何笑云，歐春麟，肖艷華，周素嫻*

(1. 桂林醫(yī)學(xué)院 附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣西 桂林 541001；2. 中南大學(xué) 腫瘤研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410078)

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LY333531對(duì)高糖高脂下系膜細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)的影響

何笑云1，歐春麟2，肖艷華1，周素嫻1*

(1. 桂林醫(yī)學(xué)院 附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣西 桂林 541001；2. 中南大學(xué) 腫瘤研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410078)

摘要:探討PKCβ抑制劑(LY333531)對(duì)高糖高脂環(huán)境下系膜細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的影響，單獨(dú)培養(yǎng)人腎小球系膜細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、LY333531組、高糖高脂組、高糖高脂+LY333531組.首先采用qRT-PCR檢測(cè)PKCβI的表達(dá)，然后通過ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液Col IV、Fn的含量.結(jié)果顯示，高糖高脂組相較于對(duì)照組，PKCβI mRNA的表達(dá)水平明顯增加(P <0.05)，LY333531可以明顯抑制PKCβI的表達(dá)(P <0.05)；高糖高脂組相較于對(duì)照組，細(xì)胞上清液Col IV、Fn含量明顯增加(P <0.05)，而這種作用可被LY333531所抑制(P <0.05).表明高糖高脂可通過促進(jìn)系膜細(xì)胞PKCβI表達(dá)從而誘導(dǎo)ECM的分泌，增加腎纖維化發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，而LY333531可明顯抑制這種作用.

關(guān)鍵詞:高糖高脂；系膜細(xì)胞；PKCβI；細(xì)胞外基質(zhì)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，簡(jiǎn)稱DN)是導(dǎo)致糖尿病患者終末期腎衰竭的主要原因，其臨床發(fā)病率占糖尿病(diabetes mellitus, 簡(jiǎn)稱DM)患者的20%～40%[1]，常具有進(jìn)行性腎間質(zhì)纖維化的特征.前期研究發(fā)現(xiàn)，高糖高脂與DN的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]，高糖高脂可以對(duì)腎小球系膜細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, 簡(jiǎn)稱ECM )產(chǎn)生影響[3].PKCβI是蛋白激酶C (protein kinase C, 簡(jiǎn)稱PKC) 家族中的一個(gè)亞型，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、血管生成等多種信號(hào)傳導(dǎo)過程[4].近年來的研究發(fā)現(xiàn)，PKC在DN的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[5-6]，大量研究表明糖尿病腎臟PKC被異?；罨?，PKCβI活性明顯增加, 并與纖維連接蛋白(fibronectin, 簡(jiǎn)稱Fn)、Ⅳ型膠原(collagen Ⅳ, Col Ⅳ)等細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, 簡(jiǎn)稱ECM)蛋白增加相關(guān)[7-8].然而，在DN發(fā)生過程中，高糖高脂與PKCβI的關(guān)系尚未見報(bào)道.因此，筆者通過探討高糖高脂環(huán)境與ECM及PKCβI三者的關(guān)系，進(jìn)一步揭示DN的發(fā)病機(jī)制.

1材料和方法

1.1材料

胎牛血清(fetal bovine serum, 簡(jiǎn)稱FBS)(批號(hào): 10099-141；規(guī)格：500 mL)購(gòu)買于Gibco公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(reverse transcription system) (批號(hào): A3500；規(guī)格：100次)購(gòu)于 Promega公司；SYBR?Premix Ex TaqTMII (批號(hào): RR820A；規(guī)格：200次)購(gòu)于TaKaRa公司；D-葡萄糖(D-glucose, 簡(jiǎn)稱D-GS) (批號(hào): 0219402483；規(guī)格：250 g)購(gòu)于Biomol公司、溶血卵磷脂(lysophosphatidylcholine, 簡(jiǎn)稱LPC)(批號(hào): 38-0101-7；規(guī)格：25 mg)購(gòu)于Sigma公司；PKCβ抑制劑 (LY333531) (批號(hào): ALX-270-348-M001；規(guī)格：1 mg)購(gòu)于Alexis公司；Col IV(批號(hào): F2742-A；規(guī)格：96T)和Fn(批號(hào): F15612-A；規(guī)格：96T)的ELISA試劑盒購(gòu)于晶美生物公司.

LPC的配制：稱取LPC 5 mg溶于50 mL DMEM低糖培養(yǎng)液中(平均功率20 W，超聲溶解0.5 h)，配制成濃度為100 mg·L-1的母液，以0.22 μm混合纖維素微孔濾膜正壓過濾除菌后-20 ℃保存?zhèn)溆?實(shí)驗(yàn)時(shí)以4 mL母液加入20 mL的DMEM(低糖型)培養(yǎng)基中，配制成濃度為20 mg·L-1的工作液.

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組

人腎小球系膜細(xì)胞(human mesangial cells，簡(jiǎn)稱HMCs)由東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院饋贈(zèng)[2-3]，所用培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，細(xì)胞保持在37 ℃含有5%CO2的潮濕環(huán)境中.實(shí)驗(yàn)過程共分為4組：①對(duì)照組(5.5 mM D-GS)[3, 9]；②LY333531組(2×10-7M LY333531)；③高糖高脂組(30 mM D-GS + 20 mg·L-1LPC)；④高糖高脂+ LY333531組(30 mM D-GS+20 mg·L-1LPC+2×10-7M LY333531).

1.2.2ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清中Col IV和Fn的含量

收集細(xì)胞上清液，參照ELISA試劑盒說明書分別測(cè)定各組IV型膠原(Col IV )與纖維連接蛋白(Fn)的含量，各組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔.

1.2.3qRT-PCR檢測(cè)PKCβI mRNA表達(dá)水平

采用TRIzol法提取各組細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè).引物序列如下：Human PKCβI mRNA的正向引物為5’- GGGGGCGACCTCATGTAT -3’，反向引物為5’- GCAATTTCTGCAGCGTAAAA -3’；Human GAPDH mRNA的正向引物為5’- ACACCCACTCCTCCACCTTT -3’，反向引物為5’- TTACTCCTTGGAGGCCATGT-3’，引物根據(jù)GenBank序列，用軟件Primer Premier 5.0 和 Oligo 6.22 設(shè)計(jì)，由華大基因生物科技有限公司合成.PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 5 min，隨后為95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s重復(fù)40個(gè)循環(huán)，所有步驟均重復(fù)3次.采用2-△△Ct法分析目的基因的相對(duì)表達(dá)量.

1.2.4統(tǒng)計(jì)方法

2結(jié)果

2.1高脂高糖環(huán)境對(duì)系膜細(xì)胞PKCβI mRNA表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，高糖高脂組系膜細(xì)胞的PKCβI mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.05)，而高糖高脂+LY333531組相對(duì)于高糖高脂組系膜細(xì)胞的PKCβI mRNA表達(dá)水平明顯受到抑制(P<0.05)(表1和圖1).

表1　高糖高脂對(duì)系膜細(xì)胞PKCβI mRNA表達(dá)的影響

注：*P<0.05, 與對(duì)照組比較；#P<0.05，與高糖高脂組比較.

圖1　RT-PCR檢測(cè)PKCβI mRNA的表達(dá)Fig.1　Detection the level of PKCβI mRNA by RT-PCR

2.2高脂高糖環(huán)境下系膜細(xì)胞ECM的分泌

收集實(shí)驗(yàn)各組的細(xì)胞上清液進(jìn)行ELISA法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，高糖高脂組系膜細(xì)胞的細(xì)胞上清液Col IV、Fn含量均升高(P<0.05)(表2).

與高糖高脂組比較，高糖高脂+ LY333531組的細(xì)胞上清液Col IV、Fn含量明顯受到抑制(P<0.05)(表2).可見，LY333531可以抑制高糖高脂刺激引起的ECM相關(guān)因子的分泌.

表2　LY333531對(duì)高糖高脂下系膜細(xì)胞Col IV、Fn的影響

注：*P<0.05,與對(duì)照組比較；#P<0.05，與高糖高脂組比較.

3討論

近年來，隨著人們生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的變化, 糖尿病(DM)已成為嚴(yán)重威脅我國(guó)公共衛(wèi)生安全的主要問題[10].糖尿病腎病(DN)作為DM的微血管并發(fā)癥之一，與終末期腎臟病( end-stage renal disease，簡(jiǎn)稱ESRD) 存在密切聯(lián)系[11]，約36.39%的終末期腎衰竭患者與DN有關(guān)[12].DN的發(fā)生發(fā)展與多個(gè)病理改變相關(guān)，如細(xì)胞外基質(zhì)( ECM) 積聚、系膜區(qū)的擴(kuò)張和基底膜的增厚等[13].ECM 產(chǎn)生是DN發(fā)生的關(guān)鍵[14]，其中Col Ⅳ和Fn是構(gòu)成ECM 的重要成分，Col Ⅳ和Fn的過多沉積是誘發(fā)各種慢性腎臟疾病(如腎臟進(jìn)展性纖維化)的病理基礎(chǔ).糖、脂代謝紊亂與DN的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，這與高糖、高脂對(duì)腎臟固有細(xì)胞(如腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞( GEnC) 、腎小球系膜細(xì)胞、足細(xì)胞等)的影響有關(guān)[15].高糖高脂與系膜細(xì)胞ECM分泌密切相關(guān)[16].李宏光等[17]研究報(bào)道，高糖高脂飲食能夠促進(jìn)新西蘭兔(Oryctolagus cuniculus) 表達(dá)Col Ⅳ和Fn等分子，改變其腎小管、間質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，促進(jìn)腎小管間質(zhì)的纖維化；羅霞等[18]發(fā)現(xiàn)高糖高脂飲食加小劑量鏈脲佐菌素(streptozocin, 簡(jiǎn)稱STZ)誘導(dǎo)大鼠糖尿病模型中，與腎小球系膜基質(zhì)增生相關(guān)的指標(biāo)如Col Ⅳ和Fn等發(fā)生明顯改變.筆者的研究發(fā)現(xiàn)，高糖高脂組相對(duì)于正常對(duì)照組，能刺激系膜細(xì)胞Col IV、Fn蛋白的分泌(P<0.05)，增加系膜細(xì)胞纖維化的風(fēng)險(xiǎn)，這進(jìn)一步支持高糖高脂是DN的獨(dú)立危險(xiǎn)因素的觀念.

PKC是一類廣泛分布于哺乳動(dòng)物的各種組織細(xì)胞胞漿內(nèi)調(diào)控多條信號(hào)通路的絲/蘇氨酸蛋白激酶.近年來發(fā)現(xiàn)，PKC 信號(hào)通路激活可明顯影響血流動(dòng)力學(xué)和血管通透性，并能引起ECM沉積[19]，抑制 PKC的活性可以延緩或阻止 DN 的發(fā)生[20-22].PKCβⅠ/Ⅱ作為PKC的重要亞型，與DN患者的腎病病癥密切相關(guān).Meier 等[7]和Menne等[8]研究報(bào)道，敲除PKCβI基因后可明顯抑制高糖誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(Transforming growth factor-β1, 簡(jiǎn)稱TGF-β1)的表達(dá)從而減少ECM相關(guān)因子Col Ⅳ和Fn等的分泌，從而改善糖尿病腎病小鼠的腎臟體積增大及腎纖維化；此外，Soetikno等[23]發(fā)現(xiàn)高糖可誘導(dǎo)的STZ糖尿病大鼠模型PKCβI激活而導(dǎo)致血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子( vascular endothelial growth factor，簡(jiǎn)稱VEGF)的表達(dá)增加，引起腎小球毛細(xì)血管異常增殖，增加DN發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn). LY333531是一種PKC-β的特異性抑制劑, 目前已被美國(guó)FDA 批準(zhǔn)[24].雷少青等[20]研究發(fā)現(xiàn)，LY333531 可以明顯改善糖尿病心肌舒張功能；此外，Kelly等[21]研究表明，LY333531能通過抑制PKC的表達(dá)以改善STZ糖尿病腎病大鼠的蛋白尿及病理變化；Koya 等[22]發(fā)現(xiàn)LY333531能夠明顯緩解db /db 小鼠( 自發(fā)型2 型糖尿病小鼠模型)出現(xiàn)的腎小球系膜細(xì)胞擴(kuò)張、尿蛋白排泄率增加等病理變化.筆者研究發(fā)現(xiàn)，在高糖高脂的刺激下，系膜細(xì)胞PKCβI mRNA的表達(dá)較對(duì)照組顯著增高(P<0.05)，并且細(xì)胞上清液的Col IV、Fn含量也顯著增高(P<0.05).用LY333531處理后，可明顯降低高糖高脂刺激引起的人腎小球系膜細(xì)胞誘導(dǎo)的Col IV、Fn分泌(P<0.05).由此，可以推測(cè)高糖高脂刺激引起的系膜細(xì)胞ECM分泌可能通過PKCβI介導(dǎo).

綜上所述，高糖合并脂代謝紊亂的情況下，可通過PKCβI的介導(dǎo)作用促進(jìn)系膜細(xì)胞ECM相關(guān)因子(Col IV、Fn)的分泌，誘發(fā)腎小球的纖維化，增加DN發(fā)生的可能，而PKC-β抑制劑(LY333531)可明顯抑制高糖高脂引起的危險(xiǎn)因素.通過尋找適合人體的PKCβI抑制劑，可為DN的治療提供潛在的策略.

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(責(zé)任編輯于敏)

doi:10.3969/j.issn.1000-2162.2016.04.014

收稿日期：2015-09-01

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81260134,81560148);廣西科技廳青年基金資助項(xiàng)目(2011GXNSFB018108)

作者簡(jiǎn)介：何笑云(1990-)，女，湖南郴州人，桂林醫(yī)學(xué)院碩士研究生；*周素嫻(通信作者)，桂林醫(yī)學(xué)院主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，E-mail：zoe_doctor@163.com.

中圖分類號(hào)：R692.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1000-2162(2016)04-0087-05

Effect of LY333531 on the expression of extracellular matrix in mesangial cells exposed to high glucose and lysophosphatidylcholine

HE Xiaoyun1, OU Chunlin2, XIAO Yanhua1， ZHOU Suxian1*

(1. Department of Endocrinology, Affiliated Hospital, Guilin Medical University, Guilin 541001, China;2. Cancer Research Institute, Central South University, Changsha 410078, China)

Abstract:To investigate the effect of PKCβ inhibitor (LY333531) on extracellular matrix (ECM) of masangial cells in high glucose (HG) and lysophosphatidylcholine (LPC) environment, human mesangial cells (HMCs) were cultured alone and divided into 4 groups: control; LY333531; HG and LPC(HG+LPC); HG, LPC and LY333531(HG+LPC+LY333531). First, we used the method of quantitative real-time PCR(qRT-PCR) to detect the expression of PKCβI; then, the levels of collagen IV and fibronectin were detected by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA) in the supernatant. These results suggested that the mRNA expression of PKCβI in the group of HG+LPC was higher than the control group (P<0.05), and the effect could be obviously inhibited by LY333531 (P<0.05). Meanwhile, compared with the control group, the level of collagen IV and fibronectin in the supernatant was significantly increased in the group of HG+LPC (P <0.05), and the effect could be also inhibited by LY333531 notably (P<0.05). Therefore, we could conclude that the HG+LPC can aggrandize the secretion of ECM by increasing the expression of PKCβI in mesangial cells, which can increase the risk of renal fibrosis, however, LY333531 can weaken the effect obviously.

Keywords:high glucose and lysophosphatidylcholine; mesangial cells; protein kinase C βI (PKCβI); extracellular matrix (ECM)