魏　英，王鈺瑩，余麗梅△，方　寧，姚觀平

(1.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院貴州省細胞工程重點實驗室，貴州遵義 563003；2.湖北醫(yī)藥學院附屬東風醫(yī)院實驗中心，湖北十堰 442000 )

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加味四物湯動員心肌梗死小鼠骨髓干細胞改善心室重構(gòu)*

魏英1,2，王鈺瑩1，余麗梅1△，方寧1，姚觀平1

(1.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院貴州省細胞工程重點實驗室，貴州遵義 563003；2.湖北醫(yī)藥學院附屬東風醫(yī)院實驗中心，湖北十堰 442000 )

[摘要]目的觀察加味四物湯 (mSWT) 對心肌梗死 (MI)小鼠骨髓干細胞動員的影響，探討mSWT改善心室重構(gòu)的機制。方法結(jié)扎冠狀動脈前降支建立小鼠MI模型，灌胃給予mSWT，小鼠被分為4組：假手術(shù)對照組，MI模型組，mSWT低劑量(5 g·kg-1·d-1)組和mSWT高劑量(10 g·kg-1·d-1)組，每組10只。行心肌組織病理學檢查，流式細胞術(shù)分析造血干細胞 (HSCs)和間充質(zhì)干細胞 (MSCs)占骨髓和外周血細胞的百分比。結(jié)果 mSWT 高、低劑量組治療14 d后，較MI模型組小鼠左心室壁較厚，MI面積減小，梗死區(qū)域可見大量島狀分布的心肌細胞，心室重構(gòu)明顯改善。且小鼠骨髓和外周血中HSCs及MSCs細胞百分比明顯增加(P<0.05)。結(jié)論mSWT可能通過促進MI小鼠骨髓HSCs和MSCs的增殖和向外周動員，參與改善MI后的心室重構(gòu)。

[關(guān)鍵詞]心肌梗死；骨髓干細胞；加味四物湯；心室重構(gòu)

心肌梗死(myocardial infarction,MI)發(fā)生后，一定數(shù)量的骨髓干細胞能夠遷移到受損的心肌組織中，生成心肌細胞和新生血管[1]；但因干細胞數(shù)量有限，難以形成足夠的心肌組織和新生血管，取而代之形成瘢痕，導致心室重構(gòu)。較多的研究表明，采用粒細胞集落刺激因子等造血干細胞(hematopoietic stem cells,HSCs)動員劑治療MI，取得了一定的療效[2]。加味四物湯 (modified Siwutang,mSWT)是根據(jù)四物湯改劑而成，由當歸、川芎、白芍、熟地加人參等中藥制成。四物湯是臨床常用的補血方，是調(diào)節(jié)血管活性的物質(zhì)，用于治療血虛證等[3]。藥理學研究發(fā)現(xiàn)，四物湯及其組方中的多味中藥可促進血虛癥小鼠骨髓細胞增殖，增加血液有形成分，加強心臟收縮性能，提高心臟泵血功能[4-5]。本文主要探究了mSWT通過影響MI小鼠骨髓和外周血HSCs和間充質(zhì)干細胞 (mesenchymal stem cells,MSCs) 而改善心室重構(gòu)的重要藥理學作用。

1材料與方法

1.1材料mSWT的組方生藥材購于遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院中藥房，由遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院藥劑科楊建文副主任藥師鑒定。生藥材按比例配制，加入水浸泡后，加熱回流提取，減壓濃縮成含生藥量1 g/mL 的 mSWT濃縮液，分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆?，使用時配制成所需濃度。

1.2方法

1.2.1動物分組與處理雄性昆明種 (KM)小鼠，清潔級，體質(zhì)量25～30 g，40只。由第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院實驗動物中心提供 (許可證號：SCXK20080001)。小鼠被分為4組，每組10只，假手術(shù)組(對照組)，MI模型組 (模型組)，mSWT低劑量組(mSWT-L組,5 g·kg-1·d-1)和mSWT高劑量組 (mSWT-H組,10 g·kg-1·d-1)。采用改良的氣管插管法進行氣管插管后[6]，結(jié)扎左冠狀動脈前降支制備MI模型。術(shù)后第1天開始灌胃給藥，對照組和模型組給予同等體積的蒸餾水，連續(xù)14 d。

1.2.2心臟組織病理學檢查開胸后，取小鼠心臟，在結(jié)扎點以下，留取近心尖部分， 4%多聚甲醛固定、脫水，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色，顯微鏡下觀察組織形態(tài)學變化。

1.2.3流式細胞術(shù)分析末次給藥2 h后麻醉小鼠，摘除眼球取外周血(PB)于EDTA 2K+抗凝管；另取雙側(cè)股骨，0.5 mL生理鹽水反復沖洗，收集骨髓腔細胞。骨髓(BM)和外周血細胞加入PE標記的抗小鼠CD3、CD4、CD8a、T119、Gr1、CD11b、CD166和CD105單抗，抗小鼠CD44-FITC、Sca-1-Percp抗體及其同型對照孵育、裂解紅細胞和洗滌、固定等，BD FACS Caliber流式細胞儀檢測分析HSCs和MSCs百分比。

2結(jié)果

2.1mSWT改善心肌組織病理學變化小鼠心臟組織HE染色，鏡下見對照組左心室壁較厚，心肌排列整齊，染色均勻，無梗死灶和纖維化組織。模型組左心室壁明顯變薄，尤其心尖處明顯，梗死區(qū)少見心肌細胞，心肌細胞溶解壞死、炎性細胞浸潤及纖維素樣變明顯。與模型組比較，mSWT-L和mSWT-H組，左心室壁較厚，MI面積明顯較小，梗死區(qū)可見大量島狀分布的心肌細胞，心室重構(gòu)改善明顯，見圖1。

A:小鼠左心室組織HE染色(×50)；B：小鼠左心室組織HE染色(×200)。

圖1MI小鼠左心室組織病理學的變化

A：CD117+Sca-1+,所有細胞均為CD3-、CD4-、CD8a-、Tr199-、Gr-、CD11b-；B：HSCs在BM中的表達；C：HSCs在PB中的表達。*：P<0.05,**：P<0.01，與模型組比較。

圖2mSWT上調(diào)MI小鼠BM和PB中HSCs百分率

A：CD166+CD155+CD44+,所有細胞均為Sca-1-；B：MSCs在BM中的表達；C：MSCs在PB中的表達。*：P<0.01,與對照組比較;**：P<0.01，與模型組比較。

圖3mSWT上調(diào)MI小鼠BM和PB中MSCs百分率

2.2mSWT上調(diào)MI小鼠BM和PB中HSCs和MSCs百分率小鼠HSCs表達Lin-Sca-1+c-kit+為特征，MSCs缺乏特異性標志，可以CD166+CD155+CDCD44+Sca-1-等聯(lián)合標記為其表面標志。MI小鼠給予mSWT治療14 d，與對照組相比，模型組BM及PB細胞中HSCs細胞比例有所增加，但差異無統(tǒng)計學意義 (P>0.05)；與模型組相比，mSWT-H組BM和PB中HSCs細胞比例均顯著增加 (P<0.05)，見圖2。同時，與對照組相比，模型組BM與PB中MSCs比例也顯著增加(P<0.01)；與模型組比較，mSWT-L組PB中MSCs比例顯著增加 (P<0.01)，而mSWT-H組BM與PB中MSCs比例均顯著增加 (P<0.01)，見圖3。

3討論

生理狀態(tài)下，BM中HSCs和MSCs數(shù)量遠高于PB循環(huán)中數(shù)量，然而心肌缺血可刺激BM釋放HSCs等進入外周血，并可歸巢到缺血梗死區(qū)[7]，一定限度地參與損傷心肌組織的修復，但遠不能滿足需要。為此，研究者們不斷嘗試，使用干細胞動員劑粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、干細胞因子 (SCF)等藥物干預，增加和動員BM干細胞，達到有效的心肌損傷修復。然而，有研究者發(fā)現(xiàn)，在不恰當?shù)臅r機使用G-CSF后，可加重MI的炎性反應和臨床癥狀，也可引起血管成形術(shù)后再狹窄發(fā)生率的增高[8]。因而積極尋找更優(yōu)的MI治療干細胞動員劑具有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)mSWT治療后，MI小鼠心室壁明顯較模型組厚，MI面積縮小，梗死區(qū)存在大量心肌細胞，纖維素樣變明顯較少，表明mSWT可明顯改善MI小鼠的心室重構(gòu)。業(yè)已證明，MI后有少量BM干細胞動員到外周，并遷移、定植到MI區(qū)域[9]。進一步研究結(jié)果顯示，mSWT-H治療組小鼠BM和PB中HSCs百分率明顯高于模型組，且mSWT 2個劑量組小鼠BM和PB中MSCs均明顯高于模型組，提示BM中HSCs和MSCs增殖顯著提高，并明顯增加BM干細胞動員，向PB或梗死心肌區(qū)域的遷移。大量研究認為，HSCs和MSCs可通過多種機制，促進心肌損傷的修復，改善梗死心肌組織的病理結(jié)構(gòu)，明顯提高心臟功能[9]。以往的研究也報道四物湯可治療實驗性急性溶血性貧血，不同程度地增加紅細胞、血紅蛋白和網(wǎng)織紅細胞等血液有形成[10]；能促進CO60γ照射和注射環(huán)磷酰胺誘導的BM抑制小鼠血象改善，提高HSCs數(shù)量及粒細胞巨噬細胞集落形成單位和紅系集落形成單位生成，且能促進BM細胞由G0/G1期進入S期，促進BM細胞增殖，并抑制BM細胞凋亡，改善BM造血微環(huán)境等[11-12]。mSWT中增加的中藥人參，富含人參皂苷Rg1，也能促進臍帶血HSCs增殖，增加環(huán)磷酰胺誘導小鼠BM和PB中HSCs、MSCs等數(shù)量，明顯改善骨髓抑制小鼠造血功能[13]。由此可見，mSWT 通過促進BM干細胞的增殖或動員，提高PB中干細胞比例，并可移行到MI梗死區(qū)，可能通過血管新生、分化為心肌細胞或發(fā)揮旁分泌作用等作用，參與MI的修復。

總之，積極探索mSWT等骨髓干細胞動員劑，促進MI后心臟功能恢復，改善MI病理組織學，改善心室重構(gòu)，是值得進一步探索的MI治療新策略。

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doi:·論著·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.15.002

*基金項目：貴州省科技計劃(黔科合S字[2007]1029)；遵醫(yī)(2006)034博士啟動基金。

作者簡介:魏英(1980-)，碩士，主治醫(yī)師，主要從事心血管藥理研究?！魍ㄓ嵶髡?， E-mail：ylm720@sina.com。

[中圖分類號]R956.2

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)15-2032-04

(收稿日期：2015-11-14修回日期：2016-01-18)

Modified Siwu decoction for mobilizing bone marrow stem cell to improve ventricular remodeling in mice myocardial infarction*

Wei Ying1,2,Wang Yuying1,Yu Limei1△,Fang Ning1,Yao Guanping1

(1.KeyLaboratoryofCellEngineeringofGuizhouProvince,AffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi,Guizhou563003,China;2.DepartmentofMedicineExperimentCenter,AffiliatedDongfengHospital,HubeiUniversityofMedicine,Shiyan,Hubei442000,China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the effects of modified Siwu decotion(mSWT) on bone marrow stem cell mobilization，and to investigate the mechanisms of mSWT for improving ventricular remodeling.MethodsThe mouse myocardial infarction (MI) model was set up by ligating the anterior descending coronary artery.Mice were intragastrically administrated with mSWT.The mice were randomly divided into 4 groups:sham operation control group,MI model group,mSWT low dose(5 g·kg-1·d-1) group and mSWT high dose(10 g·kg-1·d-1) group,10 cases in each group.The myocardial tissue pathological examination was performed.The proportion of hematopoietic stem cells (HSCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) to bone marrow and peripheral blood cells were analyzed by flow cytometry.ResultsAfter 14 d treatment by 5,10 g·kg-1·d-1mSWT,the left ventricular wall was thickened compared with the model MI mice,the myocardial infarction area was decreased,large number of survival mycardial cells as island type distribution could be found in the infarction area,and the ventricular remodeling was significantly improved,moreover the percentages of HSCs and MSCs cells in bone marrow and peripheral blood were significantly increased (P<0.05).ConclusionmSWT might promote MI mouse bone marrow HSCs and MSCs proliferation and mobilization to periphery to participate in the ventricular modeling after improving the myocardial infarction.

[Key words]myocardial infarction;bone marrow stem cell;modified Siwu decoction;ventricular remodeling