江小蓉　王瑜　王莎莎

?

·論著·

胸苷激酶1與乳腺癌前病變惡性進(jìn)程之間的相關(guān)性研究

江小蓉王瑜王莎莎

362000福建省泉州市，中國人民解放軍第180醫(yī)院健康管理中心

【摘要】目的通過研究細(xì)胞動力學(xué)標(biāo)志物胸苷激酶1(TK1)與乳腺癌前病變進(jìn)程之間的相關(guān)性，評價其在癌前病變診斷準(zhǔn)確性和癌前疾病惡性進(jìn)展評估方面的應(yīng)用價值。方法采用TK1抗體對3 442例女性體檢者進(jìn)行血清TK1水平檢測，其中乳腺病變組1 205例，健康組2 237例，并對其中90位乳腺癌前病變患者進(jìn)行了長達(dá)3年的跟蹤，研究TK1細(xì)胞增殖分子與乳腺癌前病變進(jìn)程之間的相關(guān)性；并結(jié)合檢測對象病情的進(jìn)展情況，對TK1評估的準(zhǔn)確性進(jìn)行分析。結(jié)果健康組TK1平均水平與乳腺病變組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；同時，對比乳腺癌前病變的年齡分布，觀察到全年齡段乳腺癌前病變發(fā)生率與TK1無相關(guān)性(r=0.491,P>0.05)。30歲后二者有相關(guān)性(r=0.933,P<0.05)，乳腺癌前病變中重度導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤和非典型增生患者TK1水平高于單純增生(P<0.05)。當(dāng)TK1為1.4 pmol/L時區(qū)分乳腺良惡性病變的特異性為89.5%，靈敏度為71.1%。對90例癌前病變患者進(jìn)行6～36個月的跟蹤，癌前病變進(jìn)展組患者，TK1水平復(fù)檢時較初檢升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論TK1對于乳腺癌前病變患者惡性進(jìn)程風(fēng)險預(yù)測具有重要意義。

【關(guān)鍵詞】胸苷激酶1；乳腺；癌前病變；腫瘤；增殖

胸苷激酶1(TK1)檢測是今年來新興的細(xì)胞動力學(xué)檢測技術(shù)。TK1催化脫氧胸苷(deoxythymidine，dTdR) 成為脫氧胸苷酸(deoxythymidylic monophosphate，dTMP)進(jìn)而合成脫氧三磷酸胸苷酸(dTTP)參與DNA合成，是細(xì)胞周期S期(DNA合成期)的關(guān)鍵酶之一。因此TK1是一種公認(rèn)的細(xì)胞增殖標(biāo)志物。目前，其在腫瘤惡性增殖程度的輔助評估、腫瘤預(yù)后、腫瘤治療監(jiān)控、腫瘤患者復(fù)發(fā)風(fēng)險及生存率方面都有廣泛應(yīng)用。同時TK1組化抗體，也被用于腫瘤增殖動力學(xué)的病理檢測。相關(guān)基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用論文在國內(nèi)外均有發(fā)表[1-5]。國內(nèi)多家機(jī)構(gòu)也就TK1在體檢篩查中的應(yīng)用價值進(jìn)行過肯定，指出TK1是值得信賴的腫瘤風(fēng)險評估指標(biāo)[6-8]。文中列舉了TK1陽性與增殖類病變的密切相關(guān)性，但并未就病變的增殖程度與TK1水平之間的相關(guān)性進(jìn)一步分析。考慮到目前體檢中常規(guī)的影像和超聲技術(shù)，及細(xì)胞學(xué)檢查都存在著掃描范圍受限，精度較低的缺陷，更不可能在分子水平對細(xì)胞內(nèi)的增殖活性進(jìn)行評估，如果能夠進(jìn)一步驗(yàn)證TK1水平和癌前病變進(jìn)展之間的相關(guān)性，將肯定它對于惡性增殖疾病評估的價值，發(fā)揮它的潛力。本研究的主要對象為乳腺增殖類癌前病變。乳腺癌前病變的發(fā)病機(jī)制主要是源發(fā)于正常終末導(dǎo)管一小葉單位的上皮細(xì)胞，異常增生是由于一些生長調(diào)控機(jī)制改變導(dǎo)致的增生的失衡。參照2003年版WHO乳腺癌前病變診斷標(biāo)準(zhǔn)，乳腺癌前病變有：(1)重度導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤；(2)非典型性增生；(3)導(dǎo)管內(nèi)癌(DCIS，低級Ⅰ級，中級Ⅱ級，高級Ⅲ級。不典型增生癌前病變觸診常常難以發(fā)現(xiàn)，影像學(xué)改變常常既不典型也沒有特異性。對大部分癌前病變的診斷較為困難。目前絕大多數(shù)癌前病變的診斷主要依靠組織學(xué)檢查。細(xì)針穿刺在過去是一種十分重要的檢查手段，但對癌前病變患者不適用。癌前病變常以多中心性的形式存在，細(xì)針穿刺的陽性率偏低。本研究的主要內(nèi)容是利用TK1抗體來檢測患者血清中TK1的濃度，對比乳腺不典型增生和單純性增生所對應(yīng)的TK1水平，從而研究血清TK1水平與增殖度之間的對應(yīng)關(guān)系，試圖找出能夠提高對乳腺病變惡性進(jìn)程及乳腺惡性腫瘤的早期檢出率的方法。應(yīng)用TK1檢測方法，通過三年的連續(xù)跟蹤，發(fā)現(xiàn)乳腺病變進(jìn)程和TK1水平之間的相關(guān)性，這方面的研究為國外國內(nèi)的首次。

1資料與方法

1.1一般資料對2008至2010年來本院參加體檢的3 442例女性體檢者進(jìn)行乳腺彩超檢查，年齡20～70歲，平均年齡(44±12)歲。并同時進(jìn)行血清TK1檢測，按檢測結(jié)果分為健康組(n=2 237)和乳腺癌前病變組(n=1 205)。

1.2實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備血清TK1檢測使用的試劑盒及化學(xué)發(fā)光設(shè)備來自華瑞同康生物技術(shù)(深圳)有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1血清TK1樣本采集與管理:于清晨空腹抽取靜脈血2 ml，2 h內(nèi)4 000 r/min離心8～10 min，取血清于離心管，按編號分裝于兩個離心管保存于-20℃冰箱(1管用于檢測、另1管用于復(fù)檢)備檢，每管的血清樣本量必須大于200 μl，標(biāo)本收集完成后進(jìn)行TK1值測定。

1.3.2質(zhì)量控制：①檢測控制：按照 “胸苷激酶1細(xì)胞周期分析試劑盒”檢測方法和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。②檢測方法：檢測方法應(yīng)嚴(yán)格按照TK1診斷試劑盒及其配套儀器的說明書的要求操作。取3微升的血清樣品精確點(diǎn)樣到硝酸纖維素膜上，2次重復(fù)點(diǎn)樣。采用不同濃度TK1 (20,6.6,2.2 pmol/L)做標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)樣。 風(fēng)干30 min， 用蒸餾水震搖洗滌3次(5 min/次)。加入用Tris緩沖液(稀釋液)配置的6%脫脂奶粉，室溫封鎖1 h后，除去封鎖試劑，繼續(xù)加入用稀釋液配置的最佳稀釋濃度的TK1抗體，免疫反應(yīng)2 h。反應(yīng)完成以后，用洗滌液(稀釋液加入0.1%吐溫20)迅速漂洗2次，震搖洗滌3次(5 min/3次) 。再加生物素化第2抗體，室溫下震搖反應(yīng)40 min。反應(yīng)完成以后，同上方法洗滌，加入親和素-辣根過氧化物酶室溫振蕩反應(yīng)1 h，同上方法洗滌以后，用ECL發(fā)光試劑精確反應(yīng)1 min，甩干后，該膜密封于薄膜袋，放入CIS-1化學(xué)發(fā)光數(shù)字成像分析儀，測量該樣本的TK1的濃度值。

2結(jié)果

2.1乳腺癌前病變患者和健康人群的血清TK1水平比較2組TK1水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1　乳腺癌前病變患者和健康人群的血清TK1水平比較

注：與健康組比較,*P<0.05

2.2乳腺癌前病變發(fā)生率和TK1水平與年齡之間的關(guān)系將3 442例女性體檢人群按年齡劃分，20～30歲 571例，其中乳腺病變患者 206例，31～40歲1 090例，病變患者468例，41～50歲1 134例，病變患者426例，51～60歲 451例，病變患者94例，61歲以上196例，病變患者11例。乳腺病變患者TK1高值組174例，占病變患者總數(shù)的14.4%。全年齡段乳腺癌前病變發(fā)病率與TK1水平無相關(guān)性(r=0.491,P>0.05)，但30歲后二者有相關(guān)性(r=0.933,P<0.05)。見圖1。

2.3血清TK1水平與不同類型乳腺增殖病變之間的關(guān)系單純性增生組1115例，其TK1平均水平為(1.06±1.91)pmol/L，TK1>2 pmol/L例數(shù)為86例，占7.66%；乳腺癌前病變組90例，其TK1平均水平為(2.42±1.7)pmol/L，TK1>2 pmol/L例數(shù)為34例，占37.78%。2組數(shù)據(jù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。各類不典型增生病例TK1水平及陽性率情況。見表2，圖2。

圖1　TK1陽性率和乳腺發(fā)病率隨年齡變化曲線

分類TK1高值(>2pmol/L)[例(%)]TK1水平(pmol/L,x±s)乳腺癌前病變(n=90)342.42±1.7 重度導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤(n=21)123.59±2.35* 非典型增生(n=69)222.12±1.37*單純性增生(n=1115)861.06±1.91

圖2A．單純性增生組；B.乳腺癌前病變組；C.重度導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤；D.非典型增生

2.4TK1用于區(qū)分乳腺良惡性病變的ROC分析將乳腺良性病變和惡性病變的TK1水平進(jìn)行ROC分析，得到下圖，曲線下面積為0.924，當(dāng)取TK1為 1.4 pmol/L作為閾值時，特異性為89.5%，靈敏度為71.1%。表明選此閾值時，分辨良惡病變具有高的靈敏度和特異性。見圖3。

2.5對90例乳腺癌前病變進(jìn)行6～36個月的跟蹤結(jié)果對經(jīng)超聲和TK1鑒別乳腺病變患者90例，每年進(jìn)行血清TK1和超聲復(fù)查持續(xù)3年。90例乳腺病變中，TK1高值組(TK1>2 pmol/L)為36例；TK1低值組(TK1<2 pmol/L)為54例。跟蹤6～36個月后，病變發(fā)生惡性進(jìn)展的有32例，其中高值組有23例，占本組比例的63.9%(23/36)，低值組有9例，占本組比例為16.7%(9/54)。發(fā)生進(jìn)展的患者初次檢測TK1的平均水平為(2.61±1.01)pmol/L，出現(xiàn)進(jìn)展后復(fù)檢TK1平均水平為(3.55±1.92)pmol/L，2組數(shù)據(jù)對比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0003)；在復(fù)檢中，TK1水平出現(xiàn)升高的有20例，占所有升高人群的62.5%(20/32)；未發(fā)生進(jìn)展人群初次檢測TK1平均水平為(1.71±0.64)pmol/L，跟蹤復(fù)檢TK1平均水平為(1.55±0.97)pmol/L，前后數(shù)據(jù)對比出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的降低(P=0.043)。見圖4、5。

圖3　乳腺良惡病變的ROC曲線

圖4　2組出現(xiàn)惡性進(jìn)展病例情況

圖5　惡性進(jìn)展與TK1水平變化關(guān)系

3討論

胸苷的發(fā)現(xiàn)始于1950年代，19世紀(jì)60年代，胸苷激酶1與胸苷的關(guān)系被揭示，TK1與DNA合成的關(guān)系首次大白于天下， 19世紀(jì)70年代，TK1被首次純化， 80～90年代 TK1的臨床應(yīng)用研究開始，到如今TK1作為一種細(xì)胞動力學(xué)標(biāo)志物得到醫(yī)學(xué)界廣泛應(yīng)用。其在腫瘤預(yù)后及治療監(jiān)控領(lǐng)域的價值在不斷地被接受[9-11]。

陳志恒等[8]總結(jié)了2005至2011年共35 365例健康體檢案例，指出血清TK1是一項(xiàng)適用于評估腫瘤細(xì)胞增殖性的標(biāo)志物，能夠達(dá)到“腫瘤早發(fā)現(xiàn)和早治療”的目的。其中數(shù)據(jù)充分表明了TK1水平高低與增殖類病變的相關(guān)性。涉及案例眾多，但缺乏單一病種病例的深入跟蹤。

本研究在肯定了前者成果的基礎(chǔ)上，對乳腺癌前病變惡性進(jìn)展與血清TK1水平之間的相關(guān)性進(jìn)行了深入的跟蹤研究，此在國內(nèi)外尚屬首次，得到的結(jié)果也頗具代表意義。首先，通過乳腺癌前病變和完全健康患者血清TK1水平的比較，進(jìn)一步驗(yàn)證了TK1對于增殖類病變的獨(dú)特敏感性。其次，在對乳腺不同增殖類型病變進(jìn)行比較時，公認(rèn)的惡性程度較高的病變類別，TK1水平較高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。進(jìn)一步表明血清TK1能夠反映不同增殖惡性程度之間的差別，有助于惡性風(fēng)險的輔助判斷。再次，我們研究了不同年齡段，TK1高值比例與乳腺病變發(fā)病率之間的關(guān)系，相似研究在2008年陳志恒的文章中也有提到[6]，本研究雖然重點(diǎn)分析對象有差異，但結(jié)論相符，對于乳腺病變，TK1水平的升高比病變出現(xiàn)同樣有十年左右的提前，進(jìn)一步驗(yàn)證了，TK1適合進(jìn)行癌癥風(fēng)險的早期風(fēng)險評估。本文還著重討論乳腺癌前病變，兩者變化趨勢在不同年齡組較為溫和，但TK1陽性率整體偏低。分析其原因，可能與癌前病變特征相關(guān)，癌前病變存在異常增殖，但其增殖程度要明顯弱于惡性腫瘤，所以其TK1水平偏低，以原有的惡性增殖閾值2pM作為評估標(biāo)準(zhǔn)，可能會出現(xiàn)偏差。Xu等[12]的結(jié)果表明，TK1水平高低本身是能夠反映不同增殖類病變的惡性程度的，與我們的結(jié)論相同。最后我們對90位乳腺病變患者分2組分別進(jìn)行6～36個月的跟蹤，TK1高值組發(fā)生惡性進(jìn)展所占比例為63.9%，低值組發(fā)生惡性進(jìn)展所占比例為16.7%，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時，惡性進(jìn)展組和未進(jìn)展組比較，惡性進(jìn)展組TK1平均水平為(2.61±1.01)pmol/L，較未進(jìn)展組的(1.71±0.64)pmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時，2組人群在進(jìn)行TK1復(fù)檢時，惡性進(jìn)展組TK1水平出現(xiàn)了顯著性升高，而未進(jìn)展組TK1水平略微降低。在對跟蹤病例進(jìn)行進(jìn)一步分析后，我們發(fā)現(xiàn)，所有惡性進(jìn)程案例中，TK1在跟蹤時水平升高>50%的案例為13例，占所有惡性進(jìn)展案例的40.6%，而未進(jìn)展案例中，TK1水平升高>50%的案例僅為4例，占未進(jìn)展案例的6.9%。因此我們推斷，進(jìn)行癌前病變風(fēng)險評估需參考兩點(diǎn)：一為TK1水平高低，二要同時參考TK1跟蹤過程中的水平變化。此方案的準(zhǔn)確性還有待更多案例進(jìn)行驗(yàn)證，如果可行，對于早期判斷乳腺癌前病變的惡性進(jìn)展的評估具有重要價值。

綜上所述，血清TK1檢查是一種非常靈敏的乳腺癌前病變惡性風(fēng)險評估指標(biāo)，它對于早期乳腺癌的預(yù)防意義將十分重大。

參考文獻(xiàn)

1Topolcan O,Holubec LJr.The role of thymidine kinase in cancer diseases.Expert Opin Med Diagn,2008,2:129-141.

2李春海主編.腫瘤標(biāo)志學(xué)基礎(chǔ)與臨床.第1版.北京:軍事醫(yī)學(xué)出版社,2008.639-644.

3He E,Xu XH,Guan H,et al.Thymidine kinase 1 is a biomarker for tumour prognosis and monitoring cancer therapy.Nucleoside and Nucleic Acid,2009,29:352-358.

4Al-Madhoun A,Tjarks W,Eriksson S.The role of thymidine kinases in the activation of pyrimidine nucleoside analogues. Mini Rev Med Chem,2004,4:341-350.

5Brockenbrough JS, Rasey JS, Grierson JR, et al. A simple quantitative assay for the activity of thymidine kinase 1 in solid tumors. Nucl Med Biol,2007,34:619-623.

6Chen ZH,Zhou H,Lan S,et al.Serological thymidine kinase 1 (STK1) indicates an elevated risk for the development of malignant tumours.Anticancer Research,2008,28:3897-3908.

7Chen ZH,Huang SQ,Wang YD, et al. Serological thymidine kinase 1 is a biomarker for early detection of tumours-a health screening study on 35,365 People, Using a Sensitive Chemiluminescent Dot Blot Assay.Sensors,2011,11:11064-11080.

8陳志恒, 王雅琴, 朱小玲, 等. 血清胸苷激酶1在健康體檢中的應(yīng)用.中華健康管理學(xué)雜志,2011,5:349-352.

9Topolcan O, Holubec L, Svobodova S,et al.The diagnostic and prognostic significance of thymidine kinase in tumor diseases.Clinical Ligand Assay,2006,29:190-193.

10He Q, Fornander T, Johansson H, et al. Thymidine kinase 1 in serum predicts increased risk of distant or loco-regional recurrence following surgery in patients with early breast cancer.Anticancer Res,2006,26:4753-4760.

11Holdenrieder S,Von Pawel JV, Duell T, et al. Clinical relevance of thymidine kinase for the diagnosis, therapy monitoring and prognosis of Non-operable lung cancer.Anticancer Research,2010,30:1855-1862.

12Xu XH, Zhang YM, Shu XH, et al. Serum thymidine kinase 1 reflects the progression of premalignant and malignant tumors during therapy.Molecular Medicine Reports,2008,1:705-711.

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2016.14.002

通訊作者：王瑜,362000福建省泉州市，中國人民解放軍第180醫(yī)院健康管理中心;

【中圖分類號】R 737.9

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1002-7386(2016)14-2089-04

(收稿日期：2016-02-01)

Correlation between thymidine kinase 1 and malignant process of precancerous lesion of breast cancer

JIANGXiaorong,WANGYu,WANGShasha.

HealthManagementCenter,No.180HospitalofPLA,Fujian,Quanzhou362000,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the correlation between thymidine kinase 1 (TK1) and the process of precancerous lesion of breast cancer in order to evaluate the diagnostic accuracy and the utilization value of thymidine kinase 1 in the evaluation of malignant process of precancerous lesion of breast cancer.MethodsThe serum levels of TK1 were detected by using TK1 antibody in 3,442 female subjects, including 1,205 cases of mammary gland lesions (mammary gland lesion group) and 2,237 healthy subjects (control group),moreover, of whom 90 patients with precancerous lesions of breast cancer were followed up for 3 years to investigate the correlation between thymidine kinase 1 and the process of precancerous lesion of breast cancer,furthermore, to evaluate the diagnostic accuracy of thymidine kinase 1 in precancerous lesions of breast cancer.ResultsThere were significant differences in the average levels of TK1 between control group and mammary gland lesion group (P<0.05).Moreover, the incidence of precancerous lesion of breast cancer was not related with patient’s age (P>0.05). The levels of TK1 in patients with severe intraductal papilloma or atypical hyperplasia were significantly higher than those of patients with simple hyperplasia (P<0.05). When TK1 was 1.4pmol/L,the specificity in distinguishing benign lesion from malignant lesion of mammary glands was 89.5%,and sensitivity was 71.1%. After 6～36 months follow-up,in 90 cases of precancerous lesion of breast cancer,the levels of TK1 in patients with precancerous lesion progression in secondary inspection were significantly increased,as compared with those of patients in initial inspection (P<0.05). ConclusionTK1 detection plays an important role in predicting the malignant process risk of precancerous lesions of breast cancer.

【Key words】thymidine kinase 1; breast; precancerous lesions; neoplasms; proliferation

E-mail：wy652@sina.com