即刻予以右側(cè)迷走神經(jīng)遠(yuǎn)端持續(xù)電刺激(5 V、2 ms和1 Hz) 20 min，并同時(shí)給予MP沖擊治療(予以15 min內(nèi)靜脈滴注30 mg/kg MP)。SHAM組、SCI組、STM組、MP組、STM+MP組分別于術(shù)后1、4、8、12、24 h各個(gè)時(shí)間點(diǎn)各處死5只新西蘭兔并取材。取材時(shí)以傷段為中心取鄰近兩端的脊髓組織，長(zhǎng)約1.5 cm，稱質(zhì)量后均分為兩部分，一部分進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)TNF-α水平，另一部分進(jìn)行TNF-α mRNA測(cè)定。所取脊髓組織均迅速浸入液氮5 min后轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測(cè)TNF-α mRNA表達(dá)取-80 ℃保存的脊髓組織標(biāo)本，嚴(yán)格按照Trizol說(shuō)明書提取脊髓組織總RNA。提取的總RNA經(jīng)高精度分光光度計(jì)(Merinton SMA4000，美國(guó))檢測(cè)合格后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 (MBI Fermentas，立陶宛) 說(shuō)明書完成實(shí)驗(yàn)并保留cDNA，在進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)之前根據(jù)RNA濃度將cDNA稀釋成一致水平。應(yīng)用Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)PCR引物，由上海博亞公司合成。兔TNF-α引物序列上游5′-TCT TCT GCC TGC TGC ACT TC-3′，下游5′-CTT GCG GGT TTG CTA CTA CG-3′；兔三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)引物序列為上游5′-AGA GCA CCA GAG GAG GAC GA-3′，下游5′-TGG GAT GGA AAC TGT GAA GAG G-3′。RT-PCR的步驟和條件按試劑盒(TianGen，北京)及定量PCR儀(BIO-RAD CFX，美國(guó))的操作說(shuō)明書進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)結(jié)果由熒光定量PCR分析軟件BIO-RAD CFX Manager自動(dòng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和計(jì)算。

1.2.4ELISA檢測(cè)TNF-α蛋白表達(dá)取-80 ℃保存的脊髓組織于冰上解凍，以每克組織加入1 mL裂解液冰浴超聲勻漿，勻漿后低溫離心，取提取的上清液及不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品各孔100 μL，按照TNF-α ELISA試劑盒(Cloud-Clone Corp，美國(guó))說(shuō)明書操作，用酶標(biāo)儀(Spectra Plus 384，美國(guó))在450 μm測(cè)定光密度(OD)值。

1.2.5TNF-α表達(dá)的Western Blot 測(cè)定取出液氮中凍存的標(biāo)本,將組織塊剪碎,加入冰預(yù)冷的細(xì)胞裂解液進(jìn)行勻漿，4 ℃，12 000 r/min離心10 min，取上清液，采用蛋白質(zhì)定量試劑盒(BCA)法測(cè)定蛋白濃度。配制10%分離膠和5%濃縮膠，上樣，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳。根據(jù)蛋白Marker的位置切膠，將聚偏二氯乙烯(PVDF)膜和濾紙剪成與需印跡凝膠相似的小塊。隨后，先將PVDF膜在甲醇中浸泡約30 s，再在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡10 min，后與濾紙、凝膠一起放入電轉(zhuǎn)移緩沖液中。按夾心法依次將濾紙、凝膠、PVDF膜、濾紙疊放于轉(zhuǎn)膜板上夾緊，插入電泳槽中，倒入轉(zhuǎn)膜緩沖液，100 mA穩(wěn)流電轉(zhuǎn)移2～3 h；取出PVDF膜，去離子水洗滌，將PVDF膜浸入含5%脫脂奶粉的封閉液中，置搖床上緩慢搖動(dòng)，室溫封閉1 h；取出已封閉的PVDF膜，浸于TBST緩沖液中，于搖床上緩慢洗滌5 min。然后，加入一抗，4 ℃孵育過(guò)夜；棄去一抗，TBST緩沖液漂洗3遍，每次15 min；加入二抗，于室溫?fù)u床上孵育2 h；棄去二抗，TBST緩沖液漂洗3遍，每次15 min；電化學(xué)發(fā)光(ECL)發(fā)光液發(fā)光。凝膠成像系統(tǒng)采集及分析(ChemiDoc XRS+System，美國(guó))。

2結(jié)果

2.1各組脊髓組織中TNF-α的ELISA檢測(cè)結(jié)果正常脊髓組織中TNF-α少量表達(dá)，SCI后其表達(dá)迅速上調(diào)，于12 h達(dá)到高峰后開始下降；MP組、STM組與SCI組相比，傷后各個(gè)時(shí)間段TNF-α的蛋白水平均受到不同程度的抑制，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；MP組和STM組相比，于傷后8 h和24 h的TNF-α蛋白水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；STM+MP組傷后1、4、8、12、24 h 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)TNF-α蛋白水平均低于MP組和STM組(P<0.01)；SHAM組術(shù)后TNF-α蛋白水平低，與其他組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖1、表1。

圖1　各組脊髓組織中 TNF-α蛋白水平

組別n術(shù)后1h術(shù)后4h術(shù)后8h術(shù)后12h術(shù)后24hSCI組25874.29±57.631124.06±63.201390.09±70.541598.51±83.621327.35±67.28STM組25434.17±34.28a633.34±47.35a984.25±56.74a1117.37±58.93a1078.55±61.86a

續(xù)表1　各組TNF-α蛋白水平的變化

a：P<0.01,與SCI組比較;b：P<0.01,與STM組比較;c：P<0.01,與MP組比較;d：P<0.01,與STM+MP組比較。

2.2各組脊髓組織中TNF-α的Western blot檢測(cè)結(jié)果SHAM組脊髓組織中TNF-α僅有少量表達(dá)，SCI后24 h時(shí)脊髓組織中TNF-α的表達(dá)明顯升高，經(jīng)迷走神經(jīng)刺激或(和)MP沖擊治療，脊髓組織中的TNF-α的表達(dá)均有下降,見圖2。

圖2　SCI后24 h時(shí)TNF-α的表達(dá)情況

2.3脊髓組織中TNF-α mRNA的變化SCI后，TNF-α mRNA水平在1 h內(nèi)迅速達(dá)到高峰，然后逐步下降；STM組和SCI組相比，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的TNF-α mRNA水平均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與SCI組和STM組相比較，MP組和STM+MP組的TNF-α mRNA水平下降明顯，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MP組和STM+MP組相比，于術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)的TNF-α mRNA水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；SHAM組術(shù)后TNF-α mRNA水平低，與其他組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖3、表2。

圖3　各組脊髓組織中TNF-α mRNA水平

組別n術(shù)后1h術(shù)后4h術(shù)后8h術(shù)后12h術(shù)后24hSCI組250.933±0.0530.912±0.0640.867±0.0680.819±0.0670.775±0.069STM組250.927±0.0510.884±0.0580.892±0.0540.800±0.0570.759±0.058MP組250.659±0.071ab0.610±0.067ab0.542±0.062ab0.509±0.054ab0.449±0.057abSTM+MP組250.635±0.057ab0.632±0.052ab0.521±0.049ab0.485±0.040ab0.465±0.038abSHAM組250.137±0.0215abcd0.142±0.0224abcd0.144±0.0192abcd0.140±0.0209abcd0.142±0.0213abcdF184.68156.99164.03165.15128.12P<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01

a：P<0.01,與SCI組比較;b：P<0.01,與STM組比較;c：P<0.01,與MP組比較;d：P<0.01,與STM+MP組比較。

3討論

SCI的病理生理過(guò)程包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷兩個(gè)階段，原發(fā)性機(jī)械損傷是不可逆的，而繼發(fā)性SCI是一個(gè)可以在細(xì)胞和分子水平主動(dòng)調(diào)節(jié)的過(guò)程，具有可逆性而且可以被控制[2]。多種細(xì)胞因子在SCI后早期即可明顯上調(diào)，誘導(dǎo)和參與損傷局部的炎性反應(yīng)，在繼發(fā)性損傷的病理過(guò)程中起著重要作用[1]，其中TNF-α是起關(guān)鍵作用的一組細(xì)胞因子[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，在SCI后1 h損傷部位的TNF-α mRNA水平和蛋白水平均有顯著增加，在傷后1～8 h內(nèi)TNF-α的蛋白水平達(dá)到最高峰，傷后24 h仍顯著高于對(duì)照組；此外，SCI后TNF-α通過(guò)血腦屏障的轉(zhuǎn)運(yùn)也明顯增加[1,7]。作為SCI后早期出現(xiàn)上調(diào)的細(xì)胞因子，TNF-α可以激活一系列的蛋白，如蛋白激酶C、磷脂酶A2等，加重繼發(fā)性SCI的程度[1,8]。因此，通過(guò)抑制TNF-α的表達(dá)，可以減輕損傷后脊髓組織中過(guò)度的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，發(fā)揮抗炎作用，可保護(hù)脊髓組織和促進(jìn)受損脊髓功能恢復(fù)[8]。

MP被用于治療SCI已經(jīng)有40多年歷史，目前大劑量MP是美國(guó)急性SCI的標(biāo)準(zhǔn)治療方法,已經(jīng)成為規(guī)范治療的一部分[9]。MP的抗炎機(jī)制是先激活胞質(zhì)中糖皮質(zhì)激素受體，形成復(fù)合物進(jìn)入胞核，阻止基因調(diào)控蛋白核因子κB(NF-κB)與TNF-α基因啟動(dòng)子部位κB點(diǎn)結(jié)合，抑制TNF-α的基因轉(zhuǎn)錄和TNF-α mRNA的翻譯，阻止TNF-α合成表達(dá)，從而減輕SCI后的炎性反應(yīng)[8]。但也有學(xué)者認(rèn)為MP并不能明顯改善SCI患者的預(yù)后[10]。

近幾年發(fā)現(xiàn)，免疫炎性反應(yīng)還可以通過(guò)另外一條通路即CAP來(lái)進(jìn)行調(diào)節(jié)，該通路通過(guò)迷走神經(jīng)能夠顯著、快速地抑制巨噬細(xì)胞TNF-α的釋放,參與和調(diào)節(jié)外周炎性反應(yīng)[3,11]。Wang等[11]發(fā)現(xiàn)，CAP是通過(guò)迷走神經(jīng)的主要遞質(zhì)乙酰膽堿(Ach)與巨噬細(xì)胞上的特異性受體a7nAChR相結(jié)合，從而抑制TNF-α的釋放。有國(guó)外學(xué)者相繼發(fā)現(xiàn)，不僅巨噬細(xì)胞上存在有α7nAChR，在神經(jīng)系統(tǒng)中,神經(jīng)元及不同的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中同樣有α7nAChR的表達(dá)[12],提示這些神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞也有可能成為膽堿能抗炎作用的靶標(biāo)[13]。Dougelas等[14]通過(guò)研究證明在CNS中確實(shí)存在有通過(guò)激活a7nAchR而誘導(dǎo)的CAP，這為控制SCI后的繼發(fā)性炎性反應(yīng)提供了一個(gè)新的思路和方向。

目前已經(jīng)證明了通過(guò)電刺激迷走神經(jīng)可以促進(jìn)釋放大量乙酰膽堿,進(jìn)而激活CAP，抑制TNF-α等促炎性因子的上調(diào)，減輕全身炎性反應(yīng)。因此，本研究建立兔SCI模型，采用刺激迷走神經(jīng)的方法來(lái)調(diào)節(jié)SCI后的繼發(fā)性炎性反應(yīng)。結(jié)果顯示，迷走神經(jīng)剌激能夠降低SCI后脊髓組織內(nèi)的促炎因子TNF-α的水平，與經(jīng)典藥物MP的作用基本相當(dāng)。其調(diào)節(jié)機(jī)制可能與外周炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié)機(jī)制相類似，CNS的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞等參與炎性反應(yīng)的細(xì)胞通過(guò)自分泌、旁分泌或內(nèi)分泌的方式接受循環(huán)血液及組織液中神經(jīng)遞質(zhì)Ach的調(diào)控，激活其表面的α7nAChR，抑制促炎因子TNF-α的產(chǎn)生，從而實(shí)現(xiàn)其免疫抑制功能。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，刺激迷走神經(jīng)只能減少SCI部位的TNF-α的蛋白水平，對(duì)TNF-α mRNA沒有抑制作用，這與Borovikova等[3]的研究結(jié)果相一致，表明ACh的抗炎靶點(diǎn)是作用于蛋白，而非轉(zhuǎn)錄水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在刺激迷走神經(jīng)的同時(shí)結(jié)合使用MP，可以進(jìn)一步降低損傷部位的TNF-α的表達(dá)水平，表明兩種方法具有協(xié)同作用，可能的機(jī)制是由于二者的抗炎靶點(diǎn)不同，不存在競(jìng)爭(zhēng)性抑制。MP的作用靶點(diǎn)是抑制TNF-α的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯[8]，當(dāng)TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄已經(jīng)開始進(jìn)行，MP則不能抑制TNF-α的表達(dá)，而激活CAP可以對(duì)TNF-α的轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮抑制作用[3]，從而實(shí)現(xiàn)持續(xù)性免疫調(diào)節(jié)過(guò)程。

綜上所述，SCI后脊髓組織中的TNF-α表達(dá)水平快速、顯著升高，加劇了繼發(fā)性SCI。而刺激迷走神經(jīng)能夠通過(guò)CAP抑制損傷后脊髓組織中的TNF-α的合成及分泌，發(fā)揮有效的抗炎和脊髓保護(hù)作用，同時(shí)可以輔助或部分替代MP,以避免或減少M(fèi)P的毒副作用，對(duì)繼發(fā)性SCI的治療具有非常重要的意義。

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doi:論著·基礎(chǔ)研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.15.007

*基金項(xiàng)目：安徽省教育廳高等學(xué)校省級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目(KJ2013Z149)。

作者簡(jiǎn)介：潘宏(1972-)，副主任醫(yī)師，博士，主要從事脊柱、創(chuàng)傷研究。

[中圖分類號(hào)]R651.2

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-8348(2016)15-2051-04

(收稿日期：2015-11-08修回日期：2016-02-16)

Contrastive study of vagus nerve stimulation and methylprednisolone on TNF-α expression in spinal cord tissue after acute spinal cord injury in rabbits*

Pan Hong，Wang Lingzhi,Tao Yuefeng，Jiang Bing，Cao Yanqing，Zheng Yi，Zhang Xiaojun

(DepartmentofOrthopaedics，AffiliatedAnqingMunicipalHospitalofAnhuiMedicalUniversity，Anqing，Anhui246003，China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effects of vagus nerve stimulation on tumor necrosis factor-α expression in spinal cord tissue after acute spinal cord injury(SCI) in rabbits.And a contrastive study was performed between vagus nerve stimulation and methylprednisolone(MP).MethodsA total of 125 New Zealand white rabbits were divided into sham-operated group(SHAM group,n=5),SCI group(n=25),vagus nerve stimulation group(STM group,n=25),MP group(n=25) and STM+MP group(n=25).The SCI models of rabbits were established by the modified Allen′s weight hit.The right cervical vagus nerves of the rabbits in STM group and STM+MP group were stimulated(5 V,1 Hz,2 ms,lasting 20 min).At the 1,4,8,12,24 hour after SCI,TNF-α protein expressions of spinal cord tissue were detected through enzyme linked immuno sorbent assay (ELISA) and the mRNA levels of TNF-α were measured by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR).ResultsThe expressions of TNF-α protein in the spinal cord of STM group,MP group and STM+MP group were less than that of SCI group,and the greatest decrease was observed in STM+MP group.Compared with SCI group and STM group,the expressions of TNF-α mRNA decreased significantly in both MP group and STM+MP group at every time point.ConclusionSTM could reduce the expressions of TNF-α in the spinal cord of rabbits after acute SCI.The effect of vagus nerve stimulation restrained the TNF-α expressions is comparable to MP and have synergistic action with MP in terms of the inhibition of TNF-α expressions.

[Key words]spinal cord injury;tumor necrosis factor-α;methylprednisolone;vagus nerve stimulation