徐建中，　王穎妤，　嚴(yán)為留，　張偉國(guó)

江南大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫 214122

?

一株產(chǎn)甲萘醌-7(MK-7)菌的分離鑒定及產(chǎn)物合成條件的初步研究

徐建中，王穎妤，嚴(yán)為留，張偉國(guó)*

江南大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫 214122

摘要：本文從豆豉中分離出了一株高產(chǎn)MK-7的菌株并對(duì)其進(jìn)行了鑒定，同時(shí)對(duì)該菌合成MK-7的條件進(jìn)行了初步研究。在參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，并根據(jù)形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性、并結(jié)合16S rDNA序列分析結(jié)果，該菌屬于解淀粉芽孢桿菌。該菌合成MK-7的最佳條件為：發(fā)酵溫度37 ℃、裝液量為30 mL/250 mL、接種量為2%和搖瓶培養(yǎng)時(shí)間為3 h。研究發(fā)現(xiàn)，菌株Y-2合成的MK-7主要存在于細(xì)胞內(nèi)。以上結(jié)果可為基于菌株Y-2選育高產(chǎn)MK-7菌株和實(shí)現(xiàn)MK-7的產(chǎn)業(yè)化提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：中國(guó)豆豉； 甲萘醌-7； 解淀粉芽孢桿菌； 產(chǎn)物分布

豆豉(Douchi; Lobster sauce)是我國(guó)傳統(tǒng)的大豆發(fā)酵制品，因其營(yíng)養(yǎng)豐富、藥食兼用，而在我國(guó)四川、江蘇、山東等地區(qū)廣泛食用。根據(jù)參與發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)微生物菌群不同，可將豆豉分為霉菌型豆豉和細(xì)菌型豆豉[1]。細(xì)菌型豆豉多是利用枯草芽孢桿菌、豆豉芽孢桿菌、乳酸菌等微生物在較高溫度下作用于蒸熟的大豆，借助微生物蛋白水解酶作用而制成的。豆豉營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，除含有大量人體必須的氨基酸外，還含有多種維生素如維生素K1和維生素K2[2]。

維生素K2，又稱為甲萘醌，是由一個(gè)甲基萘醌母環(huán)和一條位于母環(huán)C-3位置上的異戊二烯側(cè)鏈組成的一類具有醌類結(jié)構(gòu)的脂溶性化合物[3]。根據(jù)側(cè)鏈上異戊二烯單元個(gè)數(shù)不同，甲萘醌共分為14種，以MK-n表示。甲萘醌-7(MK-7)為MK-n中的一員，其側(cè)鏈上含有7個(gè)異戊二烯單元。MK-7具有較長(zhǎng)的半衰期，在血液中很穩(wěn)定，因而是哺乳動(dòng)物產(chǎn)生凝血因子II、VII、IX和X的一個(gè)非常重要的輔因子，對(duì)血液凝固是不可或缺的營(yíng)養(yǎng)素[4, 5]。Kim等[6]指出，MK-7還具有降血壓的作用。此外，MK-7可以抑制成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)，從而刺激成骨細(xì)胞的分化，形成骨頭。有國(guó)外學(xué)者指出，每天補(bǔ)充一定量的MK-7能夠顯著提高老年人骨頭中的礦物質(zhì)密度(BMD)，降低老年人的髖骨骨折風(fēng)險(xiǎn)[7]，而在健康的青春期前期兒童體內(nèi)補(bǔ)充少量的MK-7可以提高體內(nèi)游離的MK-7含量，有利于提高骨鈣蛋白的羧化作用[8]。此外，MK-7能夠協(xié)助調(diào)控Ca2+的利用和促進(jìn)Gla蛋白質(zhì)(Matrix Gla Protein，MGP)的活性，從而防止鈣質(zhì)在血管中沉淀而造成的動(dòng)脈硬化[9]。因此，MK-7是國(guó)際上新興的第三代預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松的保健食品，其安全性已得到美國(guó)FDA、中國(guó)SFDA、美國(guó)藥品研究所及歐洲議會(huì)和歐盟理事會(huì)的權(quán)威認(rèn)定，其功能正在受到越來(lái)越多的關(guān)注。

傳統(tǒng)的MK-7生產(chǎn)方法是直接從發(fā)酵煮熟大豆形成的豆豉或納豆中提取，其菌種主要為能夠產(chǎn)生纖溶酶的芽孢桿菌屬。隨著研究的深入，研究人員發(fā)現(xiàn)纖溶酶產(chǎn)生菌在發(fā)酵過(guò)程中除了合成纖溶酶外，還能合成大量的MK-7等維生素K2[10]。因此，纖溶酶產(chǎn)生菌具有極大的合成MK-7的潛力。Wu等[11]從韓國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品Cheonggukjang中分離到了一株MK-7高產(chǎn)菌BacillusamyloliquefaciensBY01，對(duì)其發(fā)酵條件優(yōu)化后，BY01的MK-7產(chǎn)量達(dá)到了7.54 μg/g，比原產(chǎn)品含量提高了2倍。Berenjian等[12]從商品納豆中也篩選到了一株MK-7高產(chǎn)菌，利用中心復(fù)合設(shè)計(jì)對(duì)其合成MK-7的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化后MK-7產(chǎn)量達(dá)到了62.32 mg/L，是目前有報(bào)道的最高產(chǎn)量。然而，需要指出的是目前利用纖溶酶產(chǎn)生菌發(fā)酵生產(chǎn)MK-7的培養(yǎng)基成本還比較高，且MK-7產(chǎn)量還不高，因此對(duì)MK-7高產(chǎn)菌的選育工作還有待于進(jìn)一步深入。本研究以我國(guó)不同區(qū)域的豆豉為研究材料，分離鑒定出一株具有淀粉水解能力的、高產(chǎn)MK-7的菌株——解淀粉芽孢桿菌Y-2(B.amyloliquefaciensY-2)，并分析了該菌大量合成MK-7的最佳條件以及發(fā)酵過(guò)程中MK-7的分布。研究結(jié)果可為基于菌株Y-2選育高產(chǎn)MK-7菌株和實(shí)現(xiàn)MK-7的產(chǎn)業(yè)化提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

樣品：來(lái)自我國(guó)不同省份和不同生產(chǎn)廠家的10份豆豉樣品的廠家有：T廠家(產(chǎn)地：江蘇)、H廠家(產(chǎn)地：江蘇)、S廠家(產(chǎn)地：四川)、R廠家(產(chǎn)地：重慶)、L廠家(產(chǎn)地：廣東)Q廠家(產(chǎn)地：廣東)D廠家(產(chǎn)地：江西)、J廠家(產(chǎn)地：福建)、Y廠家和W廠家(產(chǎn)地：山東)。

試劑：MK-7標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.8%)購(gòu)于美國(guó)ChromaDex公司；酵母提取物和蛋白胨購(gòu)于英國(guó)Oxiod公司；甲醇、乙腈和二氯甲烷為色譜純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑廠；基因組提取試劑盒和Taq DNA聚合酶購(gòu)于寶生物(大連)生物技術(shù)有限公司；引物合成、DNA 產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)于生工生物(上海)有限公司。

1.2菌株的分離與培養(yǎng)

1.2.1培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

分離基本培養(yǎng)基(g/L)：15 葡萄糖、15 大豆蛋白胨、5 纖維蛋白、1 KH2PO4·12H2O、2.5 K2HPO4·3H2O、2.5 MgSO4·7H2O、0.5游霉素和15瓊脂，pH 7.0～7.2。種子培養(yǎng)基(g/L)：15 葡萄糖、15 蛋白胨、1 KH2PO4、2.5 K2HPO4·3H2O、2.5 MgSO4·7H2O，pH 7.0～7.2。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：1 L 玉米粉液化液、41.52 豆粕粉，16.31 大豆蛋白胨、15.51 酵母膏、0.13 K2HPO4·3H2O、3.11 NaCl，pH 7.0～7.2。分離培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基在0.1MPa下高壓滅菌20 min，而發(fā)酵培養(yǎng)基在0.07 MPa下高壓滅菌20 min。菌體培養(yǎng)溫度為(37±1) ℃，培養(yǎng)時(shí)間為8～12 h。非特殊說(shuō)明，在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的種子液按2%(v/v)接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，并以100 r/min在往復(fù)式搖床上培養(yǎng)24 h。

1.2.2操作方法

取0.5 g樣品于含有少量玻璃珠的10 mL無(wú)菌生理鹽水中，80 ℃水浴震蕩10 min。取100 μL懸浮液，用適量無(wú)菌生理鹽水稀釋，取200 μL稀釋液涂布于初篩平板上，37 ℃培養(yǎng)12 h，從中挑選出能產(chǎn)生透明溶解圈的菌落并通過(guò)平板分離和劃線獲得單菌落。挑選產(chǎn)生透明溶解圈大的菌落轉(zhuǎn)接到MK-7發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，8 000 r/min離心去菌體，采用薄層層析法(TLC)測(cè)定各菌落合成MK-7的能力，最終篩選出高產(chǎn)MK-7的菌株。

1.3菌株鑒定

對(duì)分離到的高產(chǎn)MK-7菌株參考《常見細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[13]和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[14]進(jìn)行形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定。16S rDNA鑒定時(shí)采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取菌株Y-2的全基因組并為PCR反應(yīng)模板，以細(xì)菌16S rDNA通用引物(F: 5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；R: 5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’)為引物，利用ExTaq DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR 反應(yīng)條件為: 95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，72 ℃ 終延伸10 min，整個(gè)程序循環(huán)30次。PCR產(chǎn)物純化后送交生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果通過(guò)在線分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，與GenBank中的16S rDNA序列進(jìn)行同源性分析并采用軟件MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4纖溶酶活的測(cè)定方法

纖溶酶活的測(cè)定采用標(biāo)準(zhǔn)纖維蛋白平板法[15]。每次點(diǎn)樣20 μL，37 ℃培養(yǎng)12 h后測(cè)定透明圈的直徑，再和尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，得出與尿激酶酶活單位(IU/mL)相對(duì)應(yīng)的豆豉纖溶酶的酶活。纖溶酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：將稀釋的尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品(20 IU/mL、40 IU/mL、60 IU/mL、80 IU/mL、100 IU/mL和120 IU/mL)各20 μL，點(diǎn)樣于標(biāo)準(zhǔn)纖維蛋白平板，37 ℃保溫12 h，測(cè)定透明圈的面積，以溶圈直徑乘積對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，濃度對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5MK-7的提取與檢測(cè)方法

1.5.1樣品中MK-7的提取方法

MK-7的提取參照Berenjian等[12]和嚴(yán)為留等[16]建立的方法進(jìn)行，萃取劑選用2︰1(v/v)的正己烷/異丙醇。發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液經(jīng)常溫下5 000 r/min條件下離心5 min，收集上清液和菌體。在萃取上清液時(shí)，按上清液/萃取液為41(v/v)加入萃取液，漩渦振蕩10 min，然后5 000 r/min離心5 min后回收有機(jī)相。在對(duì)菌體萃取時(shí)，按菌體量/萃取液為4︰1(w/v)加入萃取液，其他步驟與萃取上清液時(shí)相同。隨后，將獲得的有機(jī)相溶液于40 ℃減壓旋轉(zhuǎn)濃縮，完成MK-7的提取。在整個(gè)提取過(guò)程中盡量避光，同時(shí)增加萃取次數(shù)以提高提取效率。

1.5.2樣品中MK-7的檢測(cè)

利用TLC方法檢測(cè)MK-7時(shí)，參照Morishita等[17]建立的方法進(jìn)行，其中硅膠板選用60GF254型號(hào)，展開劑為己烷-乙醚(85︰15；v/v)。層析結(jié)束后，利用UV分光光度計(jì)在254 nm下檢測(cè)MK-7含量。利用高效液相色譜法(HLPC)檢測(cè)MK-7參照嚴(yán)為留等[16]建立的方法，MK-7濃縮液溶解后采用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，然后進(jìn)行HLPC分析。液相色譜條件及進(jìn)樣量參照嚴(yán)為留等[16]設(shè)定的參數(shù)。

2結(jié)果與討論

2.1高產(chǎn)MK-7菌株的篩選

根據(jù)纖維蛋白-瓊脂平板上所形成的透明圈的大小，挑取6株形成大透明圈的菌株，分別命名為T-26、S-33、R-5、Q-11、Y-2和W-21。經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)纖維蛋白平板測(cè)定，它們的纖溶酶活在1 400～1 500 IU/mL之間(表1)。由于納豆和豆豉來(lái)源的纖溶酶產(chǎn)生菌在發(fā)酵過(guò)程中主要合成MK-7，因此本文對(duì)6株纖溶酶高產(chǎn)菌在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)MK-7的能力進(jìn)行了考察。從表1中可以看出，菌株Y-2的MK-7產(chǎn)量最高，而菌株W-21幾乎檢測(cè)不出MK-7。因此，本文選擇菌株Y-2作為后期高產(chǎn)MK-7菌株的研究。

表1　各菌株的纖溶酶活和MK-7產(chǎn)量

2.2菌株的鑒定

2.2.1菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

高產(chǎn)MK-7的菌株Y-2在LBG平板形成的單菌落為深白色，不規(guī)則圓形，中央突起(圖1A)。在培養(yǎng)前期，菌落呈半透明狀，菌體粘稠度低；培養(yǎng)12 h后，菌落顏色逐漸發(fā)白，粘稠度增加；培養(yǎng)48 h，菌落直徑可達(dá)到1 cm以上，菌落表面褶皺、變硬，中央不規(guī)則突起，邊緣不光滑；繼續(xù)培養(yǎng)，菌落的飽滿度會(huì)下降，菌體貼在平板表面，不再生長(zhǎng)。芽孢染色結(jié)果如圖1B所示，視野中的菌體個(gè)體微小，長(zhǎng)約3～5 μm，寬0.6～0.9 μm，其中有芽孢的短桿菌占多數(shù)，芽孢中生或次中生，呈球形或橢圓形，不明顯膨大，多為兩端均勻染色。

2.2.2菌株的生理生化鑒定

將菌株Y-2進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)時(shí)，菌液呈現(xiàn)獨(dú)特的臭雞蛋味；搖瓶靜止培養(yǎng)時(shí)，菌體均富集在液體表面生長(zhǎng)，表明其均為好氧菌。進(jìn)一步的生理生化鑒定結(jié)果見表2，從表中可以看出，菌株Y-2能夠利用葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖和甘露糖，但是不能利用乳糖和半乳糖；同時(shí)菌株Y-2在生長(zhǎng)過(guò)程中也表現(xiàn)出了較強(qiáng)的水解淀粉、明膠和酪蛋白的能力。

2.2.316S rDNA鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得菌株Y-2的16S rDNA序列，所測(cè)得到的序列長(zhǎng)度為1 516 bp。將所測(cè)序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果表明菌株Y-2與解淀粉芽孢桿菌有著最高的序列相似度(99%；圖2)，與芽孢桿菌屬其他種的芽孢桿菌也有較高的相似度，結(jié)合菌落形態(tài)，因此初步判斷菌株Y-2屬于解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)。

圖1　Y-2的菌落形態(tài)(A)和芽孢染色效果圖(B)

實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)結(jié)果菌株Y-2菌株168實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)結(jié)果菌株Y-2菌株168革蘭氏染色++V.P.反應(yīng)++M.R.試驗(yàn)++7%NaCl生長(zhǎng)++葡萄糖++甘露糖+-阿拉伯糖+-乳糖、半乳糖-+淀粉水解++酪素水解++硝酸鹽還原++明膠水解+-石蕊牛奶還原試驗(yàn)++厭氧生長(zhǎng)試驗(yàn)--硫化氫產(chǎn)生試驗(yàn)--產(chǎn)生吲哚試驗(yàn)--接觸酶++氧化酶++

注：“+”為陽(yáng)性反應(yīng)，“-”為陰性反應(yīng)

2.3產(chǎn)MK-7條件的研究

2.3.1最佳培養(yǎng)溫度和裝液量

不同的培養(yǎng)溫度和溶氧量對(duì)菌體生長(zhǎng)和目的產(chǎn)物的合成都具有重要影響作用，因此本文考察了不同溫度和裝液量對(duì)B.amyloliquefaciensY-2產(chǎn)MK-7的影響，其結(jié)果見圖3。

從圖3A中可以看出，37 ℃是合成MK-7的最適溫度，而這個(gè)溫度同時(shí)也是菌體生長(zhǎng)和合成納豆激酶的最適宜溫度。前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)[3]，菌株Y-2在靜置培養(yǎng)條件下能夠合成更多的MK-7，而隨著轉(zhuǎn)速的提高，MK-7的產(chǎn)量大幅下降。然而，菌株Y-2又是好氧菌，因此菌體在培養(yǎng)的過(guò)程中都是富集在液體表面生長(zhǎng)，搖瓶中過(guò)高的裝液量反而導(dǎo)致菌體無(wú)法充分利用培養(yǎng)基組分而造成MK-7產(chǎn)量降低。因此，本文考察了裝液量對(duì)MK-7合成的影響，從圖3B中可以看出，30 mL/250 mL三角瓶則是一個(gè)比較適宜的搖瓶裝液量水平，而隨著裝液量的增加MK-7產(chǎn)量急速下降。因此，今后若是要工業(yè)放大，則可能需要參考淺盤發(fā)酵的培養(yǎng)工藝。

圖2　菌株Y-2基于16S rDNA構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3　溫度(A)和裝液量(B)對(duì)MK-7產(chǎn)量的影響

2.3.2接種量和搖培時(shí)間的優(yōu)化

將菌株Y-2的種子液分別按1%、2%、3%、4%和5%(v/v)的比例接種，考察不同接種量對(duì)MK-7產(chǎn)量的影響。從圖4A中可以看出，在2%的接種量下，MK-7的產(chǎn)量最高，而隨著接種量增大，MK-7產(chǎn)量反而降低，因此確定最佳的接種量為2%。此外，考慮到接種后直接靜置培養(yǎng)不利于獲得較高的菌體量，也不利于MK-7的合成，因此對(duì)接種后的搖瓶培養(yǎng)時(shí)間(即搖培時(shí)間)進(jìn)行優(yōu)化也非常有必要。本文考察了接種后分別搖瓶培養(yǎng)0 h、1 h、2 h、3 h和4 h對(duì)MK-7產(chǎn)量的影響，其結(jié)果如圖4B所示。從圖4B中可以看出，搖培3 h最有利于MK-7的合成，這可能是由于此時(shí)的菌體正處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體活力最為旺盛，因此確定接種后的搖培時(shí)間為3 h。

2.3.3MK-7的分布

Yanagisawa和Sumi[18]等研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液中存在大量的水溶性MK-7，并指出這是由于一部分MK-7與胞內(nèi)某些蛋白質(zhì)形成了復(fù)合物，并在培養(yǎng)過(guò)程中被釋放到培養(yǎng)基內(nèi)變成“水溶性”MK-7。為了弄清楚MK-7的分布情況，本文分別測(cè)定了發(fā)酵過(guò)程中菌體和發(fā)酵液這兩部分中的MK-7含量，其結(jié)果見圖5。

圖4　接種量(A)和搖培時(shí)間(B)對(duì)MK-7產(chǎn)量的影響

圖5　MK-7的分布情況

然而，與Yanagisawa和Sumi[18]的研究結(jié)果不同，本研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中確實(shí)存在部分MK-7，但含量只是菌體中的1/4～1/3(圖5)。需要指出的是，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，胞外MK-7含量逐漸增加，這一結(jié)果與Wu等[11]的研究結(jié)果基本一致。特別是到了第6 d，發(fā)酵液中MK-7的量出現(xiàn)了較大幅度的增長(zhǎng)，幾乎是第5 d的兩倍，這可能是因?yàn)榈搅说? d，菌體進(jìn)入衰亡期，部分菌體開始裂解，導(dǎo)致胞內(nèi)的那部分MK-7被釋放到了胞外?？紤]到液液萃取的效率和提取成本，在今后的工業(yè)化生產(chǎn)中可以進(jìn)一步縮短發(fā)酵周期，在菌體生長(zhǎng)到穩(wěn)定期即可終止發(fā)酵，并且在提取操作時(shí)只針對(duì)菌體中的那部分進(jìn)行提取，這樣可以大大減少萃取液中雜質(zhì)的含量，降低純化成本，提高生產(chǎn)效率。

3結(jié)論

本文從中國(guó)豆豉中分離出了一株具有高纖溶酶活和MK-7的菌株，經(jīng)菌體形態(tài)、生理生化特征和16S rDNA分析，鑒定為解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciensY-2)。隨后對(duì)該菌株合成MK-7進(jìn)行了初步研究發(fā)現(xiàn)，該菌合成MK-7的最佳條件為：發(fā)酵溫度為37 ℃、裝液量為30 mL/250 mL、接種量為2%和搖培時(shí)間為3 h。此外，研究結(jié)果還指出，B.amyloliquefaciensY-2合成的MK-7主要存在于細(xì)胞內(nèi)。以上結(jié)果可為基于菌株Y-2選育高產(chǎn)MK-7菌株和實(shí)現(xiàn)MK-7的產(chǎn)業(yè)化提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]蔣立文. 發(fā)酵豆豉的研究進(jìn)展. 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào), 2013, 4(6): 1803-1809.

[2]林榕珊. 細(xì)菌型豆豉發(fā)酵機(jī)理及功能性研究. [博士學(xué)位論文]. 濟(jì)南: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012.

[3]嚴(yán)為留, 張偉國(guó), 錢和. 響應(yīng)面法優(yōu)化維生素K2 (MK-7)發(fā)酵條件. 工業(yè)微生物, 2015, 45(3):14-23.

[4]Matschiner JT, Doisy EA Jr. Bioassay of vitamin K in chicks. J Nutr, 1966, 90(1): 97-100.

[5]Akiyama Y, Hara K, Matsumoto A. Comparison of intestinal absorption of vitamin K2(menaquinone) homologues and their effects on blood coagulation in rats with hypoprothrombinaemia. Biochem Phamacol, 1995, 149(12): 1801-1807.

[6]Kim YK, Kim SM, Kim JY,etal. The culture filtrates fromBacillussubtilisnattolowers blood pressure via rennin-angiotersin system in spontaneously hypertensive rats fed with a high-cholesterol diet. J Korean Soc Appl Biol Chem, 2011, 54(6): 959-965.

[7]Forli L, Bollerslev J, Simonsen S,etal. Dietary vitamin K2supplement improves bone status after lung and heart transplantation. Transplantation, 2010, 89(4): 458-464.

[8]vanSummeren MJH, Braam LAJLM, Lilien MR,etal. The effect of menaquinone-7 (vitamin K2) supplementation on osteocalcin carboxylation in healthy prepubertal children. British J Nutr, 2009, 102(8): 1171-1178.

[9]Kresimir P, Henrik R, Tom P. Safety and toxicological evaluation of a synthetic vitamin K2, menaquinone-7. Toxicol Mech Methods, 2011, 21(7): 520-532.

[10]Armougom F, Bittar F, Strember N,etal. Microbial diversity in the sputum of a cystic fibrosis patient studied with 16S rDNA pyrosequencing. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2009, 28(9): 1151-1154.

[11]Wu WJ, Ahn BY. Isolation and identification ofBacillusamyloliquefaciensBY01 with high productivity of menaquinone forcheonggukjangproduction. J Korean Soc Appl Biol Chem, 2011, 54(5): 783-789.

[12]Berenjian A, Mahanama R, Talbot A,etal. Efficient media for high menaquinone-7 production: response surface methodology approach. New Biotechnol, 2011, 28: 665-672.

[13]東秀珠, 蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè). 第一版. 北京: 科學(xué)出版社, 2001.94-95.

[14]Garrity GM, Bell JA, Liburn TG. Bergey’s manual of systematic bacteriology, second edition. 第二版. 北京: 科學(xué)出版社, 2004. 453-454.

[15]Tage A, Sten M. The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity. Arch BiochemBiophys, 1952, 40(2): 346-351.

[16]嚴(yán)為留, 張偉國(guó), 錢和等. 納豆芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)MK-7的產(chǎn)物提取與檢測(cè). 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2013, 32(8): 891-895.

[17]Morishita T, Tamura N, Makino T,etal. Production of menaquinones by lactic acid bacteria. J Dairy Sci, 1999, 82: 1897-1903.

[18]Yanagisawa Y, Sumi H. Natto Bacillus contains a large amount of water-soluble vitamin K (menaquinone-7). J Food Biochem, 2005, 29(3): 267-277.

doi:10.3969 /j.issn.1001-6678.2016.03.001

基金項(xiàng)目：江蘇省自然科學(xué)基金-青年基金項(xiàng)目(編號(hào)：BK20150149)。

作者簡(jiǎn)介：徐建中(1984～)，男，博士，講師。E-mail：xujz126@126.com。

*通訊作者:張偉國(guó)(1963～)，男，博士，教授。

Identification and analysis of a menaquinone-7 (MK-7) producing strain

XU Jian-zhong， WANG Ying-yu， YAN Wei-liu， ZHANG Wei-guo

The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China

AbstractA high MK-7 producing strain was isolated from Chinese douchi. Moreover, the MK-7 synthesis conditions were investigated. The strain was classified into Bacillus amyloliquefaciens according to its morphology, physiological and biochemical features and 16S rDNA sequence. The results showed that the best MK-7 synthesis conditions of this strain were as follows: fermentation temperature 37 ℃, loading volume 30 mL/250 mL, inoculum size 2% and shaking culture time 3 h. In addition, MK-7 was mainly distributed in intracellular. The above-mentioned results provided a theoretical basis for constructing high MK-7 producing strains based on strain Y-2 and promoting MK-7 industrialization progress.

Key wordsChinese douche; menaquinone-7; Bacillus amyloliquefaciens; product distribution