古玉茹　劉穎翰　石栓柱　陳翛然　孔素花　溫占平　馮敬國

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·論著·

布魯氏菌病患者外周血樹突狀細(xì)胞、Th1/Th2細(xì)胞因子含量的檢測及意義

古玉茹劉穎翰石栓柱陳翛然孔素花溫占平馮敬國

075000河北省張家口市傳染病醫(yī)院傳染一科

【摘要】目的觀察布魯氏菌病患者外周血樹突狀細(xì)胞表型、Th1/Th2細(xì)胞含量的檢測及意義。方法選取診治的布魯氏菌病患者50例為病例組，另選取同期進(jìn)行健康體檢的正常人50例作為正常組。采用Real time-PCR測定2組Th1相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子T細(xì)胞表達(dá)的T盒(T-bet)、GATA 連接蛋白3(GATA-3)、維A酸相關(guān)核孤兒受體γt(RORγt)、叉頭蛋白3(Foxp3)及Th1/Th2細(xì)胞因子腫瘤壞死因子α(TNF-α)、干擾素γ(IFN-γ)、白介素6(IL-6)、白介素10(IL-10)mRNA含量。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)測定TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10蛋白表達(dá)及補(bǔ)體C3、C4含量。流式細(xì)胞術(shù)測定樹突狀細(xì)胞表型、Th1、Th2及T淋巴細(xì)胞亞群細(xì)胞細(xì)胞、NK細(xì)胞)含量。結(jié)果病例組外周血Th1細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子T-bet、RORγt、Foxp3及Th1細(xì)胞、Th1/Th2、TNF-α、IFN-γ含量較對照組顯著降低，Th2細(xì)胞及IL-6、IL-10含量較對照組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；病例組陽性的樹突狀細(xì)胞比例細(xì)胞、NK細(xì)胞及補(bǔ)體C3、C4含量較對照組顯著降低，細(xì)胞含量較對照組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；TNF-α、IFN-γ含量與細(xì)胞、NK細(xì)胞、C3、C4含量呈正相關(guān)性(r值分別為2.879、3.214、3.255和2.978，P<0.05)，與細(xì)胞含量呈負(fù)相關(guān)性(r值分別為-3.146和-3.011,P<0.05)。IL-6、IL-10含量與細(xì)胞、NK細(xì)胞、C3、C4含量呈負(fù)相關(guān)性(r值分別為-2.124、-2.343、-3.423、-2.789、-2.993、-2.566、-3.758，P<0.05)，與細(xì)胞含量呈正相關(guān)性(r值分別為3.465、3.129,P<0.05)。結(jié)論布魯氏菌病患者外周血成熟樹突狀細(xì)胞數(shù)目減少，同時(shí)Th1/Th2細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子失衡，且與機(jī)體天然免疫和細(xì)胞免疫功能降低有關(guān)，這可能在布魯氏菌病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

【關(guān)鍵詞】布魯氏菌??；樹突狀細(xì)胞；Th1/Th2細(xì)胞因子；天然免疫；細(xì)胞免疫

布魯氏菌病又稱波狀熱、地中海弛張熱，該病是通過不同方式接觸了感染布魯氏菌的牲畜分泌物、排泄物或吸入污染的空氣、塵埃而引起的傳染-變態(tài)反應(yīng)性人畜共患傳染病。布魯氏菌感染后可侵犯全身各器官和組織出現(xiàn)增生性炎性病變，患者主要表現(xiàn)為發(fā)熱、乏力、關(guān)節(jié)和肌肉疼痛等癥狀，若治療不及時(shí)病情易遷延不愈，遺留后遺癥，嚴(yán)重者甚至喪失勞動(dòng)力[1,2]。近年來，布魯氏菌病發(fā)病率有逐年上升趨勢，尤其好發(fā)于西部畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)，對患者生命健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展均產(chǎn)生嚴(yán)重影響。目前，布魯氏菌病的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，但已有研究表明免疫功能紊亂在該病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[3]。本研究通過檢測布魯氏菌病患者外周血樹突狀細(xì)胞表型、Th1/Th2細(xì)胞因子含量及與機(jī)體免疫功能的關(guān)系，旨在為闡明布魯氏菌病的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料選取2014年10月至2015年10月我院收治的布魯氏菌病患者50例(病例組)為研究對象，其中男42例，女8例；年齡15～69歲，平均年齡(45±7)歲，均符合國家衛(wèi)生部制定的《布魯氏菌病診斷標(biāo)準(zhǔn)》[3]：(1)有明確的流行病學(xué)接觸史；(2)有發(fā)熱、乏力、肝脾及淋巴結(jié)腫大、關(guān)節(jié)及肌肉疼痛等癥狀體征；(3)血清凝集實(shí)驗(yàn)檢測特異性抗體IgA(+)、IgG(+)。50例患者中農(nóng)牧民43例，其中38例有牧羊史或與牛、羊等牲畜接觸史；學(xué)生7例，其中5例經(jīng)常食用牛、羊肉，2例流行病學(xué)史不明顯。另選取同期于我院進(jìn)行健康體檢的正常人50例作為對照組，其中男38例，女12例；年齡20～68歲，平均年齡(43±7)歲。2組年齡、性別比等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2臨床癥狀50例患者表現(xiàn)為不同程度的發(fā)熱、乏力、頭痛、肌肉關(guān)節(jié)痛等，其中發(fā)熱45例(90.00%)，體溫37.1～38.0℃者8例(17.78%)，38.1～39.0℃者22例(48.89%)，39.1～41.0℃者15例(33.33%)；關(guān)節(jié)肌肉痛45例(90.00%)；肝脾腫大17例(34.00%)；睪丸腫大3例(6.00%)。

1.4檢測方法

1.4.1外周血單個(gè)核細(xì)胞的提取:用PBS稀釋EDTA抗凝全血，加入淋巴細(xì)胞分離液，400 g離心30 min，液體自上而下依次分為4層：血漿層、淋巴細(xì)胞單核細(xì)胞層、淋巴細(xì)胞分離液層、粒細(xì)胞紅細(xì)胞層。用吸管小心吸取淋巴細(xì)胞單核細(xì)胞層細(xì)胞，PBS充分洗滌，100 g離心10 min，棄上清。加入紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞，室溫避光孵育5 min，100 g離心5 min，棄上清。PBS充分洗滌后重懸細(xì)胞，即為外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。

1.4.2Real time-PCR:Trizol提取細(xì)胞總RNA，按照試劑盒說明書加樣進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，ABI 7300型熒光定量PCR儀擴(kuò)增。由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。用儀器自帶的分析軟件得到各樣本、各基因擴(kuò)增的Ct值，以β-actin為內(nèi)參照基因，目的基因表達(dá)相對值RQ=2ΔΔCt。見表1。

表1　Real time-PCR引物序列

1.4.4ELISA實(shí)驗(yàn):采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)測定血清TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10及補(bǔ)體C3、C4含量。試劑盒均購自南京建成生物工程技術(shù)研究所，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

2結(jié)果

2.12組轉(zhuǎn)錄因子T-bet、GATA-3、RORγt、Foxp3比較Real time-PCR結(jié)果顯示，病例組T-bet、RORγt、Foxp3 mRNA表達(dá)較對照組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而GATA-3 mRNA表達(dá)較對照組無明顯變化(P>0.05)。見表2。

組別T-betmRNAGATA-3mRNARORγtmRNAFoxp3mRNA對照組4.12±0.563.38±0.474.23±0.613.77±0.56病例組1.48±0.20*3.32±0.441.36±0.21*1.12±0.15*

注：與對照組比較,*P<0.05

表3　2組外周血樹突狀細(xì)胞表型比較　±s

注：與對照組比較,*P<0.05

2.32組外周血PBMC Th1、Th2含量比較流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，對照組Th1、Th2細(xì)胞含量分別為(9.0±1.2)和(7.3±1.0)，Th1/Th2為(1.22±0.19)；病例組Th1、Th2細(xì)胞含量分別為(3.8±0.6)和(10.4±1.5)，Th1/Th2為0.36±0.05，病例組Th1細(xì)胞含量及Th1/Th2較對照組顯著降低，Th2細(xì)胞含量較對照組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

組別Th1(%)Th2(%)Th1/Th2對照組9.0±1.27.3±1.01.22±0.19病例組3.8±0.6*10.4±1.5*0.36±0.05*

注：與對照組比較,*P<0.05

2.42組Th1/Th2細(xì)胞因子含量比較Real time-PCR和ELISA結(jié)果顯示，對照組和病例組TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10 mRNA含量分別為(1.77±0.23)、(1.36±0.20)、(0.87±0.11)、(0.94±0.15)和(0.46±0.07)、(0.34±0.05)、(1.79±0.25)、(1.92±0.31)，TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10蛋白含量分別為(18.2±2.7)pg/ml、(124±18)pg/ml、(46±7)pg/ml、(31±5)pg/ml和(5.4±0.8)pg/ml、(30±5)pg/ml、(104±16)pg/ml、(100±15)pg/ml，病例組TNF-α、IFN-γ mRNA和蛋白含量較對照組顯著降低，IL-6、IL-10 mRNA和蛋白含量較對照組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5、6。

組別TNF-αmRNAIFN-γmRNAIL-6mRNAIL-10mRNA對照組1.77±0.231.36±0.200.87±0.110.94±0.15病例組0.46±0.07*0.34±0.05*1.79±0.25*1.92±0.31*

注：與對照組比較,*P<0.05

組別TNF-α蛋白IFN-γ蛋白IL-6蛋白IL-10蛋白對照組18.2±2.7124±1846±731±5病例組5.4±0.8*30±5* 104±16* 100±15*

注：與對照組比較,*P<0.05

組別CD+4CD+8CD+4/CD+8NK對照組45±522.6±2.62.00±0.3424.2±2.7病例組30±3*30.2±3.4*1.00±0.15*12.5±2.0*

注：與對照組比較,*P<0.05

2.62組補(bǔ)體含量比較流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，對照組C3、C4含量分別為(1.28±0.20)g/L、(0.46±0.07)g/L，病例組C3、C4含量分別為(0.49±0.07)、(0.10±0.15)g/L，病例組C3、C4含量較對照組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表8。

組別C3C4對照組1.28±0.200.46±0.07病例組0.49±0.07*0.10±0.15*

注：與對照組比較,*P<0.05

表9　2組Th1/Th2細(xì)胞因子與機(jī)體免疫功能的關(guān)系

注：*P<0.05

3討論

綜上所述，布魯氏菌病患者外周血成熟樹突狀細(xì)胞數(shù)量減少，同時(shí)Th1細(xì)胞功能及相關(guān)細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ含量降低，Th2細(xì)胞功能及相關(guān)細(xì)胞因子IL-6、IL-10含量升高，提示T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答在機(jī)體抗布魯氏菌感染中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而在布魯氏菌病發(fā)生發(fā)展過程中機(jī)體存在免疫功能紊亂。在免疫調(diào)節(jié)治療中監(jiān)測患者細(xì)胞免疫應(yīng)答水平對于制定治療措施及評估患者預(yù)后具有重要指導(dǎo)價(jià)值。

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doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2016.14.004

【中圖分類號】R 576.7

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1002-7386(2016)14-2097-04

(收稿日期：2016-02-16)

The detection and significance of dendritic cells in peripheral blood and Th1/Th2 cytokine content in patients with brucellosis

GUYuru,LIUYinghan,SHIShuanzhu,etal.

TheFirstDepartmentofInfectiousDiseases,InfectiousDiseasesHospitalofZhangjiakouCity,Hebei,Zhangjiakou075000,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the detection and significance of dendritic cells (DC) in peripheral blood and Th1/Th2 cytokine content in patients with brucellosis.MethodsA total of 50 patients with brucellosis who were admitted and treated in our hospital from October 2014 to October 2015 were enrolled in the study (case group). Moreover the other 50 healthy subjects were served as control group. The expression levels of T-bet, GATA-3, RORγt, Foxp3, TNF-α, IFN-γ, IL-6, IL-10 at mRNA levels were detected by Real time-PCR. The expression levels of TNF-α, IFN-γ, IL-6, IL-10 at protein levels and contentsof complement C3 and C4 were measured by ELISA. The dendritic cells phenotype, Th1, Th2 and T cell subsets,the levels of T T cell and NK cell were detected by flow cytomertry.ResultsIn case group the levels of Th1cell-related transcription factors-T-bet,RORγt,Foxp3 and Th1cells,Th1/Th2,TNF-α, IFN-γ were significantly decreased,however,the levels of Th2 cells,IL-6,IL-10 were significantly increased ,as compared with those in control group (P<0.05).Moreover the levels of -positive DC proportion, T cells,NK cells and complement C3,C4 were were significantly decreased,but the levels of T cells were significantly increased ,as compared with those in control group (P<0.05).The levels of TNF-αand IFN-γwere positively correlated to those of T cells, NK cells, C3,C4 (r=2.879,3.214,3.255,2.978,respectively,P<0.05),however, which were negatively correlated to those of T cells (r=-3.146,-3.011,respectively,P<0.05). Moreover the levels of IL-6 and IL-10 were negatively correlated to those of T cells,NK cells,C3,C4 (r=-2.124,-2.343,-3.423,-2.789,-2.993,-2.566,-3.758,respectively,P<0.05), however, which were positively correlated to those of T cells (r=3.465, 3.129, respectively,P<0.05).ConclusionThe mature DC cell counts in peripheral blood of patients with brucellosis are decreased, at the same time, the Th1/Th2 cells and related cytokins are unbalanced,which may be correlated to the decrease of organism natural immunity and cellular immune function,thus,which may play an important role in the pathogenesis and development of brucellosis.

【Key words】brucellosis; dendritic cells; Th1/Th2 cytokines; natural immunity; cell immunity