白　濤，錢　偉，汪　歡，張　磊，宋　軍，侯曉華

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院消化內(nèi)科，武漢 430022)

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Piezo2蛋白的生物信息學(xué)分析及其在腸道中的表達(dá)*

白濤，錢偉，汪歡，張磊，宋軍△，侯曉華

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院消化內(nèi)科，武漢 430022)

[摘要]目的對Piezo2性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行預(yù)測分析，并檢測其在腸道的表達(dá)。方法利用Protparam程序預(yù)測人Piezo2蛋白基本理化性質(zhì)；TMHMM Serve 2.0預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)域；ProtComp Version 9.0分析亞細(xì)胞定位；用SOPMA程序預(yù)測其二級結(jié)構(gòu)；SWISS-MODEL服務(wù)器生成其三維模型。免疫組織化學(xué)染色確定Piezo2在腸道組織的表達(dá)位置，以實時定量熒光PCR檢測Piezo2在不同腸段的表達(dá)量及與Epac1表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果Piezo2蛋白分子式為C14539H22436N3662O4087S130，相對分子質(zhì)量為318.092×103，等電點pI=5.82。Piezo2蛋白存在35個跨膜結(jié)構(gòu)域，并有多個蛋白修飾位點。免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)Piezo2蛋白表達(dá)于腸道上皮與神經(jīng)節(jié)，其在結(jié)腸表達(dá)水平較回腸豐富(P<0.01)，其中結(jié)腸Piezo2與Epac1在mRNA水平表達(dá)呈正相關(guān)(r2=0.65，P<0.01)。結(jié)論P(yáng)iezo2在結(jié)腸表達(dá)豐富，可能通過Epac1通路參與腸道機(jī)械力感知與調(diào)控。

[關(guān)鍵詞]腸神經(jīng)系統(tǒng)；腸黏膜；機(jī)械門控離子通道；Piezo2

2010年Coste等[1]發(fā)現(xiàn)并定義了Piezo2蛋白。通過細(xì)胞系中的體外siRNA篩選及電生理實驗的方法，證實Piezo2是機(jī)械門控離子通道蛋白。Piezo2是非選擇性陽離子通道蛋白，受機(jī)械信號刺激，通道開放，將機(jī)械刺激信號轉(zhuǎn)化為生物電信號。Piezo2表達(dá)于傳入神經(jīng)節(jié)(如三叉神經(jīng)節(jié)及背根神經(jīng)節(jié))、梅克爾細(xì)胞、肺、膀胱等組織。在生物機(jī)體感受機(jī)械刺激過程中有重要作用。有關(guān)機(jī)械刺激的感知的細(xì)胞學(xué)及分子生物學(xué)機(jī)制研究尚不清楚，Piezo2蛋白的發(fā)現(xiàn)和研究具有重要意義。本文通過生物信息學(xué)預(yù)測Piezo2蛋白理化性質(zhì)、蛋白結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能，同時檢測其在腸道組織中的表達(dá)及定位，推測Piezo2蛋白在腸道感知機(jī)械刺激信號中可能有重要作用，現(xiàn)報道如下。

1材料與方法

1.1材料人Piezo2蛋白的基因及其編碼蛋白的GenBank登錄號依次為JN790819與AFC88283。多克隆抗體Piezo2購自Abcam公司；二抗購自武漢博士德公司；Trizol購自Gibco公司；PCR引物由上海英俊生物有限公司合成；逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒購自TAKARA公司；NIH小鼠購自廣東省實驗動物中心。

1.2方法

1.2.1生物信息學(xué)方法利用Protparam在線程序預(yù)測人Piezo1蛋白基本理化性質(zhì)[2]，如相對分子質(zhì)量、等電點、平均疏水系數(shù)等；利用在線系統(tǒng)TMHMM Serve 2.0預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)域[3]；利用ProtComp Version 9.0在線工具分析亞細(xì)胞定位；利用SOPMA在線程序預(yù)測其二級結(jié)構(gòu)[4]；利用SWISS-MODEL服務(wù)器生成其三維模型[5]，并在PyMOL Version 1.7.4中編輯。

1.2.2實驗室方法4%多聚甲醛固定組織標(biāo)本24 h后，石蠟包埋。一抗工作濃度為1∶250，4 ℃過夜。二抗為熒光素標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)，中性樹膠封片。磷酸緩沖鹽溶液(PBS)代替一抗做陰性對照。使用Trizol提取組織RNA(步驟按照產(chǎn)品說明書)，運用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒使RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，應(yīng)用SYBRGreen和實時定量熒光PCR(Real-time PCR)檢測儀檢測Piezo2的mRNA水平。引物如下，β-actin：上游5′-TGT TAC CAA CTG GGA CGA CA-3′，下游5′-CTG GGT CAT CTT TTC ACG GT-3′；Piezo2：上游5′-GTG GTA TGC AAC CCA GTA CCC-3′，下游5′-GGC CAT TCT CTA TGG GCA GG-3′；Epac1：上游5′-GTG TTG GTG AAG GTC AAT TCT G-3′，下游5′-CCA CAC CAC GGG CAT C-3′。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理采用R2.11.1軟件，使用t檢驗和Pearson相關(guān)性檢驗方法進(jìn)行統(tǒng)計分析，檢驗水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1人Piezo2蛋白基本理化性質(zhì)預(yù)測通過Protparam預(yù)測Piezo1蛋白基本理化性質(zhì)，推測蛋白分子式為C14539H22436N3662O4087S130，相對分子質(zhì)量為318.092×103，等電點pI=5.82，波長280 nm時摩爾消光系數(shù)為505 380，半衰期為30 h，平均疏水性系數(shù)為-0.086，脂肪系數(shù)93.51。不穩(wěn)定參數(shù)為50.26，屬不穩(wěn)定蛋白。Piezo1蛋白所含氨基酸殘基數(shù)為2 752，其中堿性殘基數(shù)目為300，酸性殘基數(shù)為343。所含氨基酸組成為：氨基酸Ala(5.3%)、Arg(4.6%)、Asn(3.3%)、Asp(4.1%)、Cys(1.8%)、Gln(3.6%)、Glu(8.3%)、Gly(4.7%)、His(2.0%)、Ile(7.4%)、Leu(10.7%)、Lys(6.3%)、Met(2.9%)、Phe(6.0%)、Pro(4.0)、Ser(7.7%)、Thr(4.9%)、Trp(2.2%)、Tyr(4.1%)、Val(6.1%)，含Leu和Glu最多，不含Pyl和Sec。

2.2人Piezo2蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位及翻譯后修飾位點分析利用在線系統(tǒng)TMHMM Serve 2.0對Piezo2蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析，結(jié)果見圖1。人Piezo2蛋白存在35個跨膜結(jié)構(gòu)域，編號位置分別為10-41、62-84、122-144、214-236、241-260、267-289、504-526、539-561、581-598、678-700、704-726、733-755、787-809、932-954、959-976、981-1003、1052-1074、1113-1135、1139-1156、1169-1191、1217-1239、1291-1310、1314-1336、1349-1371、1909-1931、1936-1955、1965-1987、2189-2211、2231-2253、2260-2282、2292-2314、2327-2344、2359-2378、2399-2421、2660-2682。使用ProtComp Version 9.0在線工具分析Piezo2蛋白亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示存在于細(xì)胞膜、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等生物膜結(jié)構(gòu)中。使用MotifyScan進(jìn)行翻譯后修飾位點分析，預(yù)測人Piezo2蛋白理論上存在4個酰胺化位點(382-385、1529-1532、2062-2065、2139-2142)，16個N-糖基化位點(95-98、765-768、1009-1012、1013-1016、1020-1023、1030-1033、1085-1088、1713-1716、2114-2117、2125-2128、2525-2528、2539-2542、2559-2562、2572-2575、2622-2625、2634-2637)，8個cAMP-和cGMP-依賴性蛋白激酶磷酸化位點(384-387、1048-1051、1601-1604、1613-1616、1632-1635、2064-2067、2096-2099、2284-2287)，32個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(97-100、155-158、366-369、405-408、477-480、783-786、823-826、838-841、886-889、896-899、954-957、1203-1206、1284-1287、1515-1518、1556-1559、1604-1607、1718-1721、1722-1725、1767-1770、1782-1785、1795-1798、1810-1813、1819-1822、1844-1847、1857-1860、1861-1864、1879-1882、2054-2057、2086-2089、2101-2104、2223-2226、2495-2498)，19個豆蔻?；稽c(113-118、128-133、216-221、414-419、620-625、761-766、1046-1051、1106-1111、1123-1128、1201-1206、1695-1700、1728-1733、1763-1768、1800-1805、2119-2124、2320-2325、2501-2506、2672-2677、2691-2696)，31個蛋白激酶C磷酸化位點(56-58、102-104、110-112、195-197、321-323、459-461、483-485、871-873、954-956、1004-1006、1310-1312、1358-1360、1390-1392、1604-1606、1863-1865、1897-1899、1961-1963、2070-2072、2106-2108、2113-2115、2116-2118、2122-2124、2127-2129、2135-2137、2160-2162、2282-2284、2384-2386、2550-2552、2561-2563、2576-2578、2623-2625)，2個酪氨酸激酶磷酸化位點(1790-1797、2382-2388)。

圖1　Piezo2蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析

A：預(yù)測模型1；B：預(yù)測模型2；C：預(yù)測模型3。

圖2人Piezo2蛋白三級結(jié)構(gòu)

2.3人Piezo2蛋白二級、三級結(jié)構(gòu)及功能預(yù)測SOPMA在線程序分析結(jié)果顯示，人Piezo2蛋白含2 752個氨基酸，其中1 301個(47.27%)氨基酸可能形成α螺旋，537個(19.51%)氨基酸形成延伸鏈，204個(7.41%)氨基酸形成β轉(zhuǎn)角，710個(25.80%)氨基酸形成無規(guī)則卷曲。通過SWISS-MODEL服務(wù)器生成三維模型，在PyMOL Version 1.7.4中進(jìn)行結(jié)構(gòu)編輯，生成人Piezo2蛋白三維模型如圖2。

2.4Piezo2蛋白在腸道中的表達(dá)Piezo2表達(dá)于上皮與腸神經(jīng)系統(tǒng)，Piezo2蛋白在小鼠結(jié)腸組織中表達(dá)見圖3。

2.5Piezo2蛋白在小鼠腸道表達(dá)差異Real-time PCR檢測小鼠不同腸段Piezo2與Epac1 mRNA表達(dá)情況，結(jié)腸Piezo2及Epac1表達(dá)較小腸豐富(P<0.01)，見圖4A、B；結(jié)腸Piezo2與Epac1在mRNA水平表達(dá)呈正相關(guān)(r2=0.65，P<0.01)，而在小腸未檢測出相關(guān)性，見圖4C、D。

圖3　Piezo2蛋白在結(jié)腸中的表達(dá)(SABC，×400)

A：不同腸段Piezo2表達(dá)；B：不同腸段Epac1表達(dá)；C：小腸Piezo2與Epac1表達(dá)；D：結(jié)腸Piezo2與Epac1表達(dá)。

圖4不同腸段Piezo2與Epac1 mRNA表達(dá)情況

3討論

Piezo2是重要的機(jī)械敏感離子通道蛋白，在機(jī)械刺激感知中有重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，Piezo2表達(dá)于初級傳入神經(jīng)(三叉神經(jīng)節(jié)、背根神經(jīng)節(jié))，參與其機(jī)械信號感知，在背根神經(jīng)節(jié)中干擾Piezo2表達(dá)可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的感覺閾值[6-9]。Piezo2在梅克爾細(xì)胞中表達(dá)，在皮膚感受觸覺中有重要作用[10-12]。此外，Piezo2在DRG中與傷害感受器共表達(dá)，提示了感受機(jī)械傷害性刺激的重要分子機(jī)制[13]。Piezo2的突變與神經(jīng)肌肉功能異常的疾病相關(guān)，在遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)攣縮、戈登綜合征及馬丹沃克綜合征中發(fā)現(xiàn)了Piezo2的突變，提示Piezo2在調(diào)節(jié)神經(jīng)及運動功能中有重要作用[14-15]。

本文運用生物信息學(xué)工具預(yù)測Piezo2蛋白理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)及相關(guān)功能。Piezo2具有超過2 500氨基酸殘基，是多次穿膜的大分子蛋白。其中α螺旋(47.27%)比例較大，有利于穿膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，無規(guī)則卷曲(25.80%)存在一定比例，并可能成為蛋白質(zhì)功能調(diào)節(jié)和修飾位點的存在位置。翻譯后修飾位點預(yù)測發(fā)現(xiàn)，在Piezo2蛋白中，具備多個重要修飾位點，其修飾位點功能的研究有待于進(jìn)一步研究。本研究通過實驗室方法證實，Piezo2在腸神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，結(jié)腸水平表達(dá)較回腸豐富，且表達(dá)在結(jié)腸與Epac1相關(guān)。腸神經(jīng)系統(tǒng)有“腸腦”之稱，在腸道感知腸腔刺激、調(diào)節(jié)腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)腸道動力等過程中有重要作用。Piezo2可能在腸道感知機(jī)械刺激中有重要功能，Epac1通路同樣可能參與Piezo2功能調(diào)控[8,16]。

參考文獻(xiàn)

[1]Coste B,Mathur J,Schmidt M,et al.Piezo1 and Piezo2 are essential components of distinct mechanically activated cation channels[J].Science,2010,330(60):55-60.

[2]Gasteiger E,Hoogland C,Gattiker A,et al.Protein identification and analysis tools on the exPASy server[M].New York：Humana Press,2005:571-607.

[3]Ikeda M,Arai M,Lao DM,et al.Transmembrane topology prediction methods:a re-assessment and improvement by a consensus method using a dataset of experimentally-characterized transmembrane topologies[J].In Silico Biol,2002,2(1):19-33.

[4]Geourjon C,Deléage G.SOPMA:significant improvements in protein secondary structure prediction by consensus prediction from multiple alignments[J].Comput Appl Biosci,1995,11(6):681-684.

[5]Arnold K,Bordoli L,Kopp J,et al.The Swiss-Model workspace:a web-based environment for protein structure homology modelling[J].Bioinformatics,2006,22(2):195-201.

[6]Bron R,Wood RJ,Brock JA,et al.Piezo2 expression in corneal afferent neurons[J].J Comp Neurol,2014,522(13):2967-2979.

[7]Schneider ER,Mastrotto M,Laursen WJ,et al.Neuronal mechanism for acute mechanosensitivity in tactile-foraging waterfowl[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2014,111(41):14941-14946.

[8]Eijkelkamp N,Linley JE,Torres JM,et al.A role for Piezo2 in EPAC1-dependent mechanical allodynia[J].Nat Commun,2013,4:1682.

[9]Lou S,Duan B,Vong L,et al.Runx1 controls terminal morphology and mechanosensitivity of VGLUT3-expressing C-mechanoreceptors[J].J Neurosci,2013,33(3):870-882.

[10]Woo SH,Ranade S,Weyer AD,et al.Piezo2 is required for Merkel-cell mechanotransduction[J].Nature,2014,509(752):622-626.

[11]Maksimovic S,Nakatani M,Baba Y,et al.Epidermal merkel cells are mechanosensory cells that tune mammalian touch receptors[J].Nature,2014,509(752):617-621.

[12]Ikeda R,Gu JG.Piezo2 Channel conductance and localization domains in Merkel cells of rat whisker hair follicles[J].Neurosci Lett,2014,583:210-215.

[13]Dubin AE,Schmidt M,Mathur J,et al.Inflammatory signals enhance piezo2-mediated mechanosensitive currents[J].Cell Rep,2012,2(3):511-517.

[14]Coste B,Houge G,Murray MF,et al.Gain-of-function mutations in the mechanically activated ion channel PIEZO2 cause a subtype of distal arthrogryposis[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2013,110(12):4667-4672.

[15]Mcmillin MJ,Beck AE,Chong JX,et al.Mutations in PIEZO2 cause Gordon syndrome,Marden-Walker syndrome,and distal arthrogryposis type 5[J].Am J Hum Genet,2014,94(5):734-744.

[16]Laurent AC,Breckler M,Berthouze M,et al.Role of Epac in brain and heart[J].Biochem Soc Trans,2012,40(1):51-57.

doi:·論著·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.15.004

*基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(81200271)。

作者簡介：白濤(1989-)，在讀博士，主要從事胃腸功能性疾病研究?！魍ㄓ嵶髡?，E-mail：song111jun@126.com。

[中圖分類號]R574.6

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)15-2040-03

(收稿日期：2015-11-14修回日期：2016-01-08)

Bioinformatics analysis of Piezo2 and its expression detection in the gut*

Bai Tao，Qian Wei，Wang Huan，Zhang Lei，Song Jun△，Hou Xiaohua

(DepartmentofGastroenterology,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan,Hubei430022,China)

[Abstract]ObjectiveTo predict and analysis the physical and chemical properties as well as the structure and function of Piezo2,and to detect the expression of Piezo2 in gut.MethodsPhysical and chemical properties of Piezo2 were predicted with Protparam.Transmembrane domain was predicted with TMHMM Serve 2.0.Subcellular location was analyzed with ProtComp Version 9.0.Protein secondary structure was predicted with SOPMA program.Three-dimensional model was created with SWISS-MODEL.Location of Piezo2 in intestine was analyzed with immunohistochemical staining and RT-PCR was performed to compare the expression in different segment of intestine and correlation to Epac1.ResultsMolecular formula of Piezo2 was C14539H22436N3662O4087S130with molecular weight of 318.092×103 and isoelectric point of 5.82.Piezo2 had 35 transmembrane domains and many post-translational modification sites.Piezo2 existed in intestinal epithilial tissue and ganglion cells.Expression of Piezo2 in colon was much more abundant than that in small intestine(P<0.01) and positive correlated to Epac1 (r2=0.65，P<0.01).ConclusionColon is rich in Piezo2.Piezo2 might play a key role in function regulation of intestinal epithelium and enteric nervous system by Epac1 pathway.

[Key words]enteric nervous system；intestinal mucosa；mechanically gated ion channels;Piezo2